本发明涉及一种黑木耳多糖的提取方法，特别涉及一种采用仿生法联合酶解法提取黑木耳多糖的方法。本发明属于植物活性成分提取
技术领域：
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背景技术：
：黑木耳是一种药食同源类食用菌，黑木耳多糖是黑木耳子实体中分离纯化得到的一种高分子β葡聚糖，是其主要功效成分之一。黑木耳多糖具有益气强身、补气血、润肺、止血、止痛、通便等功效。现在药理研究表明黑木耳多糖是一种非特异的免疫调节剂，能够激活人体免疫T细胞，B细胞，增强机体免疫细胞，具有提高免疫力、抗衰老、防治心血管疾病等多种功效；与其他食药用菌相比，黑木耳子实体具有分布范围广，人工栽培技术成熟且产量较高的优势；目前，黑木耳多糖已被开发成多种保健食品和药品，如黑木耳茶，黑木耳脆片，黑木耳饮料及木耳多糖胶囊等。仿生学提取技术模仿了口服药物在人体胃肠道的转运过程，采用活性指导下的导向分离技术，来获取高活性的生物分子；酶解可以有效地破坏真菌子实体细胞壁，将有效成分更好地释放，降低了提取条件，提高了提取率，将酶解法和半仿生提取结合起来对真菌多糖进行提取，综合二者的优点，绿色环保、提取条件温和、提取率高、保证多糖结构与活性完整性且工艺过程耗时短，降低了提取成本，为工业化生产的进一步开发提供了技术支持。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种采用仿生法联合酶解法提取黑木耳多糖的方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明的仿生法联合酶解法制备黑木耳多糖的工艺流程图如图1所示。具体的，本发明的一种采用仿生法联合酶解法提取黑木耳多糖的方法，按照以下步骤进行：(1)黑木耳的前处理：清洗黑木耳原料，去除表面杂质，放到恒温干燥箱中烘干至恒重，粉碎，过60～80目筛，备用；(2)酶解：将粉碎至60～80目的黑木耳干粉，按照料液体积比为1:30～1:80加入水进行浸泡，浸泡3-5小时后，按照黑木耳干粉重量的10％～20％加入复合纤维素酶进行酶解，酶解温度为30～60℃，酶解时间为90～150min，灭酶温度100℃，得到黑木耳酶解液；(3)仿生化提取：将上述酶解液先用盐酸溶液调节pH为2.0，温度控制在35～60℃，提取60～150min，然后再用氢氧化钠溶液调节pH为8.0，温度控制在35～60℃，提取60～150min，过滤，得到滤液；(4)浓缩：将步骤(3)得到的滤液进行浓缩，收集浓缩液，去除残渣物，得到仿生化浓缩液；(5)醇沉：将步骤(4)得到的浓缩液与95％(w/w)乙醇按体积比1:4的比例混合，混合均匀后低温保存静止过夜，以10000r/min离心15min，收集沉淀；(6)冷冻干燥：将步骤(5)得到的沉淀物进行冷冻干燥，即为黑木耳粗多糖。在本发明所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的黑木耳是通过以下方法培养得到：(1)培养基制备：将85～90重量份的阔叶树木屑，10～12重量份的麦麸，1～2重量份的石膏粉，1～2重量份的豆饼以及1～2重量份的白灰用水混匀，调pH值为7～8，含水量保持在60～65％，得到用于栽培野生黑木耳的培养基；(2)培养基装袋灭菌：将步骤(1)制备得到的培养基装入聚丙烯袋，每袋1～1.5kg，100℃蒸汽灭菌8小时；(3)接种：经过灭菌的袋料，料温降到30℃以下时，移到接种室或接种箱内接种黑木耳菌种；(4)菌丝培养：接种后的栽袋置于温度为20～25℃，室内湿度为45％-～55％，避光的条件下进行培养，待菌丝白、粗、健壮为宜，培养时间为12～15天，之后调节室温为15～20℃，适当通风、光照，以使菌丝体慢慢适应外界环境，待菌丝进入成熟阶段，调节室温为10-15℃，湿度75％～85％、通风、光照与外界环境相同，培养期控制在55～65天；(5)割口：每个栽袋割10-22个V型割口，深0.5cm，长度在1.5～2.5cm；(6)移栽：选择光透射率为30％～40％，湿度为75％～90％，通风良好，地面无积水且覆盖有树木木屑的阔叶林，将成熟期的菌体移到阔叶林中，摆地生长；(7)出耳管理:出耳湿度控制在90％～95％，温度、通风、阳光与阔叶林条件一致；(8)采耳：当耳片充分展开，边缘起皱变薄变软，色泽转淡，耳根收缩，腹面未有白色粉状物(孢子粉)时，及时采收。其中，优选的，步骤(1)中所述的培养基的制备是将85重量份的阔叶树木屑，12重量份的麦麸，0.5重量份的石膏粉，2重量份的豆饼以及0.5重量份的白灰，用水混匀，调pH值为7.5，控制含水量为65％。其中，优选的，步骤(1)中所述的阔叶树木屑来自东北林区的阔叶树木屑。其中，优选的，步骤(2)中所述的聚丙烯袋的尺寸为17cm×33cm。其中，优选的，步骤(6)中所述的移栽的月份为每年的8月份。本发明通过模拟野生黑木耳生长所需的生态条件来满足黑木耳生长发育过程中对温度、湿度、阳光、空气等的要求，使黑木耳耳形、口感、厚度、色泽都接近东北野生态黑木耳，性状稳定、抗性强，品质优于其他品种，而且利用该方法栽培得到的黑木耳中黑木耳多糖的含量更高。在本发明所述的方法中，优选的，步骤(2)所述的酶解是将粉碎至60～80目的黑木耳干粉，按照料液体积比为1:50加入水进行浸泡，浸泡4小时后，按照黑木耳干粉重量的15％加入复合纤维素酶进行酶解，酶解温度为45℃，酶解时间为120min，灭酶温度100℃，得到黑木耳酶解液。在本发明所述的方法中，优选的，步骤(3)所述的仿生化提取是将上述酶解液先用盐酸溶液调节pH为2.0，温度控制在45℃，提取120min，然后再用氢氧化钠溶液节pH为8.0，温度控制在45℃，提取120min，过滤，得到滤液。在本发明所述的方法中，优选的，步骤(4)所述的浓缩是指将滤液置于50℃下浓缩60min。相较于现有技术，本发明的有益效果在于，本发明方法操作步骤简单，工艺提取条件温和，模拟人体消化机理，最大限度的提取了黑木耳中的有效多糖，同时也有利于提高黑木耳多糖提取率，保留活性多糖完整结构。本发明的提出为黑木耳多糖的提取提供了一种有效的技术手段。该方法对黑木耳多糖提取率可达30～40％。附图说明图1为本发明的仿生化联合酶解制备黑木耳多糖的工艺流程图。具体实施方式以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所述描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。实施例1：黑木耳的仿野生化栽培方法(1)培养基制备：将85重量份的阔叶树木屑，12重量份的麦麸，0.5重量份的石膏粉，2重量份的豆饼以及0.5重量份的白灰，用水混匀，调pH值为7.5，控制含水量为65％，得到用于栽培野生黑木耳的培养基；(2)培养基装袋灭菌：将步骤(1)制备得到的培养基装入17cm×33cm的聚丙烯袋，每袋1kg，蒸汽灭菌100℃，灭菌8小时；(3)接种：经过灭菌的袋料，料温降到30℃以下时，移到接种室或接种箱内开始接种；(4)菌丝培养：接种后的栽袋置于温度25℃，室内湿度50％，避光的条件下进行培养，待菌丝白、粗、健壮为宜，培养时间为14天，之后调节室温为20℃，适当通风、光照，以使菌丝体慢慢适应外界环境，待菌丝进入成熟阶段，调节室温为15℃，湿度为80％、通风、光照与外界环境相同，培养期60天；(5)割口：每个栽袋割15个V型割口，深0.5cm，长度在2cm左右；(6)移栽：选择光透射率为30％～40％，湿度为75％～90％，通风良好，地面无积水且覆盖有树木木屑的阔叶林，将成熟期的菌体移到阔叶林中，摆地生长；移栽的月份为8月份；(7)出耳管理:出耳湿度控制在90％～95％，温度、通风、阳光与阔叶林条件一致；(8)采耳：当耳片充分展开，边缘起皱变薄变软，色泽转淡，耳根收缩，腹面未有白色粉状物(孢子粉)时，及时采收。为了进一步说明本发明的仿野生化栽培方法与传统方法(人工黑木耳袋栽培、人工黑木耳木段栽培方法)的优势，本发明同时采用三种方法进行了黑木耳的栽培试验，并对黑木耳的产量与性状进行了数据分析，结果如下表1所示：表1三种方法种植黑木耳的产量与性状比较从上表中分析出，实施本发明仿野生黑木耳栽培与人工黑木耳袋栽培、人工黑木耳木段栽培相比，本发明黑木耳产量明显高于木段栽培，而且口感与外形接近野生黑木耳。采用本发明仿野生化方法栽培黑木耳，产量高、品质好、适合东北野生木耳的栽培。实施例2黑木耳多糖的提取(1)黑木耳原料的前处理：清洗实施例1栽培得到的黑木耳原料，去除表面杂质，放到30℃恒温干燥箱中烘干至恒重，原料粉碎后过60目筛，备用；(2)酶解：将粉碎至60目的黑木耳干粉，按照料液体积比为1:50加入水进行浸泡，浸泡4小时后，按照黑木耳干粉重量的15％加入复合纤维素酶(购自诺维信(中国)生物技术有限公司)进行酶解，酶解温度为45℃，酶解时间为120min，灭酶温度100℃，得到黑木耳酶解液；(3)仿生化提取：将上述酶解液先用盐酸溶液调节pH为2.0，温度控制在45℃，提取120min，然后再用氢氧化钠溶液调节pH为8.0，温度控制在45℃，提取120min，过滤，得到滤液；(6)浓缩：将步骤(3)得到的滤液置于50℃下浓缩60min，收集浓缩液，去除残渣物，得到仿生化浓缩液；(7)醇沉：将上述浓缩液与95％(w/w)乙醇按体积比1:4的比例进行混合，混合均匀后低温保存静止过夜，以10000r/min离心15min，收集沉淀。(8)冷冻干燥：将上述沉淀物进行冷冻干燥，得到黑木耳粗多糖。实施例3本实施例与实施例2不同的是：步骤(2)中按照黑木耳干粉重量的10％加入复合纤维素酶。其他步骤与实施例2相同。实施例4本实施例与实施例2不同的是：步骤(2)中按照料液体积比为1:60加入水进行浸泡。其他步骤与实施例2相同。实施例5本实施例与实施例2不同的是：步骤(2)中的酶解温度为60℃。其他步骤与实施例2相同。实施例6本实施例与实施例2不同的是：步骤(2)中的酶解时间150min。其他步骤与实施例2相同。对比试验例为了进一步说明本发明的仿生法联合酶解法提取黑木耳多糖的方法(按照实施例2所述方法进行)与单一方法(单一酶解法提取、单一仿生化提取)的优势，本发明同时采用三种方法进行了黑木耳多糖的提取，并对黑木耳多糖的得率与含量进行了数据分析，结果如下表2所示：表2采用不同方法提取得到的黑木耳多糖的得率与含量序号123工艺技术单一酶解法提取单一仿生化提取本发明的仿生法联合酶解法提取率％9～14％11～16％14～24％多糖含量％10～16％25～29％34～40％从上表2中可以看出，相较于采用单一酶解与单一仿生化的方法提取黑木耳多糖的含量，采用本发明的仿生法联合酶解法的方法提取得到黑木耳多糖含量将近高出一倍。将两者技术联合，实施本发明方法的提取率明显高于单一的两种方法，而且多糖得率高出单一仿生化提取工艺的10％左右。说明本发明方法分离效率高，且提取的黑木耳多糖活性高、纯度大。以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3