新的对抗寨卡病毒的疫苗和用于对抗寨卡病毒的DNA抗体构建体的组合的制作方法

本申请享有于2016年9月19日提交的第62/396,750号美国临时申请和2016年11月3日提交的第62/417,093号美国临时申请的优先权，上述每个临时申请均通过引用整体并入本文。

本发明涉及编码寨卡(zika)病毒抗原的抗体及其功能片段的重组核酸序列。本发明还涉及寨卡疫苗与组合物的组合，所述组合物包含用于在体内产生一种或多种合成抗体及其功能片段的重组核酸序列。本发明的组合物提供了用于诱导免疫应答，以及用于预防性和/或治疗性地使个体对寨卡病毒免疫的改进方法。

背景技术：

寨卡病(zikadisease)是由寨卡病毒感染引起的，可以通过被感染的蚊子叮咬传播给人类或在人类之间进行性传播。寨卡病毒感染与严重的出生缺陷有关。目前，批准了治疗性抗体用于治疗多种疾病。不幸的是，纯化抗体的制造和运输成本过高。此外，抗体疗法必须每周至每月重新施用-这是确保有效治疗以预防或降低患者发展寨卡病的风险的一个具有挑战性的因素。

因此，本领域需要预防和/或治疗寨卡感染的改进疗法。本发明满足这种需求。

技术实现要素：

本发明的一个方面提供了一种组合物，其包含编码寨卡病毒抗原的抗体及其功能片段的重组核酸序列。

本发明的一个方面提供了在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答的组合物与包含编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列的组合物的组合。可以将所述组合物施用给有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码抗zikv-包膜(抗zikve)蛋白抗体的核苷酸序列。

本发明的一个方面提供了能够表达在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答的多肽的核酸构建体。所述核酸构建体由编码核苷酸序列和与编码核苷酸序列可操作连接的启动子组成。所述编码核苷酸序列表达多肽，其中所述多肽包括共有寨卡抗原，包括前体膜-包膜(prm+env或prme)。所述启动子调节哺乳动物中所述多肽的表达。

本发明的另一方面提供了能够在哺乳动物中产生针对寨卡病毒的免疫应答的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸分子包含能够在哺乳动物中表达共有寨卡抗原的核酸序列和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，所述核酸分子包含与编码共有寨卡抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一个实施方案中，共有寨卡抗原由共有prme组成。

本发明的另一方面提供了在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答的方法，其包括向哺乳动物的组织递送核酸分子，所述核酸分子包含能够在哺乳动物细胞中表达寨卡病毒的共有抗原以在哺乳动物中引发免疫应答的核酸序列，并且对所述组织的细胞进行电穿孔以允许所述核酸分子进入细胞内。

本发明涉及编码一种或多种合成抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自下组的至少一种：a)编码抗zikv包膜(e)蛋白合成抗体的核苷酸序列；和b)编码抗zikv包膜(e)合成抗体的片段的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码切割结构域的核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码抗zikve抗体的可变重链区和可变轻链区中的一个或多个的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码与seqidno:1,seqidno:2,seqidno:3,seqidno:4,seqidno:5,seqidno:6,seqidno:7,seqidno:8,seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11,seqidno:12,seqidno:13,seqidno:14,seqidno:15,seqidno:16,seqidno:17,seqidno:18,seqidno:21和seqidno:22中的一个或多个至少90％同源的一个或多个序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码抗zikve抗体的可变重链区和可变轻链区的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码与seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:21和seqidno:22中的一个或多个至少90％同源的一个或多个序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：可变重链区；ires元件；和可变轻链区。在一个实施方案中，所述ires元件是病毒ires或真核ires之一。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含：

a)在核酸序列的整个长度上与编码选自下组的序列的核酸序列具有至少约95％同一性的核苷酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:21和seqidno:22；

在一个实施方案中，所述核苷酸序列编码前导序列。在一个实施方案中，所述核酸分子包含表达载体。

本发明还提供了包含本文所述的任何核酸分子的组合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及预防或治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本文所述的核酸分子或组合物。

在一个实施方案中，所述疾病是寨卡病毒感染。

在一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用抗生素药剂。在一个实施方案中，在施用所述核酸分子或组合物后不到10天施用抗生素。

在一个实施方案中，所述方法还包括向受试者施用抗生素药剂。在一个实施方案中，在施用所述核酸分子或组合物后不到10天施用抗生素。

附图说明

图1描绘了zikv-e蛋白的结构。

图2描绘了寨卡dmab开发和表征的工作流程。

图3描绘了zikv-env特异性单克隆抗体的结合elisa。

图4描绘了zvenv和zvmab的蛋白质印迹(westernblot)。装载2μg的rzv包膜蛋白；对zv单克隆抗体使用1:250稀释。

图5描绘了zikamabvh和vl比对。

图6描绘了zikamabvh和vl比对以及同一性和rmsd矩阵。

图7描绘了mab模型叠加。

图8描绘了模型cdr区的比较

图9描绘了mab1c2a6、8d10f4和8a9f9vh和vl比对。

图10描绘了1c2a6fv的模型。

图11描绘了8d10f4、1c2a6、8a9f9、3f12e9和1d4g7的fv生物物理特征的概述。

图12显示了寨卡病毒颗粒、寨卡rna基因组及其翻译基因的图解。

图13显示了寨卡疫苗的质粒图谱，示出了编码寨卡抗原的插入片段(表达盒)的定位位点。

图14显示了示出各种寨卡抗原设计的线性结构的图。

图15显示了寨卡抗原-前导序列+prme的有注释的氨基酸序列。

图16和17显示了各种寨卡病毒株之间的遗传关系：图16示出了分离株之间的遗传距离，图17显示了遗传树。

图18显示了寨卡疫苗的质粒图谱，示出了编码寨卡-prm+env的插入片段(表达盒)的定位位点。

图19显示了凝胶电泳图像，其示出了表达盒的存在。

图20a和20b显示了示出寨卡-包膜蛋白的蛋白质印迹凝胶：图20a示出了细胞切割物中与抗血清的非特异性结合；图20b示出了细胞切割物中与抗泛黄病毒(anti-pan-flavivirus)的特异性结合。

图21a显示了sds-page凝胶，其示出了寨卡-包膜蛋白的纯化。

图21b显示了蛋白质印迹凝胶，其示出了寨卡-包膜蛋白的纯化。

图22和23显示了条形图，其示出了通过针对包括pre-m+包膜抗原的肽库进行ifn-γelispot测定来评估的刺突特异性cd8t-淋巴细胞应答。图22是各个小鼠的值。图23是组平均值。在第三次免疫后一周每个组中的平均应答。

图24a和24b显示了表示样品的结合elisa的图示，显示小鼠接种寨卡prm+env引发与寨卡-包膜抗原起反应的阳性抗体应答。

图25a和25b显示的图示显示zc-prme免疫原引发与寨卡-包膜抗原特异性反应的显著抗体应答。zpme血清对登革热(dengue)1、2、3和4抗原env的交叉反应性为阴性，而对寨卡env显示出强结合。

图26a至26e显示的分析表明zc-prme疫苗产生的血清不与登革热1-4重组env交叉反应。分析支持抗chikv疫苗诱导的血清也不与寨卡env结合。

图28，包括图28a至图28c，描绘了实验结果，展示了接种zikv-prmedna疫苗后对小鼠中细胞免疫应答的表征。图28a描绘了测量脾细胞中的ifn-γ分泌的elispot分析。将c57/bl6小鼠(n＝5只/组)用25μgpvax1或zikv-prmedna疫苗肌内免疫三次，然后进行体内ep。通过ifn-γelispot测量ifn-γ的产生，作为细胞免疫应答诱导的指示。在第三次免疫7天后收获的脾细胞在跨越整个prm和包膜蛋白的六个肽库之一的存在下温育。结果以堆积条形图示出。数据表示每百万个脾细胞的sfu(斑点形成单位)的平均数，其中值表示每组(n＝4)中的平均应答±sem。图28b描绘了正如通过在第三次免疫后一周用基质肽库刺激所测定的zikv-prme特异性ifn-γ应答的表位组成。值表示每组(n＝4)中的平均应答±sem。独立进行实验至少三次，结果相似。图28c描绘了用zikv-prme免疫，当用zikv肽刺激时，产生更多数量的ifn-γ和tnf-α分泌细胞。在用zikv-prme疫苗进行最后一次免疫后一周，在合并的zikv肽(5μm)或仅组织培养基的存在下培养脾细胞。通过荧光激活细胞分选(facs)测定法测量zikv肽特异性ifn-γ和tnf-α分泌细胞的出现率。基于阴性对照(未刺激的)样品设置单功能门，并且一致地放置在样品之间。示出了总cd8+t细胞应答的百分比。这些数据代表两个独立的免疫实验。

图29，包括图29a至图29d，描绘了脾细胞产生ifn-γ的特征和从pzikv-prme(mr766)和pzikv-prme(brazil)免疫小鼠收集的血清中的抗体水平。如材料和方法中所述，使六周龄的c57/bl6小鼠免疫。在第3次免疫后一周收集血清和脾细胞并与zikv特异性prme肽一起温育，并且通过elispot测定每百万个细胞中ifn-γsfu的数量。图29a描绘了从mr766免疫小鼠收集的血清的elispot分析。图29b描绘了从brazil免疫小鼠收集的血清的elispot分析。通过elisa测量血清中的抗zikvenv抗体水平(c和d)。图29c描绘了在mr766免疫小鼠中通过elisa测量的血清中的抗zikvenv抗体水平。图29d描绘了在brazil免疫小鼠中通过elisa测量的血清中的抗zikvenv抗体水平。

图30，包括图30a至图30e，描绘了实验结果，其展示通过接种zikv-prme质粒诱导了抗zikv抗体应答。将c57bl/6小鼠用25μgzikv-prme质粒或pvax1以2周的间隔肌内免疫三次。在以不同稀释度免疫后的不同时间点用来自动物的血清分析与包膜抗原的结合。用疫苗匹配的重组zikv-包膜蛋白涂铺elisa板。图30a描绘呈现了来自2个独立实验中的1个的结果。在第二个实验中获得了类似的结果。图30b描绘了在每次加强后来自免疫动物的血清中分析响应于zikv-prme免疫原产生的抗zikv终点滴度的差异。图30c描绘了zikv-包膜抗原表达的蛋白质印迹分析。将各种浓度的重组zikv-env蛋白在12.5％sds聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并如所示，用来自pvax1或zikv-prme免疫小鼠的血清通过蛋白质印迹分析进行分析。zikv-env蛋白的表达用箭头表示。图20d描绘了在用来自zikv-prme或pvax1免疫小鼠的血清温育后，用zikv-mr766感染或模拟感染的vero细胞的免疫荧光分析。图30e描绘了通过噬斑减少中和(prnt)测定法测试来自pzikv-prme免疫小鼠的样品在体外中和zikv感染性的能力。将prnt50定义为可以抑制50％输入病毒的血清稀释因子。括号中的值表示prnt50。对照质粒pzikv-衣壳和pvax1血清用作阴性对照。

图31，包括图31a至图31e，描绘了实验结果，其展示在zikv＝prmedna接种nhp后对zikv特异性细胞免疫应答的诱导。图31a描绘了恒河猴在第0周和第4周用2mgzikv-prme质粒经皮内(id)免疫，在两个部位各施用1mg，免疫后立即进行皮内ep。在免疫前和第6周分离pbmc，并用于elispot测定以检测响应于zikv-prme肽刺激的ifn-γ分泌细胞。y轴上示出了接种组针对涵盖整个prme蛋白的六个肽库，每百万个pbmc获得的ifn-γ生成细胞的数量。值表示每组(n＝5)中的平均应答±sem。图31b描绘了dna接种后对zikv-prme特异性抗体应答的检测。在免疫前和第6周通过elisa测量抗zikvigg抗体。图31c描绘了在第一次和第二次免疫后抗zikv包膜抗体的终点elisa滴度。图31d描绘了使用第6周合并的猴血清的蛋白质印迹分析，展示出与重组包膜蛋白结合。图31e描绘了在10pfu下用zikvmr766感染的vero细胞的免疫荧光分析。以1:100用第6周合并的猴血清感染后24小时探测细胞，然后用二次抗人igg-af488检测。

图32，包括图32a至图32c，描绘了实验结果，其展示了来自于用zikv-prme免疫的恒河猴的血清的噬斑减少中和活性。如材料和方法中所述，使恒河猴免疫。图32a描绘了通过噬斑减少中和(prnt)测定法测试来自个别猴子的免疫前和第6周免疫血清在体外中和zikv感染性的能力。将prnt50定义为可以抑制50％输入病毒的血清稀释因子。列出了每只猴子的计算ic50值。图21b和21c描绘了zikvmr766和pr209在vero、sk-n-sh和u87mg细胞中的细胞病变效应。图32b描绘了模拟感染或用mr766或pr209病毒感染vero细胞。图32c描述了在用zikv-prme疫苗(第6周)免疫的合并的nhp血清存在下，模拟或用mr766以0.001pfu/细胞的moi感染sk-n-sh和u87mg细胞。在感染后48小时使用免疫的nhp血清通过间接免疫荧光测定法(ifa)分析合胞体形成(cpe)和prme蛋白表达的诱导。在4x物镜下拍摄照片。

图33，包括图33a至图33c，描绘了实验结果，其展示了在缺少i型干扰素α、β受体的小鼠中从pzikvprme分离的脾细胞的ifn-γ和抗体产生曲线。图33a描绘将ifnα、β受体敲除小鼠(四至六只)用25μgpzikv-prme或pvax1质粒以2周间隔肌内免疫三次。在最后一次免疫后两周收集脾细胞并与prme肽一起温育，并且通过elispot测量ifn-γ生成细胞的数量。图33b描绘在免疫后的不同天数通过elisa测量免疫动物中对zikvenv蛋白有特异性的血清抗体。图33c描绘了免疫后0、1、2、3、4和5周的终点滴度。

图34，包括图34a至图34f，描绘了实验结果，其展示了在寨卡病毒感染后，缺少i型干扰素α、β受体的免疫小鼠的存活数据。寨卡感染后ifn-α/β受体敲除小鼠的存活率。图34a描绘将小鼠免疫一次并在2周后用106pfu的zikv-pr209攻击。图34b描绘将小鼠以2周间隔免疫两次，并在第二次免疫后7天用106pfu的zikv-pr209攻击。图34c描绘将小鼠以2周间隔免疫两次，并在第二次免疫后7天用2x106pfu的zikvpr209攻击。使用来自两个独立实验的数据构建存活曲线。图34d描绘了经2次免疫的动物的体重变化；数据反映了两个独立实验的结果，每个实验每组10至15只小鼠。图34e描绘了图34b中动物的临床评分。图34f描绘了图34c中动物的临床评分。临床评分的规定如下：1-无疾病，2-活动能力降低；3-弓背姿势且活动能力降低；4-后肢关节行走(部分麻痹)，5-一个后肢麻痹和6-两个后肢麻痹。

图35，包括图35a至图35e，描绘了实验结果，其展示了zikv-prme共有dna疫苗的构建。图35a描绘了zikv-prmedna疫苗的图示，表明将rme克隆到pvax1哺乳动物表达载体中。zikv-prme共有序列采用共有设计策略。prme构建体的密码子优化的合成基因包括合成ige前导序列。在cmv启动子的控制下将优化的基因构建体插入经修饰的pvax1载体的bamh1和xho1位点。图35b描绘了zikv-e蛋白的模型建立，展示了疫苗靶标与潜在相关表位区域的重叠。为疫苗设计目的所做的一些变化位于结构域ii和iii(位于插图的虚线内，左中)。这些区域中的疫苗特异性残基变化以紫色cpk形式示于e(包膜)蛋白二聚体的带状主链图示上(每条链分别为浅绿色和深绿色)。对应于定义的ede的区域用青色表示，融合环用蓝色表示。疫苗e蛋白的残基ile156(t156i)，被建模为暴露于150环的表面，是几种其它zikv毒株中以及多种登革热病毒毒株中n-连接的糖基化基序nxs/t的一部分。图35c描绘了使用蛋白质印迹分析通过sds-page对293t细胞中的zikv-prme蛋白表达进行的表达分析。用zikv-prme质粒转染293t细胞，并用泛黄病毒免疫血清分析细胞切割物和上清液中疫苗构建体的表达。蛋白质分子量标记物(kda)；如所示装载来自zikv-prme转染细胞和rzikv-e阳性对照的细胞切割物和上清液。图35d描绘了使用蛋白质印迹分析通过sds-page对293t细胞中的zikv-prme蛋白表达进行的表达分析。用zikv-prme质粒转染293t细胞，并用zikv-prme免疫血清分析细胞切割物和上清液中疫苗构建体的表达。蛋白质分子量标记(kda)；如所示装载来自zikv-prme转染细胞和rzikv-e阳性对照的细胞切割物和上清液。图35e描绘了对293t细胞中zikv-prme蛋白表达的免疫荧光测定(ifa)分析。用5μgzikvprme质粒转染细胞。转染后二十四小时，添加来自zikv-prme免疫小鼠的血清(1:100)进行免疫荧光标记，然后添加抗小鼠igg-af488二抗进行检测。示出了用来自zikv-prme和pvax1免疫小鼠的血清进行的染色。dapi图示出了细胞核的对照染色。覆盖图是抗小鼠igg-af488和dapi染色模式的组合。dapi，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚；zikv-prme，即寨卡病毒的前体膜和包膜。

图36，包括图36a至图36d，描绘了实验结果，展示了接种zikv-prmedna疫苗后对小鼠中细胞免疫应答的表征。图36a描绘了研究中使用的疫苗免疫和免疫分析的时间轴。图36b描绘了测量脾细胞中响应于zikv-prme免疫的ifn-γ分泌的elispot分析。将c57bl/6小鼠(n＝4只/组)用25μgpvax1或zikv-prmedna疫苗肌内(i.m.)免疫三次，然后进行电穿孔。通过ifn-γelispot测定法测量ifn-γ的产生，作为细胞免疫应答诱导的指示。在第三次免疫1周后收获的脾细胞在跨越整个prm和包膜蛋白的六个肽库之一的存在下温育。结果以堆积条形图示出。数据表示每百万个脾细胞的sfu(斑点形成单位)的平均数，其中值表示每组中的平均应答±s.e.m.。图36c描绘了正如通过在第三次免疫1周后用基质肽库刺激所测定的zikvprme特异性ifn-γ应答的表位组成。值表示每组中的平均应答±s.e.m.。独立进行实验至少三次，结果相似。图36d描绘了t细胞应答的流式细胞术分析。用zikv-prme免疫，当用zikv肽刺激时，诱导更多数量的ifn-γ和tnf-α分泌细胞。在用zikv-prme疫苗进行最后一次免疫后一周，在合并的zikv肽(5μm)或仅r10的存在下培养脾细胞。通过流式细胞术测量zikv肽特异性ifn-γ和tnf-α分泌细胞的出现率。基于阴性对照(未刺激的)样品设置单功能门，并且一致地放置在样品之间。示出了总cd8⁺t细胞应答的百分比。这些数据代表两个独立的免疫实验。ifn，即干扰素；tnf，即肿瘤坏死因子；zikv-prme，即寨卡病毒的前体膜和包膜。

图37，包括图37a至图37e，描绘了实验结果，其展示通过接种zikv-prme诱导了抗zikv抗体应答。图37a描绘了在免疫小鼠中测量结合抗体产生(通过od450值测量)的elisa分析。将c57bl/6小鼠(n＝4)用25μgzikv-prme质粒或pvax1以2周的间隔i.m.免疫三次。在以不同稀释度免疫后的不同时间点(第21、35和50天)用来自动物的血清分析与rzikv-e的结合。所示数据代表至少三个独立实验。图37b描绘了终点结合滴度分析。在每次加强后，在来自免疫动物的血清中分析响应于zikv-prme免疫原产生的抗zikv终点滴度的差异。图37c描绘了通过zikv-prme免疫诱导的rzikv-e特异性抗体的蛋白质印迹分析。将rzikv-e蛋白质在12.5％sds聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用来自zikv-prme免疫小鼠的合并血清(第35天)通过蛋白质印迹分析进行分析。用箭头表示与rzikv-e的结合。图37d描绘了通过zikv-prme免疫诱导的zikv特异性抗体的免疫荧光分析。用zikv-mr766感染或模拟感染的vero细胞用来自zikv-prme免疫小鼠(第35天)的合并血清染色，然后用抗小鼠-af488二抗进行检测。图37e描绘了通过zikv-prme免疫诱导的中和抗体的噬斑减少中和(prnt)测定分析。测试来自zikv-prme免疫小鼠的血清样品在体外中和zikv感染性的能力。将prnt50定义为可以抑制50％输入病毒的血清稀释因子。括号中的值表示prnt50。对照zikv-cap(表达zikv衣壳蛋白的dna疫苗)和pvax1血清用作阴性对照。zikv-prme，寨卡病毒的前体膜和包膜。

图38，包括图38a至图38e，描绘了实验结果，其展示在非人灵长类动物(nhp)的zikv-prme接种后对zikv特异性细胞免疫应答的诱导。图38a描绘了测量外周血单核细胞(pbmc)中响应于zikv-prme免疫的ifn-γ分泌的elispot分析。恒河猴在第0周和第4周用2mgzikv-prme质粒经皮内免疫，在两个部位各施用1mg，免疫后立即进行皮内电穿孔。在免疫前和第6周分离pbmc，并用于elispot测定以检测如“材料和方法”部分中所述，响应于zikv-prme肽刺激的ifn-γ分泌细胞。示出了针对涵盖整个prme蛋白的六个肽库，每百万个pbmc获得的ifn-γ生成细胞的数量。值表示每组(n＝5)中的平均应答±s.e.m.。图38b描绘了dna接种后对zikv-prme特异性抗体应答的检测。在免疫前和第6周通过elisa测量抗zikvigg抗体。图38c描绘了在第一次和第二次免疫后抗zikv包膜抗体的终点elisa滴度。图38d描绘了使用第6周rm免疫血清的蛋白质印迹分析，展示出与重组包膜蛋白的结合。图38e描绘了来自于用zikv-prme进行rm免疫的血清的prnt活性。通过噬斑减少中和(prnt)测定法测试来自个别猴子的免疫前和第6周免疫血清在体外中和zikv感染性的能力。将prnt50定义为可以抑制50％输入病毒的血清稀释因子。列出了每只猴子的计算(prnt50)值。ifn，干扰素；zikv-prme，寨卡病毒的前体膜和包膜。

图39，包括图39a至图39f，描绘了实验结果，其展示了在zikv感染后，缺少i型干扰素α、β受体的免疫小鼠的存活数据。图39a描绘了ifnar^-/-小鼠在zikv感染后的存活率。将小鼠用25μgzikv-prmedna疫苗以2周间隔免疫两次，并在第二次免疫后1周用zikv-pr209病毒，以1×10⁶个噬斑形成单位攻击。图39b描绘了ifnar^-/-小鼠在zikv感染后的存活率。将小鼠用25μgzikv-prmedna疫苗以2周间隔免疫两次，并在第二次免疫后1周用zikv-pr209病毒，以2×10⁶个噬斑形成单位攻击。图39c描绘了用1×10⁶个噬斑形成单位免疫的动物的体重变化。图39d描绘了用2×10⁶个噬斑形成单位免疫的动物的体重变化。图39e描绘了用1×10⁶个噬斑形成单位免疫的动物的临床评分。图39f描绘了用2×10⁶个噬斑形成单位免疫的动物的临床评分。临床评分的规定如下：1：无疾病，2：活动能力降低；3：弓背姿势且活动能力降低；4：后肢关节行走(部分麻痹)；5：一侧后肢麻痹；和6：双侧后肢麻痹。数据反映了两个独立实验的结果，每个实验每组10只小鼠。zikv-prme，寨卡病毒的前体膜和包膜。

图40，包括图40a至图40d，描绘了实验结果，其展示用zikv-prme疫苗进行单次免疫在缺少i型干扰素α、β受体的小鼠中提供了针对zikv激发的防御。将小鼠免疫一次并在单次免疫后2周，用2×10⁶个噬斑形成单位的zikv-pr209攻击。存活曲线描绘了每个实验每组的10只小鼠。图40a展示zikv-prme疫苗预防小鼠脑部中zika诱导的神经异常。图40b描绘在攻击后7-8天收集来自接种pvax1和zikv-prme的组的脑切片并用h&e(苏木精和曙红)染色用于组织学分析。取自代表性、未受保护的pvax1对照动物的切片显示出病理。(i)：大脑皮质神经纤维内的核碎片(插图示出了高倍放大图和箭头以突出核碎片)；(ii)：皮质内血管的围管现象、淋巴细胞浸润和变性细胞；(iii)：大脑皮质内的围管现象、细胞变性和核碎片；及(iv)：海马内的神经元变性(箭头)。来自接种zikv-prme的小鼠的正常组织的实例似乎在正常限值范围内(v和vi)。图40c描绘了接种并在感染后的指定一天进行病毒攻击后，来自于小鼠的血浆样品中的zikvrna水平。结果表示为每毫升血浆的基因组当量。图40d描绘了在感染后第28天分析脑组织中的zikv-rna水平。结果表示为每克组织的基因组当量。zikv-prme，寨卡病毒的前体膜和包膜。

图41，包括图41a和图41b，描绘了实验结果，其展示了在zikv攻击后被动转移抗zikv免疫血清后，对缺少i型干扰素α、β受体的小鼠的保护。在用zika病毒(每只小鼠10⁶个噬斑形成单位)进行皮下(s.c.)攻击后1天，向小鼠腹腔(i.p.)施用(150μl/小鼠)用于对抗zika病毒igg滴定的合并的nhp抗zikv免疫血清。作为对照，将正常猴血清和磷酸盐缓冲盐水(pbs)(150μl/小鼠)施用于作为对照的年龄匹配的小鼠。图41a描绘了感染和处理过程中的小鼠体重变化。每个点表示每只小鼠计算的攻击前百分比(第0天)重量的平均值和标准误差。图41b描绘了施用nhp免疫血清后小鼠的存活率。zikv-prme，寨卡病毒的前体膜和包膜。

图42，包括图42a至图42d，描绘了实验结果，其展示了对zikv-prme-mr766或zikv-prmebrazil疫苗在c57bl/6小鼠中的免疫应答的表征。图42a描绘了在接种zikv-prme-mr766和zikv-prme-brazildna疫苗后测量细胞和抗体应答的elispot和elisa分析。将c57bl/6小鼠(n＝4只/组)用25μgzikv-prme-mr766肌内免疫三次，然后进行体内ep。通过ifn-γelispot测量ifn-γ的产生，作为细胞免疫应答诱导的指示。在第三次免疫后一周收获的脾细胞在跨越整个prm和e蛋白的六个肽库之一的存在下温育。结果以堆积条形图示出。数据表示每百万个脾细胞的sfu(斑点形成单位)的平均数，其中值表示每组中的平均应答±sem。图42b描绘了在接种zikv-prme-mr766和zikv-prme-brazildna疫苗后测量细胞和抗体应答的elispot和elisa分析。将c57bl/6小鼠(n＝4只/组)用25μgzikvprme-brazil肌内免疫三次，然后进行体内ep。通过ifn-γelispot测量ifn-γ的产生，作为细胞免疫应答诱导的指示。在第三次免疫后一周收获的脾细胞在跨越整个prm和e蛋白的六个肽库之一的存在下温育。结果以堆积条形图示出。数据表示每百万个脾细胞的sfu(斑点形成单位)的平均数，其中值表示每组中的平均应答±sem。图42c描绘了测量免疫的c57bl/6小鼠中结合抗体的产生的elisa分析。在以不同稀释度免疫后第35天用来自小鼠的血清分析与rzikv-e的结合。图42d描绘了测量免疫的c57bl/6小鼠中结合抗体的产生的elisa分析。在以不同稀释度免疫后第35天用来自小鼠的血清分析与rzikv-e的结合。

图43，包括图43a至图43d，描绘了实验结果，其展示了zikv-包膜蛋白的表达、纯化和表征的。图43a描绘了用于rzikve表达的克隆质粒。图43b描绘了通过sds-page和蛋白质印迹分析对重组zikv-e(rzikv-e)蛋白的表征。泳道1-bsa对照；泳道2-来自用pet-28a载体质粒转化的大肠杆菌培养物的切割物，用镍金属亲和树脂柱纯化并在iptg诱导后通过sds-page分离。泳道3，用抗his标签抗体通过蛋白质印迹分析37种重组zv-e纯化蛋白。泳道m，蛋白质分子量标记物。图43c描绘评价了纯化的rzikv-e蛋白的抗原性。用rzikv-e涂铺elisa板，然后与不同稀释度的来自用zikv-prme疫苗或作为阳性对照的泛黄病毒抗体免疫的小鼠的免疫血清一起温育。如实验实施例中所述，通过添加过氧化物酶缀合的抗小鼠抗体，然后添加四甲基联苯胺底物来检测结合的igg。图43d描绘了用来自zikvprme免疫小鼠的免疫血清对纯化rzikv-e蛋白进行的蛋白质印迹检测。如上所述，将各种浓度的纯化rzikv-e蛋白装载到sds-page凝胶上。在室温下使用1:100稀释度的免疫血清和1:15,000的山羊抗小鼠1小时。洗涤后，将膜在odyssey红外成像仪上成像。使用odyssey蛋白质分子量标准。箭头表示rzikv-e蛋白的位置。

图44，包括图44a至图44c，描绘了实验结果，其展示了对ifnar^-/-小鼠中的免疫应答zika-prme的表征。elispot和elisa分析测量ifnar^-/-小鼠中对zikv-prme的细胞和抗体应答。将小鼠(n＝4只/组)用25μgzikv-prme肌内免疫三次，然后进行体内ep。图44a描绘通过ifn-γelispot测量ifn-γ的产生，作为细胞免疫应答诱导的指示。图44b描绘了测量免疫的ifnar^-/-小鼠中结合抗体的产生的elisa分析。在免疫后的不同时间点用来自小鼠的血清分析与rzikv-e的结合。图44c描绘了在免疫的ifnar^-/-小鼠中产生的抗zikv抗体的终点滴度分析。

图45，包括图45a至图45d，描绘了实验结果，其展示了来自于对zikv-prme免疫的恒河猴的免疫血清的中和活性。在用zikv-prme疫苗(第6周)免疫的合并的nhp血清存在下，模拟感染或用mr766以0.01pfu/细胞的moi感染sk-n-sh和u87mg细胞。感染后4天使用来自接种zikv-prme的nhp的血清通过间接免疫荧光测定(ifa)分析寨卡病毒感染性。图45a描绘了在20x物镜下拍摄的染色组织样品切片的照片，其展示了在vero、sk-n-sh和u87mg中对zikv病毒mr766和pr209感染的抑制。图45b描绘了在20x物镜下拍摄的染色组织样品切片的照片，其展示了在vero、sk-n-sh和u87mg中对zikv病毒sk-n-sh和u87mg感染的抑制。图45c描绘了示出受感染(gfp阳性细胞)百分比的条形图，其展示了在vero、sk-n-sh和u87mg中对zikv病毒mr766和pr209感染的抑制。图45d描绘了示出受感染(gfp阳性细胞)百分比的条形图，其展示了在vero、sk-n-sh和u87mg中对zikv病毒sk-n-sh和u87mg感染的抑制。

图46，包括图46a至图46d，描绘了实验结果，其展示zikv对ifnar^-/-小鼠有毒力。这些数据证实zikv在ifnar^-/-中有毒力，导致发病和死亡。图46a描绘了通过颅内接种10⁶pfuzikv-pr209病毒的ifnar^-/-小鼠的kaplan-meier存活曲线。图46b描绘了通过静脉内接种10⁶pfuzikv-pr209病毒的ifnar^-/-小鼠的kaplan-meier存活曲线。图46c描绘了通过腹腔内接种10⁶pfuzikv-pr209病毒的ifnar^-/-小鼠的kaplan-meier存活曲线。图46d描绘了通过皮下接种10⁶pfuzikv-pr209病毒的ifnar^-/-小鼠的kaplan-meier存活曲线。图46a描绘了对于所有途径而言，在感染过程中的小鼠体重变化。

图47描绘的实验结果展示了持久性和全身性抗寨卡病毒-env抗体的诱导。通过zikv-prme+zv-dmab免疫诱导抗zikv抗体应答。将a129小鼠(n＝4)用25μgzikv-prme质粒以2周间隔i.m.免疫三次或用zikv-dmab免疫一次。如图所示，在不同时间点用来自动物的血清分析与重组zikv-包膜的结合。在单次zv-igg(人抗zikv)注射和zikv-prme免疫(小鼠抗zikv包膜)后诱导持久性和全身性抗zikvenv抗体。所示数据代表至少两个独立实验，并且显示平均od450值±sd。

具体实施方式

本发明涉及组合物，其包含编码寨卡病毒抗原的抗体的重组核酸序列及其功能片段。可以将所述组合物施用给有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。

本发明还涉及第一组合物和第二组合物的组合，所述第一组合物在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答，所述第二组合物包含编码抗体的重组核酸序列、其片段、其变体或其组合。

本发明的另一方面提供免疫原性组合物，其包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种能够在哺乳动物中产生针对寨卡病毒的免疫应答的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子包含一种或多种能够在哺乳动物中表达共有寨卡抗原的核酸序列和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，所述核酸分子包含与编码共有寨卡抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一个实施方案中，共有寨卡抗原包含共有prme、ns1、衣壳，或一种或多种前述抗原的融合物。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码共有寨卡抗原的优化核酸序列，所述共有寨卡抗原包含与seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29和seqidno:39至少90％同源的氨基酸序列。

本发明涉及包含编码抗体的重组核酸序列、其片段、其变体或其组合的组合物。可以将所述组合物施用给有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。

具体而言，由重组核酸序列表达的重链和轻链多肽可以组装成合成抗体。重链多肽和轻链多肽可彼此相互作用，使得组装产生合成抗体，所述合成抗体能够结合抗原，与未如本文所述组装的抗体相比具有更高的免疫原性，并且能够引发或诱导针对抗原的免疫应答。

另外，这些合成抗体在受试者中比在响应于抗原诱导的免疫应答产生的抗体更快速地产生。合成抗体能够有效地结合并中和一系列抗原。合成抗体还能够有效地防御疾病和/或促进疾病的存活率。

1.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。如有冲突，将以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法和材料，但与本文所述那些相似或等同的方法和材料均可用于本发明的实践或试验中。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅为说明性，并非旨在限制。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“有”、“具有”、“可以”、“含有”及其变化形式旨在为开放式过渡短语、术语或词语，其不排除另外的动作或结构的可能性。除非上下文清楚地另外指示，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本上由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其它实施方案，无论是否明确地阐述。

“抗体”可以意指igg、igm、iga、igd或ige类别的抗体或其片段、片段或衍生物，包括fab、f(ab')2、fd，以及单链抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其对所需表位或由其衍生的序列表现出足够的结合特异性。

如本文中可互换使用的“抗体片段”或“抗体的片段”是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分。该部分不包括完整抗体fc区的恒定重链结构域(即，ch2、ch3或ch4，这取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于fab片段、fab'片段、fab'-sh片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、双链抗体(diabody)、单链fv(scfv)分子、仅含一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的三个cdr的单链多肽、仅含一个重链可变区的单链多肽及含有重链可变区的三个cdr的单链多肽。

“抗原”是指能够在宿主中产生免疫应答的蛋白质。抗原可以被抗体识别和结合。抗原可以源自体内或源自外部环境。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可以意指包含编码如本文所阐述的抗体的核苷酸序列的核酸(rna或dna分子)。所述编码序列还可包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。编码序列还可包括编码信号肽的序列。

如本文所用的“补体”或“互补的”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(watson-crick)(例如，a-t/u和c-g)或胡格斯汀(hoogsteen)碱基配对。

如本文所用的“恒定电流”用于定义在递送到相同组织的电脉冲的持续时间内由组织或限定所述组织的细胞接收或经受到的电流。电脉冲从本文所述的电穿孔装置递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选地具有瞬时值反馈，因此该电流在电脉冲的寿命期间在所述组织中保持恒定的安培数。反馈元件可以在脉冲的整个持续时间内测量组织(或细胞)的电阻并使电穿孔装置改变其电能输出(例如，增加电压)，因而相同组织中的电流在整个电泳冲(在微秒量级上)中以及电脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

如本文所用的“电流反馈”或“反馈”可以互换使用，并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，其包括测量电极之间的组织中的电流并相应地改变由ep装置递送的能量输出，以便将电流保持在恒定水平。该恒定水平是在开始脉冲序列或电处理之前由用户预先设定的。反馈可以通过电穿孔组件例如电穿孔装置的控制器来实现，因为其中的电路能够连续监测电极之间的组织中的电流，并将监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较并连续进行能量输出调节，以将监测的电流维持在预设水平。反馈回路可以是瞬时的，因为它是模拟闭合回路反馈。

如本文所用的“分散电流”可以意指从本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流模式，其中所述模式最小化或优选消除电穿孔相关的热应激在被电穿孔的组织的任何区域上的发生。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电透化”或“电动力增强”(“ep”)可意指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观路径(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、sirna、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过到达另一侧。

如本文所用的“内源性抗体”可以指在施用了有效剂量的用于诱导体液免疫应答的抗原的受试者中产生的抗体。

如本文所用的“反馈机制”可以指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，该过程(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)接收期望组织的阻抗，并将其与当前值(优选为电流)相比较，并调节所递送的能量脉冲以达到预设值。反馈机制可以通过模拟闭环电路进行。

“片段”可以意指抗体的多肽片段，其起到结合期望靶标的作用，即可以结合期望靶标并且具有与全长抗体相同的预期效果。除了从n端和/或c端缺失至少一个氨基酸之外，抗体的片段可以与全长具有100％同一性，在每种情况下在位置1处有或无信号肽和/或甲硫氨酸。除了添加的任何异源信号肽之外，片段可占特定全长抗体长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。所述片段可以包含与抗体具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多同一性的多肽的片段，并且另外包含在计算同一性百分比时未包括在内的n端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包含n端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如ige或igg信号肽。n端甲硫氨酸和/或信号肽可以与抗体的片段连接。

除了从5'和/或3'末端缺失至少一个核苷酸之外，编码抗体的核酸序列的片段可以与全长具有100％同一性，在每种情况下在位置1处有或无编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。除了添加的任何异源信号肽之外，片段可占特定全长编码序列长度的20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多百分比。所述片段可以包含编码与抗体具有95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多同一性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码在计算同一性百分比时未包括在内的n端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含n端甲硫氨酸和/或信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，例如ige或igg信号肽的编码序列。编码n端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以与编码序列的片段连接。

如本文所用的“基因构建体”是指包含编码蛋白质(诸如抗体)的核苷酸序列的dna或rna分子。所述编码序列包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达形式”是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时编码序列将被表达。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“同一的”或“同一性”可以意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列，在指定区域比较两个序列，确定在两个序列中出现同一残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或者比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中而非分子中。当比较dna和rna时，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如blast或者blast2.0来进行。

在讨论反馈机制时可以使用如本文所用的“阻抗”，并且可以根据欧姆定律转换为电流值，从而能够与预设电流进行比较。

如本文所用的“免疫应答”可以意指宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)响应于一种或多种核酸和/或肽的引入而激活。免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指至少两个共价连接在一起的核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸也涵盖了所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上同一的核酸和其互补序列。单链提供了可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或者可以含有双链或者单链序列两种的部分。所述核酸可以是dna(基因组和cdna两者)、rna或杂交体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达处于在空间上与之连接的启动子的控制之下。启动子可以定位在处于其控制之下的基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可与在该启动子所源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域所已知，该距离的变化可以在不失去启动子功能的情况下进行调节。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的修饰或组合。

如本文所用的“启动子”可以意指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。启动子可以源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子相对于其中发生表达的细胞、组织或器官，相对于发生表达时所处的发育阶段或响应于外部刺激诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可以组成性地或差异性地调控基因构件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体t7启动子、噬菌体t3启动子、sp6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、sv40晚期启动子、sv40早期启动子、rsv-ltr启动子、cmvie启动子、sv40早期启动子或sv40晚期启动子以及cmvie启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以连接在本文阐述的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常在从细胞分泌后从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)切割下来。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的n端。

如本文所用的“严格杂交条件”可意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)例如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的。可将严格条件选择为比限定离子强度ph下特定序列的热解链温度(tm)低约5-10℃。tm可以是(在限定的离子强度、ph和核酸浓度下)50％的与靶标互补的探针与靶序列平衡杂交时所处的温度(当靶序列过量存在时，在tm下，50％的探针被平衡地占据)。严格条件可以是这样的条件，其中在ph7.0至8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子，诸如约0.01-1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸而言)和至少约60℃(对于长探针，例如大于约50个核苷酸而言)。还可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺，5xssc和1％sds，在42℃下温育，或5xssc，1％sds，在65℃下温育，在65℃下于0.2xssc和0.1％sds中洗涤。

如本文可互换使用的“受试者”和“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如，猴子，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人类)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。受试者或患者可以正在接受其它形式的治疗。

如本文所用的“基本上互补”可以意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上与第二序列的补体具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用的“基本上同一的”可以意指第一和第二序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的补体基本上互补，则第一序列和第二序列是基本上同一的。

如本文所用的“合成抗体”是指由本文所述的重组核酸序列编码并在受试者中产生的抗体。

如本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏或完全消除疾病的手段保护受试者免于疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的疫苗。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床表现之前向受试者施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病的临床表现之后向受试者施用本发明的疫苗。

如本文关于核酸使用的“变体”可以意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其补体基本上同一的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上同一的序列杂交的核酸。

“变体”是指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同，但保持至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指氨基酸序列与参考蛋白质的氨基酸序列基本上同一的蛋白质，其保持至少一种生物活性。氨基酸的保守性取代，即，将氨基酸用具有相似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来置换，在本领域中通常被认为涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。kyte等人，j.mol.biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保持蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示会产生保持生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中对氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已经报道与抗原性和免疫原性密切相关的有用测量。第4,554,101号美国专利，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物活性(例如免疫原性)的肽。可以用亲水性值处在彼此的±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致的是，应理解与生物功能相容的氨基酸取代取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它性质所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上基本上同一的核酸序列。该核酸序列可在基因序列或其片段的全长上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上基本上同一的氨基酸序列。该氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

如本文所用的“载体”可以意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna或rna载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

对于本文数值范围的列举来说，明确地考虑到了具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围来说，除6和9之外，还考虑到数字7和8，并且对于范围6.0-7.0来说，明确地考虑到数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.组合物

本发明的一个方面提供了在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答的组合物与包含编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列的组合物的组合。可以将所述组合物施用给有需要的受试者以促进合成抗体的体内表达和形成。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码抗zikv-包膜(抗zikve)蛋白抗体的核苷酸序列。

本发明涉及第一组合物和第二组合物的组合，所述第一组合物在哺乳动物中引发针对寨卡病毒的免疫应答，所述第二组合物包含编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列。

寨卡疫苗

本发明的另一方面提供了免疫原性组合物，其包含一种或多种能够在哺乳动物中产生针对寨卡病毒的免疫应答的核酸分子。本发明还提供了分离的核酸分子，其能够在哺乳动物中产生针对寨卡病毒的免疫应答。在一个实施方案中，所述核酸分子包含一种或多种能够在哺乳动物中表达共有寨卡抗原的核酸序列和药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，所述核酸分子包含与编码共有寨卡抗原的编码序列可操作地连接的启动子。在一个实施方案中，共有寨卡抗原包含共有prme、ns1、衣壳，或一种或多种前述抗原的融合物。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码共有寨卡抗原的优化核酸序列，所述共有寨卡抗原包含与seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33和seqidno:39至少90％同源的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文的核酸序列可以从5'末端去除ige前导序列，并且本文的蛋白质序列可以从n端去除ige前导序列。

在一个实施方案中，核酸分子可以编码具有seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39所示的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述核酸分子包含seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37或seqidno:38中所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述序列可以是在seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37或seqidno:38所示的核苷酸序列的整个长度上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在其它实施方案中，序列可以是编码在seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含rna序列，所述rna序列是来自dna序列的转录物，所述dna序列在seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37或seqidno:38所示的核酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码在seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的rna序列。

共有寨卡抗原可以是具有seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39中所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，所述抗原可以具有在seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39所示的氨基酸序列的整个长度上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

可以提供具有与seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39至少95％同源的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

在一个实施方案中，核酸分子的免疫原性片段编码全长优化共有寨卡抗原的至少一个免疫显性或亚免疫显性表位。

一些实施方案涉及seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39的免疫原性片段，其占seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可以与seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31、seqidno:33或seqidno:39的片段至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施方案中，免疫原性片段包括编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如ige前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含与seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37或seqidno:38至少90％同源的序列。

在一些实施方案中，所述核酸分子包括编码寨卡抗原的序列减去编码序列的n末端上的ige前导序列。在一些实施方案中，dna核酸分子还包含ige前导序列，其附接至编码序列的n末端并可操作地连接至启动子。

所述核酸分子还可包括附接至编码序列的c末端的多腺苷酸化序列。在一个实施方案中，所述核酸分子是密码子优化的。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是佐剂。优选地，佐剂选自：il-12和il-15。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子或脂质，更优选为聚-l-谷氨酸。优选地，聚-l-谷氨酸的浓度小于6mg/ml。在一个实施方案中，所述核酸分子为dna质粒。在一个实施方案中，dna质粒的总dna质粒浓度为1mg/ml或更高。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含多个独特的核酸分子，其中所述多个独特的核酸分子中的每一个编码包含共有prme蛋白、共有prme(构建体1)、共有ns1dna或共有衣壳蛋白的多肽。

所述核酸分子可包括dna质粒，其包含编码氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列包括但不限于seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27、seqidno:29、seqidno:31和seqidno:33。

在一个实施方案中，所述核酸分子可包括含有核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包括但不限于seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37和seqidno:38。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含优化的核酸序列。优化序列可包含共有序列和/或用于改善表达的修饰。修饰可包括密码子优化、rna优化、添加kozak序列以便增加翻译起始和/或添加免疫球蛋白前导序列以提高免疫原性。由优化序列所编码的寨卡抗原可包含信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白e(ige)或免疫球蛋白(igg)信号肽。在一些实施方案中，由优化共有序列所编码的抗原可包含血凝素(ha)标签。由优化序列所编码的寨卡抗原可以设计为引发比相应的天然抗原更强的细胞和/或体液免疫应答。

在本发明的一些实施方案中，核酸分子疫苗还可包括佐剂。在一些实施方案中，佐剂选自下组：α-干扰素、γ-干扰素、血小板源性生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞虏获趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86，包括信号序列缺失的il-15，并且任选地包括来自ige的信号肽。可以用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：mcp-1、mip-l-α、mip-1p、il-8、rantes、l-选择素、p-选择素、e-选择素、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、半胱天冬酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、无活性的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素应答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段。在一些优选的实施方案中，佐剂选自il-12、il-15、ctack、teck或mec。

在一些实施方案中，在哺乳动物中引发针对共有寨卡抗原的免疫应答的方法包括诱导粘膜免疫应答的方法。此类方法包括与包括上述共有寨卡抗原的dna质粒组合，向哺乳动物施用ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白及其功能片段或其可表达的编码序列中的一种或多种。ctack蛋白、teck蛋白、mec蛋白及其功能片段中的所述一种或多种可以在施用本文提供的核酸分子之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，向哺乳动物施用编码一种或多种选自下组的蛋白质的分离的核酸分子：ctack、teck、mec及其功能片段。

免疫原性组合物可以在施用了该组合物的受试者中诱导免疫应答。所诱导的免疫应答可对天然抗原有特异性。所诱导的免疫应答可以与和优化的共有编码抗原相关的天然抗原有反应性。在各种实施方案中，相关抗原包括具有与优化的共有编码抗原的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的氨基酸序列的抗原。在各种实施方案中，相关抗原包括由与本文所公开的优化的共有核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列所编码的抗原。

免疫原性组合物可以在施用了该免疫原性组合物的受试者中诱导体液免疫应答。所诱导的体液免疫应答可对天然抗原有特异性。所诱导的体液免疫应答可以与和优化的共有编码抗原相关的天然抗原有反应性。体液免疫应答可在施用了免疫原性组合物的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍，或约3倍至约10倍。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，体液免疫应答可在施用了免疫原性组合物的受试者中被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

由免疫原性组合物所诱导的体液免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用了免疫原性组合物的受试者相关的增加水平的中和抗体。中和抗体可以对与优化的共有编码抗原相关的天然抗原具有特异性。中和抗体可以对遗传上与优化的共有抗原相关的天然抗原有反应性。中和抗体可以在施用了免疫原性组合物的受试者中提供针对肿瘤生长、转移或肿瘤相关病理的防御和/或治疗。

由免疫原性组合物所诱导的体液免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用了免疫原性组合物的受试者相关的增加水平的igg抗体。这些igg抗体可以对遗传上与优化的共有抗原相关的天然抗原有特异性。这些igg抗体可以对遗传上与优化的共有抗原相关的天然抗原有反应性。与施用免疫原性组合物的受试者相关的igg抗体水平与未施用免疫原性组合物的受试者相比可提高约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍或约3倍至约10倍。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的igg抗体水平可以提高至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍或至少约16.0倍。

免疫原性组合物可以在施用了该免疫原性组合物的受试者中诱导细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可以对与优化的共有编码抗原相关的天然抗原有特异性。所诱导的细胞免疫应答可以与和优化的共有编码抗原相关的天然抗原有反应性。所诱导的细胞免疫应答可包括引发cd8⁺t细胞应答。所引发的cd8⁺t细胞应答可以对在遗传上与优化的共有抗原相关的天然抗原有反应性。所引发的cd8⁺t细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发cd8⁺t细胞应答，其中cd8⁺t细胞产生干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素-2(il-2)或ifn-γ与tnf-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的增强的cd8⁺t细胞应答。与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd8⁺t细胞应答与未施用免疫原性组合物的受试者相比可增强约2倍至约30倍、约3倍至约25倍或约4倍至约20倍。与未施用免疫原性组合物的受试者或试验非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd8⁺t细胞应答可增强至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原有反应性的cd107a/ifnγ/t-bet三阳性cd8t细胞的出现率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd107a/ifnγ/t-bet三阳性cd8t细胞的出现率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括对天然抗原有反应性的cd107a/ifnγ双阳性cd8t细胞的出现率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd107a/ifnγ双阳性cd8t细胞的出现率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍。

由免疫原性组合物所诱导的细胞免疫应答可包括引发cd4⁺t细胞应答。所引发的cd4⁺t细胞应答可以对在遗传上与优化的共有抗原相关的天然抗原有反应性。所引发的cd4⁺t细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发cd4⁺t细胞应答，其中cd4⁺t细胞产生ifn-γ、tnf-α、il-2或ifn-γ与tnf-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生ifn-γ的cd4⁺t的出现率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd4⁺ifn-γ⁺t细胞的出现率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生tnf-α的cd4⁺t的出现率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd4⁺tnf-α⁺t细胞的出现率可以增加至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括产生ifn-γ和tnf-α两者的cd4⁺t细胞的出现率增加。与未施用免疫原性组合物的受试者或施用非优化寨卡抗原的受试者相比，与施用免疫原性组合物的受试者相关的cd4⁺ifn-γ⁺tnf-α⁺的出现率可增加至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍或35倍。

合成抗体

本发明涉及包含编码抗体、其片段、其变体或其组合的重组核酸序列的组合物。该组合物当施用给有需要的受试者时，可导致在受试者中产生合成抗体。合成抗体可以结合受试者中存在的靶分子(即抗原)。此类结合可以中和所述抗原，阻断另一种分子(例如蛋白质或核酸)对所述抗原的识别，并引发或诱导对所述抗原的免疫应答。

在一个实施方案中，所述组合物包含编码合成抗体的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述组合物包含核酸分子，其包含编码第一合成抗体的第一核苷酸序列和编码第二合成抗体的第二核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码切割结构域的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子包含编码抗zikv-包膜(抗zikve)蛋白抗体的核苷酸序列。

在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个密码子优化的核酸序列，其编码如seqidno:1-22中的一个或多个所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个密码子优化的核酸序列，其编码与seqidno:1-22中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个密码子优化的核酸序列，其编码如seqidno:1-22中的一个或多个所示的氨基酸的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个密码子优化的核酸序列，其编码与seqidno:1-22中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列的免疫原性片段。

在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个rna序列，其是由编码如seqidno:1-22中的一个或多个所示的氨基酸序列的一个或多个dna序列转录而来的。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个rna序列，其是由编码与seqidno:1-22中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列的一个或多个dna序列转录而来的。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个rna序列，其是由编码如seqidno:1-22中的一个或多个所示的氨基酸序列的免疫原性片段的一个或多个dna序列转录而来的。在一个实施方案中，编码抗zikv抗体的核苷酸序列包含一个或多个rna序列，其是由编码与seqidno:1-22中的一个或多个至少90％同源的氨基酸序列的免疫原性片段的一个或多个dna序列转录而来的。

在一个实施方案中，编码抗zikve抗体的核苷酸序列包含分别编码seqidno:1和seqidno:2的可变vh和vl区的一个或多个密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，抗zikve抗体包含编码如seqidno:11或seqidno:12所示的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方案中，编码抗zikve抗体的核苷酸序列包含分别编码seqidno:3和seqidno:4的可变vh和vl区的一个或多个密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，抗zikve抗体包含编码如seqidno:13或seqidno:14所示的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方案中，编码抗zikve抗体的核苷酸序列包含分别编码seqidno:5和seqidno:6的可变vh和vl区的一个或多个密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，抗zikve抗体包含编码如seqidno:15或seqidno:16所示的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方案中，编码抗zikve抗体的核苷酸序列包含分别编码seqidno:7和seqidno:8的可变vh和vl区的一个或多个密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，抗zikve抗体包含编码如seqidno:21或seqidno:22所示的氨基酸序列的核酸序列。

在一个实施方案中，编码抗zikve抗体的核苷酸序列包含分别编码seqidno:9和seqidno:10的可变vh和vl区的一个或多个密码子优化的核酸序列。在一个实施方案中，抗zikve抗体包含编码如seqidno:17或seqidno:18所示的氨基酸序列的核酸序列。

本发明的组合物可以治疗、预防和/或防御与寨卡感染相关的任何疾病、病症或病状。在某些实施方案中，所述组合物可以治疗、预防和/或防御病毒感染。在某些实施方案中，所述组合物可以治疗、预防和/或防御出生缺陷。在某些实施方案中，所述组合物可以治疗、预防和/或防御小头畸形。

合成抗体可以在施用所述组合物的受试者中治疗、预防和/或防御疾病。合成抗体可以在施用所述组合物的受试者的未受孕的孩子、未出生的孩子、胚胎或胎儿中治疗、预防和/或防御疾病。合成抗体，通过结合抗原可以在施用所述组合物的受试者中或在该受试者的未受孕的孩子、未出生的孩子、胚胎或胎儿中治疗、预防和/或防御疾病。合成抗体可以在施用所述组合物的受试者中或在该受试者的未受孕的孩子、未出生的孩子、胚胎或胎儿中促进疾病存活率。合成抗体可以在施用所述组合物的受试者中或在该受试者的未受孕的孩子、未出生的孩子、胚胎或胎儿中提供至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的疾病存活率。在其它实施方案中，合成抗体可以在施用所述组合物的受试者中或在该受试者的未受孕的孩子、未出生的孩子、胚胎或胎儿中提供至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％的疾病存活率。

所述组合物可以在向受试者施用所述组合物的至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或60小时内在受试者中引起合成抗体的产生。所述组合物可以在向受试者施用所述组合物的至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天内在受试者中引起合成抗体的产生。所述组合物可以在向受试者施用所述组合物的约1小时至约6天、约1小时至约5天、约1小时至约4天、约1小时至约3天、约1小时至约2天、约1小时至约1天、约1小时至约72小时、约1小时至约60小时、约1小时至约48小时、约1小时至约36小时、约1小时至约24小时、约1小时至约12小时或约1小时至约6小时内在受试者中引起合成抗体的产生。

所述组合物在施用给有需要的受试者时，可以比在施用抗原以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体更快地引起受试者中合成抗体的产生。所述组合物可以在施用抗原以诱导体液免疫应答的受试者中产生内源性抗体之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天引起合成抗体的产生。

本发明的组合物可具有有效组合物所需的特征，诸如安全，使得所述组合物不会引起疾病或死亡；对疾病有防御性；并且易于施用、副作用少、生物稳定性和每剂量的成本低。

3.重组核酸序列

如上所述，所述组合物可包含重组核酸序列。所述重组核酸序列可以编码所述抗体、其片段、其变体或其组合。下面更详细地描述所述抗体。

重组核酸序列可以是异源核酸序列。重组核酸序列可包括一种或多种异源核酸序列。

重组核酸序列可以是优化的核酸序列。此类优化可以增加或改变抗体的免疫原性。优化还可以改善转录和/或翻译。优化可以包括以下一种或多种：低gc含量的前导序列以增加转录；mrna稳定性和密码子优化；添加kozak序列(例如，gccacc)以增加翻译；添加编码信号肽的免疫球蛋白(ig)前导序列；添加内部ires序列并尽可能消除顺式作用序列基序(即内部tata盒)。

a.重组核酸序列构建体

重组核酸序列可包括一种或多种重组核酸序列构建体。重组核酸序列构建体可包括一个或多个在下面更详细地描述的组件。

重组核酸序列构建体可包括编码重链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体可包括编码轻链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可包括编码蛋白酶或肽酶切割位点的异源核酸序列。重组核酸序列构建体还可包括编码内部核糖体进入位点(ires)的异源核酸序列。ires可以是病毒ires或真核生物ires。重组核酸序列构建体可包括一个或多个前导序列，其中每个前导序列均编码信号肽。重组核酸序列构建体可包括一个或多个启动子、一个或多个内含子、一个或多个转录终止区、一个或多个起始密码子、一个或多个终止或停止密码子，和/或一个或多个多腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体还可包括一个或多个接头或标签序列。标签序列可以编码血凝素(ha)标签。

(1)重链多肽

重组核酸序列构建体可包括编码重链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸。重链多肽可包括可变重链(vh)区和/或至少一个恒定重链(ch)区。所述至少一个恒定重链区可包括恒定重链区1(ch1)、恒定重链区2(ch2)和恒定重链区3(ch3)和/或铰链区。

在一些实施方案中，重链多肽可包括vh区和ch1区。在其它实施方案中，重链多肽可包括vh区、ch1区、铰链区、ch2区和ch3区。

重链多肽可包括互补决定区(“cdr”)组。cdr组可含vh区的三个高变区。从重链多肽的n端开始，这些cdr分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。重链多肽的cdr1、cdr2和cdr3可以有助于抗原的结合或识别。

(2)轻链多肽

重组核酸序列构建体可包括编码轻链多肽、其片段、其变体或其组合的异源核酸序列。轻链多肽可包括可变轻链(vl)区和/或恒定轻链(cl)区。

轻链多肽可包括互补决定区(“cdr”)组。cdr组可含vl区的三个高变区。从轻链多肽的n端开始，这些cdr分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。轻链多肽的cdr1、cdr2和cdr3可以有助于抗原的结合或识别。

(3)蛋白酶切割位点

重组核酸序列构建体可包括编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列。蛋白酶切割位点可以被蛋白酶或肽酶识别。蛋白酶可以是内肽酶或内切蛋白酶，例如但不限于弗林蛋白酶(furin)、弹性蛋白酶、htra、钙蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶。蛋白酶可以是弗林蛋白酶。在其它实施方案中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶，或切割内部肽键(即，不切割n端或c端肽键)的任何蛋白酶。

蛋白酶切割位点可包括一个或多个促进或提高切割效率的氨基酸序列。所述一种或多种氨基酸序列可以促进或提高形成或产生离散多肽的效率。所述一种或多种氨基酸序列可包括2a肽序列。

(4)接头序列

重组核酸序列构建体可包括一个或多个接头序列。接头序列可以在空间上分离或连接本文所述的一个或多个组件。在其它实施方案中，接头序列可以编码在空间上分离或连接两个或更多个多肽的氨基酸序列。

(5)启动子

重组核酸序列构建体可包括一个或多个启动子。所述一个或多个启动子可以是能够驱动基因表达和调节基因表达的任何启动子。此类启动子是经由dna依赖性rna聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件。用于指导基因表达的启动子的选择取决于具体应用。在重组核酸序列构建体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，该距离的变化可以在不失去启动子功能的情况下进行调节。

启动子可以与编码重链多肽和/或轻链多肽的异源核酸序列可操作地连接。启动子可以是对于在真核细胞中的表达显示有效的启动子。与编码序列可操作连接的启动子可以是cmv启动子、来自猿猴病毒40(sv40)的启动子(例如sv40早期启动子和sv40晚期启动子)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(biv)长末端重复序列(ltr)启动子)、莫洛尼病毒(moloneyvirus)启动子、禽白血病病毒(alv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子(诸如cmv立即早期启动子)、爱泼斯坦巴尔病毒(epsteinbarrvirus，ebv)启动子或劳氏肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肌酸、人多角体蛋白或人金属硫蛋白。

启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，诱导型启动子仅在宿主细胞暴露于某些特定的外部刺激时才启动转录。在多细胞生物的情况下，启动子还可以对特定组织或器官或发育阶段有特异性。启动子也可以是天然的或合成的组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例在第us20040175727号美国专利申请公开中有描述，其内容整体并入本文。

启动子可以与增强子缔合。增强子可位于编码序列的上游。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肌酸或病毒增强子，诸如来自cmv、fmdv、rsv或ebv的增强子。多核苷酸功能增强在第5,593,972、5,962,428号美国专利和w094/016737中有描述，各自的内容通过引用全部并入。

(6)内含子

重组核酸序列构建体可包括一个或多个内含子。每个内含子可包括功能性剪接供体和受体位点。内含子可包括剪接增强子。内含子可包括有效剪接所需的一个或多个信号。

(7)转录终止区

重组核酸序列构建体可包括一个或多个转录终止区。转录终止区可以在编码序列的下游，以提供有效终止。转录终止区可以从与上述启动子相同的基因中获得，或者可以从一种或多种不同基因中获得。

(8)起始密码子

重组核酸序列构建体可包括一个或多个起始密码子。起始密码子可位于编码序列的上游。起始密码子可与编码序列同框。起始密码子可以与有效翻译起始所需的一个或多个信号(例如但不限于核糖体结合位点)缔合。

(9)终止密码子

重组核酸序列构建体可包括一个或多个终止或停止密码子。终止密码子可以在编码序列的下游。终止密码子可与编码序列同框。终止密码子可以与有效翻译终止所需的一个或多个信号缔合。

(10)多腺苷酸化信号

重组核酸序列构建体可包括一个或多个多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号可包括转录物的有效多腺苷酸化所需的一个或多个信号。多腺苷酸化信号可位于编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以是sv40多腺苷酸化信号、ltr多腺苷酸化信号、牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号、人生长激素(hgh)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。sv40多腺苷酸化信号可以是来自pcep4质粒(invitrogen,sandiego,ca)的多腺苷酸化信号。

(11)前导序列

重组核酸序列构建体可包括一个或多个前导序列。前导序列可以编码信号肽。信号肽可以是免疫球蛋白(ig)信号肽，例如但不限于igg信号肽和ige信号肽。

b.重组核酸序列构建体的排列

如上所述，重组核酸序列可包括一个或多个重组核酸序列构建体，其中每个重组核酸序列构建体均可包括一个或多个组件。以上详细描述了所述一个或多个组件。所述一个或多个组件，当包括在重组核酸序列构建体中时，可以相对于彼此以任何顺序排列。在一些实施方案中，所述一个或多个组件，可以排列在如下所述的重组核酸序列构建体中。

(1)排列1

在一种排列中，第一重组核酸序列构建体可包括编码重链多肽的异源核酸序列，第二重组核酸序列构建体可包括编码轻链多肽的异源核酸序列。

可以将第一重组核酸序列构建体置于载体中。可以将第二重组核酸序列构建体置于第二或单独的载体中。下面更详细地描述了重组核酸序列构建体在载体中的放置。

第一重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。第一重组核酸序列构建体还可包括前导序列，其中该前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由该前导序列编码的信号肽可以通过肽键与重链多肽连接。

第二重组核酸序列构建体还可包括启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。第二重组核酸序列构建体还可包括前导序列，其中该前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由该前导序列编码的信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列1的一个实例可包括编码包括vh和ch1的重链多肽的第一载体(并因此包括第一重组核酸序列构建体)，和编码包括vl和cl的轻链多肽的第二载体(并因此包括第二重组核酸序列构建体)。排列1的第二个实例可包括编码包括vh、ch1、铰链区、ch2和ch3的重链多肽的第一载体(并因此包括第一重组核酸序列构建体)，和编码包括vl和cl的轻链多肽的第二载体(并因此包括第二重组核酸序列构建体)。

(2)排列2

在第二种排列中，重组核酸序列构建体可包括编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列。编码重链多肽的异源核酸序列可位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。或者，编码轻链多肽的异源核酸序列可位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。

可以将重组核酸序列构建体置于载体中，如下文更详细描述的。

重组核酸序列构建体可包括编码蛋白酶切割位点和/或接头序列的异源核酸序列。如果包括在重组核酸序列构建体中，则编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列可位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。因此，蛋白酶切割位点允许在表达时将重链多肽和轻链多肽分离成不同的多肽。在其它实施方案中，如果在重组核酸序列构建体中包括接头序列，则接头序列可位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

重组核酸序列构建体还可以包括启动子、内含子、转录终止区、起始密码子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。重组核酸序列构建体可包括一个或多个启动子。重组核酸序列构建体可包括两个启动子，使得一个启动子可与编码重链多肽的异源核酸序列缔合，第二启动子可与编码轻链多肽的异源核酸序列缔合。在其它实施方案中，重组核酸序列构建体可包括一个与编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列缔合的启动子。

重组核酸序列构建体还可包括两个前导序列，其中第一前导序列位于编码重链多肽的异源核酸序列的上游(或5')，第二前导序列位于编码轻链多肽的异源核酸序列的上游(或5')。因此，由第一前导序列编码的第一信号肽可以通过肽键与重链多肽连接，由第二前导序列编码的第二信号肽可以通过肽键与轻链多肽连接。

因此，排列2的一个实例可包括编码包括vh和ch1的重链多肽，以及包括vl和cl的轻链多肽的载体(并因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

2的排列的第二个实例可包括编码包括vh和ch1的重链多肽，以及包括vl和cl的轻链多肽的载体(并因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

排列2的第三个实例可包括编码包括vh、ch1、铰链区、ch2和ch3的重链多肽，以及包含vl和cl的轻链多肽的载体(并因此包括重组核酸序列构建体)，其中接头序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

2的排列的第四个实例可包括编码包括vh、ch1、铰链区、ch2和ch3的重链多肽，以及包括vl和cl的轻链多肽的载体(并因此包括重组核酸序列构建体)，其中编码蛋白酶切割位点的异源核酸序列位于编码重链多肽的异源核酸序列和编码轻链多肽的异源核酸序列之间。

c.来自重组核酸序列构建体的表达

如上所述，在所述一个或多个组件中，重组核酸序列构建体可以包括编码重链多肽的异源核酸序列和/或编码轻链多肽的异源核酸序列。因此，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和/或轻链多肽的表达。

当利用如上所述的排列1时，第一重组核酸序列构建体可以促进重链多肽的表达，第二重组核酸序列构建体可以促进轻链多肽的表达。当利用如上所述的排列2时，重组核酸序列构建体可以促进重链多肽和轻链多肽的表达。

在表达时，例如但不限于，在细胞、生物体或哺乳动物中表达时，重链多肽和轻链多肽可以组装成合成抗体。具体而言，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得组装产生能够结合抗原的合成抗体。在其它实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得组装产生与未如本文所述组装的抗体相比，更具免疫原性的合成抗体。在其它实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此相互作用，使得组装产生能够引发或诱导针对抗原的免疫应答的合成抗体。

d.载体

上述重组核酸序列构建体可以置于一种或多种载体中。所述一种或多种载体可含有复制起点。所述一种或多种载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述一种或多种载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

所述一种或多种载体可以是异源表达构建体，所述异源表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体处于细胞内，由重组核酸序列构建体所编码的重链多肽和/或轻链多肽就由细胞转录和翻译机制核糖体复合物产生。所述一种或多种载体可以表达大量稳定的信使rna，并因此表达蛋白质。

(1)表达载体

所述一种或多种载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中的表达。包含重组核酸序列构建体的所述一种或多种载体可以是嵌合的，这意味着其至少一个组件相对于其至少一个其它组件是异源的。

(2)质粒

所述一种或多种载体可以是质粒。该质粒可用于用重组核酸序列构建体转染细胞。该质粒可用于将重组核酸序列构建体引入受试者中。该质粒还可以包含调控序列，其可以非常适合于在其中施用了该质粒的细胞中进行基因表达。

该质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以便将质粒保持在染色体外并在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自invitrogen(sandiego,ca)的pvax1、pcep4或prep4，其可以包含爱泼斯坦巴尔病毒复制起点和核抗原ebna-1编码区，其可以产生高拷贝游离型复制而不整合。质粒的主链可以是pav0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(ad5)质粒。

质粒可以是pse420(invitrogen,sandiego,calif.)，其可用于在大肠杆菌(e.coli)中产生蛋白质。质粒也可以是pyes2(invitrogen,sandiego,calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。质粒也可以是maxbac^tm完整杆状病毒表达系统(invitrogen,sandiego,calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒也可以是pcdnai或pcdna3(invitrogen,sandiego,calif.)，其可用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生蛋白质。

(3)rna

在一个实施方案中，所述核酸为rna分子。在一个实施方案中，rna分子是由本文所述的dna序列转录而来的。例如，在一些实施方案中，rna分子由与seqidno:24、26、28、30或32之一至少90％同源的dna序列编码。在另一个实施方案中，核苷酸序列包含由编码seqidno:1-23、25、27、29、31或33的多肽序列或其变体或其片段的dna序列转录而来的rna序列。因此，在一个实施方案中，本发明提供了编码一种或多种dmab的rna分子。rna可以是正链。因此，在一些实施方案中，rna分子可以被细胞翻译而无需任何插入的复制步骤，诸如逆转录。可用于本发明的rna分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强rna的体内翻译。可用于本发明的rna分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽的rna中，这可以经由5'至5'桥与7-甲基鸟苷连接。rna分子可具有3'poly-a尾。它还可以在其3'末端附近包含poly-a聚合酶识别序列(例如aauaaa)。可用于本发明的rna分子可以是单链的。可用于本发明的rna分子可包含合成rna。在一些实施方案中，rna分子是裸rna分子。在一个实施方案中，rna分子包含在载体内。

在一个实施方案中，rna具有5'和3'utr。在一个实施方案中，5'utr的长度为0至3000个核苷酸。待添加到编码区的5'和3'utr序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计用于退火至utr的不同区域的pcr的引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以改变在转染转录的rna后实现最佳翻译效率所需的5'和3'utr长度。

5'和3'utr可以是目标基因的天然存在的内源5'和3'utr。或者，可以通过将utr序列并入正向和反向引物中或通过模板的任何其它修饰来添加并非目标基因内源的utr序列。使用并非目标基因内源的utr序列可用于改变rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'utr序列中富含au的元件可降低rna的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的utr的性质来选择或设计3'utr以增加转录的rna的稳定性。

在一个实施方案中，5'utr可含有内源基因的kozak序列。或者，当如上所述通过pcr添加并非目标基因内源的5'utr时，可以通过添加5'utr序列来重新设计共有kozak序列。kozak序列可以提高一些rna转录物的翻译效率，但似乎并不是所有rna实现有效翻译都需要。对于许多rna而言对kozak序列的需要是本领域已知的。在其它实施方案中，5'utr可以源自其rna基因组在细胞中稳定的rna病毒。在其它实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'utr中以阻止rna被核酸外切酶降解。

在一个实施方案中，rna具有5'末端的帽和3'poly(a)尾，其决定了细胞中的核糖体结合、翻译起始和rna稳定性。

在一个实施方案中，rna是核苷修饰的rna。核苷修饰的rna相对于未修饰的rna具有特别的优势，包括例如稳定性增加、先天免疫原性低或不存在及翻译增强。

(4)环状载体和线性载体

所述一种或多种载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。载体可以是pvax、pcdna3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。

本文还提供了线性核酸或线性表达盒(“lec”)，其能够经由电穿孔有效递送至受试者并表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽。lec可以是没有任何磷酸主链的任何线性dna。lec可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。lec可以不含与所需基因表达无关的其它核酸序列。

lec可源自能够线性化的任何质粒。质粒可以是能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的。质粒可以是pnp(puertorico/34)或pm2(newcaledonia/99)。质粒可以是wlv009、pvax、pcdna3.0或provax，或能够表达由重组核酸序列构建体编码的重链多肽和/或轻链多肽的任何其它表达载体。

lec可以是pcrm2。lec可以是pcrnp。pcrnp和pcrmr可以分别源自pnp(puertorico/34)和pm2(newcaledonia/99)。

(5)病毒载体

在一个实施方案中，本文提供了能够将本发明的核酸递送至细胞的病毒载体。表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如在sambrook等人(2001)和ausubel等人(1997)中，以及在其它病毒学和分子生物学手册中有描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记物。(参见，例如，wo01/96584；wo01/29058；和第6,326,193号美国专利。病毒载体，特别是逆转录病毒载体已经成为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如第5,350,674和5,585,362号美国专利。

(6)制备载体的方法

本文提供了用于制备一种或多种载体的方法，所述载体中已经放置了重组核酸序列构建体。在最终亚克隆步骤后，可以使用本领域已知的方法，将载体用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

在其它实施方案中，在最终亚克隆步骤后，载体可以与一种或多种电穿孔(ep)装置一起使用。下面更详细地描述ep装置。

可以使用已知装置和技术的组合来配制或制造所述一种或多种载体，但优选地，使用质粒制造技术制造，该技术在2007年5月23日提交的已授权的、共同未决的系列号为60/939,792的美国临时申请中有描述。在一些实例中，本文所述的dna质粒可以以大于或等于10mg/ml的浓度配制。除了美国系列号60/939792中描述的那些之外，制造技术还包括或结合了本领域普通技术人员公知的各种装置和方案，包括在授权专利，即2007年7月3日发布的第7,238,522号美国专利中描述的那些。以上提到的申请和专利，分别为美国系列号60/939,792和第7,238,522号美国专利，据此整体并入。

4.抗体

如上所述，重组核酸序列可以编码抗体、其片段、其变体或其组合。抗体可以与抗原结合或反应，这在下面更详细地描述。

抗体可以包含重链和轻链互补决定区(“cdr”)组，其分别插入为cdr提供支撑并限定cdr相对于彼此的空间关系的重链和轻链框架(“fr”)组之间。cdr组可含重链或轻链v区的三个高变区。从重链或轻链的n端开始，这些区域分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。因此，抗原结合位点可包括六个cdr，包括来自重链和轻链v区中的每一个的cdr组。

蛋白水解酶即木瓜蛋白酶优先切割igg分子以产生几个片段，其中两个(f(ab)片段)各自包含共价异二聚体，该共价异二聚体包括完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够切割igg分子以提供几个片段，包括f(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是fab或f(ab')2。fab可包括重链多肽和轻链多肽。fab的重链多肽可包括vh区和ch1区。fab的轻链可包括vl区和cl区。

抗体可以是免疫球蛋白(ig)。ig可以是例如iga、igm、igd、ige和igg。免疫球蛋白可包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包括vh区、ch1区、铰链区、ch2区和ch3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包括vl区和cl区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟的抗体、人抗体、人源化抗体或全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的结合所需抗原的抗体，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(cdr)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。

抗体可以是如下面更详细描述的双特异性抗体。抗体可以是也如下面更详细描述的双功能抗体。

如上所述，在将组合物施用给受试者后，可以在受试者中产生抗体。抗体可在受试者体内具有一定半衰期。在一些实施方案中，可以修饰抗体以延长或缩短其在受试者体内的半衰期。下面更详细地描述了此类修饰。

可以如下面更详细描述的那样对抗体进行去岩藻糖基化。

可以修饰抗体以减少或防止与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ade)，如下面更详细描述的。

a.双特异性抗体

重组核酸序列可以编码双特异性抗体、其片段、其变体或其组合。双特异性抗体可以与两种抗原(例如，下面更详细描述的两种抗原)结合或反应。双特异性抗体可以由本文所述的两种抗体的片段组成，从而允许双特异性抗体与两种期望的靶分子结合或反应，所述靶分子可以包括下面更详细地描述的抗原、配体(包括受体的配体)、受体(包括受体上的配体结合位点)、配体-受体复合物和标记物。

b.双功能抗体

重组核酸序列可以编码双功能抗体、其片段、其变体或其组合。双功能抗体可以与下述抗原结合或反应。也可以修饰双功能抗体以赋予抗体除识别和结合抗原以外的附加功能。此类修饰可包括但不限于与因子h或其片段偶联。因子h是补体激活的可溶性调节因子，因此可经由补体介导的裂解(cml)促成免疫应答。

c.延长抗体半衰期

如上所述，可以修饰抗体以延长或缩短抗体在受试者体内的半衰期。修饰可以延长或缩短受试者血清中抗体的半衰期。

修饰可以存在于抗体的恒定区中。修饰可以是抗体恒定区中的一个或多个氨基酸取代，其使该抗体的半衰期与不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比延长。修饰可以是抗体ch2结构域中的一个或多个氨基酸取代，其使该抗体的半衰期与不含所述一个或多个氨基酸取代的抗体的半衰期相比延长。

在一些实施方案中，恒定区中的所述一个或多个氨基酸取代可以包括用酪氨酸残基置换恒定区中的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基置换恒定区中的丝氨酸残基，用谷氨酸残基置换恒定区中的苏氨酸残基，或其任何组合，从而延长抗体的半衰期。

在其它实施方案中，恒定区中的所述一个或多个氨基酸取代可以包括用酪氨酸残基置换ch2结构域中的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基置换ch2结构域中的丝氨酸残基，用谷氨酸残基置换ch2结构域中的苏氨酸残基，或其任何组合，从而延长抗体的半衰期。

d.去岩藻糖基化

重组核酸序列可以编码未岩藻糖基化的抗体(即，去岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)、其片段、其变体或其组合。岩藻糖基化包括向分子添加岩藻糖，例如，将岩藻糖附接至n-聚糖、o-聚糖和糖脂。因此，在去岩藻糖基化抗体中，岩藻糖未附接至恒定区的碳水化合物链。反过来，与岩藻糖基化抗体相比，这种岩藻糖基化的缺乏可以改善抗体的fcγriiia结合和抗体定向细胞毒性(adcc)活性。因此，在一些实施方案中，与岩藻糖基化抗体相比，非岩藻糖基化抗体可表现出增加的adcc活性。

可以修饰抗体以便防止或抑制抗体岩藻糖基化。在一些实施方案中，与未修饰的抗体相比，此类经修饰的抗体可以表现出增加的adcc活性。修饰可以是在重链、轻链中或其组合。修饰可以是重链中的一个或多个氨基酸取代、轻链中的一个或多个氨基酸取代，或其组合。

e.降低的ade应答

可以修饰抗体以降低或防止与抗原相关的疾病的抗体依赖性增强(ade)，但仍然中和抗原。

在一些实施方案中，可以将抗体修饰为包括一个或多个减少或阻止抗体与fcγr1a结合的氨基酸取代。所述一个或多个氨基酸取代可以在抗体的恒定区中。所述一个或多个氨基酸取代可包括在抗体恒定区中用丙氨酸残基置换亮氨酸残基，即，本文也称为la、la突变或la取代。所述一个或多个氨基酸取代可包括在抗体恒定区中将两个亮氨酸残基各自用丙氨酸残基置换，并且在本文中也称为lala、lala突变或lala取代。lala取代的存在可以防止或阻断抗体与fcγr1a的结合，因此，经修饰的抗体不会增强或引起与抗原相关的疾病的ade，但仍然会中和抗原。

5.抗原

合成抗体针对抗原或其片段或变体。抗原可以是核酸序列、氨基酸序列、多糖或其组合。所述核酸序列可以是dna、rna、cdna、其变体、其片段或其组合。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。所述多糖可以是核酸编码的多糖。

所述抗原可以来自病毒。所述抗原可与病毒感染相关。在一个实施方案中，所述抗原可与寨卡感染相关。在一个实施方案中，所述抗原可以是寨卡包膜蛋白。

在一个实施方案中，本发明的合成抗体靶向两种或更多种抗原。在一个实施方案中，双特异性抗体的至少一种抗原选自本文所述的抗原。在一个实施方案中，所述两种或更多种抗原选自本文所述的抗原。

a.病毒抗原

病毒抗原可以是病毒抗原或其片段或变体。病毒可以是致病病毒。病毒可以是寨卡病毒。

抗原可以是寨卡病毒抗原，或其片段或其变体。该寨卡抗原可以来自允许病毒复制、感染或存活的因子。允许寨卡病毒复制或存活的因子包括但不限于结构蛋白和非结构蛋白。此类蛋白质可以是包膜蛋白。

在一个实施方案中，包膜蛋白是zikve蛋白。

6.组合物的赋形剂和其它组分

所述组合物还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，诸如媒介物、载体或稀释剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂(诸如免疫刺激复合物(iscoms))、弗氏不完全佐剂(freundsincompleteadjuvant)、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁肽、醌类似物、囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸盐(lgs))或脂质。转染促进剂是聚-l-谷氨酸盐，并且聚-l-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂(诸如免疫刺激复合物(iscoms))、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可连同组合物一起施用来使用。所述组合物还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，如dna-脂质体混合物(参见例如w09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸盐(lgs))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

所述组合物还可包含如1994年4月1日提交的美国系列号021,579中所描述的基因促进剂，所述专利文献通过引用全部并入。

组合物可包含dna，其量为约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；或优选约0.1微克至约10毫克；或更优选约1毫克至约2毫克。在一些优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含约5纳克至约1000微克的dna。在一些优选的实施方案中，所述组合物可含有约10纳克至约800微克的dna。在一些优选的实施方案中，所述组合物可含有约0.1至约500微克的dna。在一些优选的实施方案中，所述组合物可含有约1至约350微克的dna。在一些优选的实施方案中，所述组合物可含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克至约10毫克；约0.1微克至约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的dna。

可以根据待使用的施用方式来配制所述组合物。可注射的药物组合物可以是无菌、无热原并且无微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。等渗添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述组合物可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。所述组合物还可包含稳定剂(包括明胶和白蛋白)。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下长时间稳定，所述稳定剂包括lgs或聚阳离子或聚阴离子。

7.产生合成抗体的方法

本发明还涉及产生合成抗体的方法。该方法可包括通过使用下面更详细描述的递送方法将组合物施用给有需要的受试者。因此，在将组合物施用给受试者后，在受试者中或在体内产生合成抗体。

该方法还可包括将组合物引入一种或多种细胞中，因此可以在所述一种或多种细胞中产生或生成合成抗体。该方法还可包括将组合物引入一种或多种组织，例如但不限于皮肤和肌肉中，因此可以在所述一种或多种组织中产生或生成合成抗体。

8.鉴定或筛选抗体的方法

本发明进一步涉及鉴定或筛选上述抗体的方法，上述抗体与上述抗原反应或结合。鉴定或筛选抗体的方法可以使用本领域技术人员已知的方法中的抗原来鉴定或筛选抗体。此类方法可包括但不限于从文库中选择抗体(例如，噬菌体展示)和动物免疫，然后分离和/或纯化抗体。

9.组合物的递送方法

本发明还涉及将组合物递送至有需要的受试者的方法。所述递送方法可包括向受试者施用组合物。施用可包括但不限于，用和不用体内电穿孔的dna注射、脂质体介导的递送和纳米颗粒促进的递送。

接受组合物递送的哺乳动物可以是人、灵长类动物、非人灵长类动物、母牛、牛、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠和鸡。

组合物可以通过不同途径施用，包括口服、胃肠外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过口腔施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合。对于兽医用途，该组合物可以按照正常的兽医实践作为适当可接受的制剂施用。兽医可以容易地确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。该组合物可以通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪(microprojectilebombardmentgoneguns)”或其它物理方法诸如电穿孔(“ep”)、“流体动力学方法”或超声波来施用。

a.电穿孔

通过电穿孔施用组合物可以使用电穿孔装置完成，所述电穿孔装置可以配置成将有效地引起在细胞膜中形成可逆孔隙的能量脉冲递送至哺乳动物的期望组织，并且优选能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件。电穿孔组件可包括并且并入电穿孔装置的各种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源和电源开关。可以使用体内电穿孔装置，例如cellectraep系统(inoviopharmaceuticals,plymouthmeeting,pa)或elgen电穿孔仪(inoviopharmaceuticals,plymouthmeeting,pa)来完成电穿孔，以促进质粒对细胞的转染。

电穿孔组件可以充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔组件连通的单独元件(或组件)。电穿孔组件可以充当电穿孔装置的一个以上的元件，其可以和与电穿孔装置分离的电穿孔装置的其它元件连通。作为一个机电或机械装置的部分而存在的电穿孔装置的元件可以不受限制，因为这些元件可以充当一个装置或充当彼此连通的单独元件。电穿孔组件可以能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极部件可包括在空间排列上具有多个电极的电极阵列，其中电极部件从电穿孔组件接收能量脉冲并通过电极将其递送到期望的组织。在递送能量脉冲期间，多个电极中的至少一个是中性的，并测量期望组织中的阻抗，并将该阻抗传达给电穿孔组件。反馈机制可以接收测量的阻抗并且可以调节由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。所述多个电极可以通过在编程序列下控制电极以分散模式递送能量脉冲，并且编程序列是由用户输入到电穿孔组件中的。编程序列可包括按顺序递送的多个脉冲，其中所述多个脉冲中的每个脉冲由至少两个有源电极(其中一个中性电极测量阻抗)递送，并且其中所述多个脉冲的后续脉冲由至少两个有源电极(其中一个中性电极测量阻抗)中不同的一个电极递送。

反馈机制可以通过硬件或软件执行。反馈机制可以通过模拟闭环电路执行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选为实时反馈或瞬时性的(即，如通过用于确定响应时间的可用技术所确定的，为基本瞬时性的)。中性电极可以测量期望组织中的阻抗并将该阻抗传达给反馈机制，反馈机制响应于该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值。反馈机制可以在递送能量脉冲期间连续且瞬时地维持恒定电流。

可以促进本发明的组合物递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在draghia-akli等人的第7,245,963号美国专利，smith等人提交的美国专利公布2005/0052630中描述的那些，其内容据此通过引用整体并入本文。可用于促进组合物递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括在2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，该美国专利申请根据美国法典第35篇第119(e)条要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的利益，所有申请都据此整体并入。

draghia-akli等人的第7,245,963号美国专利描述了模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒流脉冲控制器到所述多个针电极的导电链路的电连接器；以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的所述多个针电极并将其牢牢地插入到身体或植物中的选定组织中。然后经由皮下针将生物分子递送到选定组织中。启动可编程恒流脉冲控制器，并将恒流电脉冲施加到所述多个针电极。所施加的恒流电脉冲促进将生物分子引入到所述多个电极之间的细胞中。第7,245,963号美国专利的全部内容据此通过引用并入。

smith等人提交的美国专利公布2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可用于有效地促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞中。该电穿孔装置包括其操作由软件或固件指定的电动装置(“ekd装置”)。ekd装置基于用户控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒流脉冲模式，并允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可更换电极盘，用于注射针的中央注射通道和可移除的导向盘。美国专利公布2005/0052630的全部内容据此通过引用并入。

第7,245,963号美国专利和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法可以适用于不仅深入穿透诸如肌肉的组织，而且还深入穿透其它组织或器官。由于该电极阵列的构造，注射针(用于递送所选择的生物分子)也完全插入靶器官中，并且注射是在由电极预先界定的区域中垂直于靶组织进行施用。第7,245,963号美国专利和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。

另外，在一些实施方案中考虑整合电穿孔装置及其用途，存在为以下专利中描述的那些的电穿孔装置：1993年12月28日发布的美国专利5,273,525、2000年8月29日发布的美国专利6,110,161、2001年7月17日发布的美国专利6,261,281和2005年10月25日发布的美国专利6,958,060以及2005年9月6日发布的美国专利6,939,862。此外，本文考虑到了覆盖2004年2月24日发布的美国专利6,697,669(其涉及使用多种装置中的任一种递送dna)和2008年2月5日发布美国专利7,328,064(其涉及注射dna的方法)中提供的主题的专利。上述专利通过引用整体并入。

10.治疗方法

本文还提供了一种通过在有需要的受试者中产生合成抗体来治疗、防御和/或预防该受试者的疾病的方法。该方法可包括向受试者施用所述组合物。可以使用上述递送方法向受试者施用组合物。

在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗、防御和/或预防疏螺旋体(borreliaspp)感染的方法。在一个实施方案中，该方法治疗、防御和/或预防莱姆病(lymedisease)。

在受试者中产生合成抗体后，合成抗体可以与抗原结合或反应。此类结合可以中和抗原，阻断另一分子(例如蛋白质或核酸)对抗原的识别，并引发或诱导对抗原的免疫应答，从而治疗、防御和/或预防受试者中与抗原相关的疾病。

组合物剂量可以介于1μg至10mg活性组分/kg体重/次之间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/次。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用一次组合物。用于有效治疗的组合物剂数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

11.与抗生素组合使用

本发明还提供了通过施用合成抗体和治疗性抗生素剂的组合来治疗、防御和/或预防有需要的受试者的疾病的方法。

合成抗体和抗生素剂可以使用任何合适的方法施用，使得合成抗体和抗生素剂的组合都存在于受试者中。在一个实施方案中，该方法可包括通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第一组合物，并且在合成抗体施用后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天，施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第一组合物，并且在合成抗体施用后超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天、超过9天或超过10天，施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括施用包含抗生物剂的第一组合物，并且在抗生素剂施用后少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天或少于10天，通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括施用包含抗生物剂的第一组合物，并且在抗生素剂施用后超过1天、超过2天、超过3天、超过4天、超过5天、超过6天、超过7天、超过8天、超过9天或超过10天，通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第一组合物并同时施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括通过上文详细描述的任何方法施用包含本发明的合成抗体的第一组合物并同时施用包含抗生素剂的第二组合物。在一个实施方案中，该方法可包括施用包含本发明的合成抗体和抗生素剂的单一组合物。

可以与本发明的合成抗体组合使用的抗生素的非限制性实例包括氨基糖苷类(例如庆大霉素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、妥布霉素(tobramycin))、喹诺酮类(例如环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin))、头孢菌素(例如头孢他啶(ceftazidime)，头孢吡肟(cefepime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢托罗(ceftobiprole))、抗假单胞菌青霉素：羧苄青霉素(例如羧苄西林(carbenicillin)和替卡西林(ticarcillin))和脲基青霉素(例如美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin))、碳青霉烯类(例如美罗培南(meropenem)、亚胺培南(imipenem)、多利培南(doripenem))、多粘菌素(例如多粘菌素b和粘杆菌素(colistin))和单内酰环类(例如氨曲南(aztreonam))。

本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实例来说明。

12.在体外和离体产生合成抗体

在一个实施方案中，在体外或离体产生合成抗体。例如，在一个实施方案中，可以在体外或离体细胞中引入并表达编码合成抗体的核酸。将基因引入细胞内并使其表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。

用于将多核苷酸引入宿主细胞内的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。例如，参见sambrook等人(2012,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。将多核苷酸引入宿主细胞内的优选方法是磷酸钙转染。

将目标多核苷酸引入宿主细胞内的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物例如人细胞内最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如第5,350,674和5,585,362号美国专利。

用于将多核苷酸引入宿主细胞内的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。

在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接于脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质合并，作为悬浮液包含在脂质中，被胶束包含或复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体缔合组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以呈双层结构、胶束或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类别。

13.实施例

本发明在以下实施例进一步进行说明。应当理解，这些实施例虽然表明了本发明的优选实施方案，但它们仅以说明的方式给出。从上文的讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的必要特性，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种变化和修改以便使其适应于各种用法和条件。因此，除了本文示出和描述的那些之外，从以上描述中，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将显而易见。旨在使此类修改落入所附权利要求的范围之内。

实施例1

本文提出的研究证明通过质粒dna的肌内电穿孔产生了功能性抗寨卡“dna单克隆抗体”(dmab)。将来自抗寨卡单克隆抗体的经密码子优化的可变区dna序列合成到人igg1恒定结构域上。将编码抗体的质粒dna递送至c3h小鼠。该研究支持dmab作为现有生物疗法的替代方案。

zikv-env(zikv-e)蛋白是具有融合环的505个氨基酸的蛋白质(图1)。针对zikv-e蛋白的抗体通过表达重链和轻链的dna单克隆抗体(dmab)在体内表达(图2)。zikv-env特异性单克隆抗体1c2a6、1d4g7、2b7d7、3f12e9、4d6e8、5e6d9、6f9d1、9d10f4、8a9f9和9f7e1各自在体外结合zikv-env(图3-4)。单克隆抗体在vh和vl链中显示出不同程度的序列同源性(图5-7)。1d4g7的大vhcdr3清晰可见，其它cdr和框架区中的几个其它折叠差异也是如此。尽管3f12e9具有序列趋异性，但它在整体序列和构象上与1c2a6、8d10f4和8a9f9仍然比与1d4g7更接近。(图7)。由于其cdr3环较大，1d4g7在vh和vl结构域之间缺少裂隙。序列相似性转化为结构相似性，因此根据先前证明的聚类，整体cdr构象和分子形状是保守的。(图8)。1c2a6在cdr的远端具有暴露于表面上的游离cys残基。在vhfr2区中存在另一个潜在的相关差异。该残基不直接参与cdr构象，但确实影响局部残基包装。在imgt定义的cdr区内发生两个变化。vl变化(f、f、s)直接影响vl-vh界面。(图9)。游离cys让高度可修饰的化学基团暴露在分子表面。(图10)。1d4g7的可展性指数(developabilityindex)最高，这很可能是由于长cdr3环含有多个非极性残基。然而，根据过去的经验，仅这一点似乎不成问题(图11)。基于高度相似性，1c2a6、8d10f4和8a9f9可能以相同的基本模式结合相同表位。三个序列之间的小差异包括1c2a6上暴露的游离cys残基和8d10f4的vh-vl界面处预测的pi相互作用的数量减少。3f12e9与1c2a6、8d10f4和8a9f9在cdr区中具有相似性，但也有几个重要差异。mab1d4g7可能以与上述其它mab不同的模式结合或与完全不同的表位结合。

实施例2

寨卡疫苗方法

如图13所示，产生了寨卡抗原表达构建体，其中示出了主链。将表达盒插入cmv启动子后面并带有拖尾的多腺苷酸化尾。该盒可包括图14中所示抗原的编码序列，包括prme、ns1和衣壳。

寨卡prme的系统发育分析与疫苗设计

进行系统发育分析，如图16和17所示。星形示出了共有序列prme序列seqidno:3的位置。显示该共有序列prme插入根据图18的表达载体中的克隆位点。

通过蛋白质印迹分析表征表达的蛋白质，如图20a和20b所示，其示出了与抗黄病毒抗体的特异性结合。

然后纯化蛋白质，如图21a和21b所示。

小鼠免疫

动物-balb/c小鼠(8只一组)

质粒-寨卡-prme(包括seqidno:2在内的编码序列)

装置-3p电穿孔装置(inoviopharmaceuticals,plymouthmeeting,pa)

免疫计划：

用dna对小鼠总共进行3次免疫：第0天一次(初免)，并在第14天和第28天加强免疫。在dna第3次免疫后一周进行免疫分析。

注射方法-肌肉注射

放血计划-放血前(pre-bleed)和第14、28和35天

放血方法-眶后

分组和动物-10只动物/组x3组＝30只

1)pvax1

2)pvax-1寨卡preme(seqidno:2)

寨卡prme疫苗引发的细胞免疫应答

通过针对包括prme抗原的肽库进行ifn-gelispot测定来评估刺突特异性cd8t淋巴细胞应答。见图22和23。每个组中的平均应答是在第三次免疫之后一周的。误差条表示标准误差。示出了对pvax对照的应答。

在小鼠中抗体的诱导

小鼠接种寨卡prme疫苗引发与寨卡-包膜抗原起反应的阳性抗体应答。见图24和25。

基于与重组蛋白e抗原的结合，发现寨卡prme疫苗在小鼠中具有免疫原性。通过蛋白质印迹分析和elisa在免疫动物中观察到血清转化。

实施例3

本文描述了一种新的的基于合成dna共有序列的疫苗，其靶向寨卡病毒的前体膜+包膜蛋白。在确认构建体表达后，通过电穿孔使小鼠和非人灵长类动物免疫，显示在已接种动物中诱导了具有中和活性的细胞免疫和体液免疫。在ifn-α/βr^-/-小鼠中，在这种致死性攻击模型中，单次或双次注射免疫对体重减轻或死亡具有100％防御性。这是首个批准用于人体试验的寨卡病毒疫苗。

现在描述材料和方法。

细胞、病毒和动物

将人胚肾(hek)293t(美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection，atcc)#crl-n268,manassas,va)和veroccl-81(atcc#ccl-81)细胞保持在补充了10％胎牛血清(fbs)及1％青霉素和链霉素的杜尔贝科改良的伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem；gibco-invitrogen)中，并使其在融合后传代。将神经元肿瘤细胞系sk-n-sh(atcchtb-11)和u87mg(atcchtb-14)保持在补充了10％胎牛血清(fbs)及1％青霉素和链霉素的伊格尔最低必需培养基(mem；corning-cellgro)中，并使其在融合后传代。使寨卡病毒株mr766(来自susanweiss博士的友好礼物)和pr209(bioqual,md)在vero细胞中扩增，并通过对vero细胞进行标准噬斑测定来滴定原液。

c57/bl6和ifnar^-/-小鼠及恒河猴程序在氯胺酮麻醉下进行。在受控的湿度、温度和光照(12小时光照/12小时黑暗循环)条件下，将动物圈养在允许社交互动的相邻的单独灵长类动物笼中。食物和水可随意获得。每天监测动物两次，每天喂食商业猴子食物、零食和水果两次。

dna疫苗构建体及合成

寨卡prm+env质粒dna构建体编码全长膜前体(prm)和包膜(e)蛋白。使用共有策略并通过比对当前寨卡prm+e蛋白序列来确定共有序列。对疫苗插入序列(insert)进行遗传优化(即密码子和rna优化)以增强在人中的表达，并添加ige前导序列以促进表达。该构建体是商业合成的(genscript,nj)，然后如先前所述(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)，将该构建体亚克隆到处于巨细胞病毒立即早期启动子的控制下的经修饰的pvax1表达载体中。最终构建体命名为zikv-prme疫苗，并且对照质粒主链为pvax1。另外，还设计了编码mr766和2016brazilin爆发株的prm和env基因的许多其他匹配的dna构建体用于进一步评价。由inovio(plymouthmeeting,pa)进行dna构建体的大规模扩增，并将纯化的质粒dna配制在水中用于免疫。通过琼脂糖凝胶电泳确认dna插入序列的大小。通过使用mega第5版软件用clustalw进行多重比对来进行系统发育分析(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)。

dna免疫和电穿孔

小鼠免疫原性研究：经体内ep递送，将25μg的dna于总体积为20或30μl的水中递送到胫骨前肌中，使雌性c57bl/6小鼠(6至8周龄)和ifnar^-/-小鼠(5至7周龄)免疫(n＝4)。免疫后立即使用cellectra自适应恒流ep装置(inoviopharmaceuticals,pa)在相同部位递送体内ep。将三叉cellectra微创装置插入肌肉内～2mm。通过由26号规格的实心不锈钢电极组成的三角形3电极阵列递送方波脉冲，并且递送两个0.1安培的恒流脉冲，52微秒/脉冲，间隔1秒延迟。先前已经详细描述了使用ep的其它方案17。以两周的间隔使小鼠免疫三次，并在最后一次免疫后1周处死。在每次免疫后收集血液用于分析细胞和体液免疫应答(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)。恒河猴免疫原性研究：5只恒河猴在2个部位用2mgzikv-prme疫苗以4周间隔经皮内免疫两次。立即使用与针对小鼠免疫描述的相同的装置递送ep。

在ifnar^-/-小鼠中的攻击研究

将ifnar^-/-小鼠分成三组。第一组小鼠免疫一次，并在免疫后2周用106pfuzikvpr209攻击。第二组小鼠以两周间隔免疫两次，并在第二次免疫后1周用106pfuzikvpr209攻击。第三组小鼠以两周间隔免疫两次，并在第二次免疫后1周用2x106pfuzikvpr209攻击。攻击后，对动物称重并通过皮下安设的温度芯片每天测量体温。另外，观察其疾病的临床体征，每天两次(活动能力降低；弓背姿势；后肢关节行走(部分麻痹)，一侧后肢麻痹或双侧后肢麻痹)。基于公益角度的安乐死标准由20％的体重减轻或观察到任何异常的临床体征组成。

蛋白质印迹和免疫荧光测定

对于体外表达研究，使用genejammer试剂，按照制造商的方案(agilent)进行转染。简言之，使细胞在35-mm培养皿中生长至50％融合，并用1ug寨卡prme疫苗转染。转染后2天收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，并用细胞裂解缓冲液(cellsignalingtechnology)裂解。如先前所述(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)，使用蛋白质印迹验证来自收获的细胞裂解物的寨卡prem+env蛋白的表达。

使用蛋白质印迹分析确认小鼠和rm免疫血清的特异性。向3-12％bis-trisnupage凝胶(lifetechnologies)中装载5μg或1ugzikvenv重组蛋白和odyssey蛋白分子量标记物(产品#928-40000)。使凝胶在mops缓冲液中在200v下运行50分钟。使用iblot2凝胶转移装置(lifetechnologies)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在室温下将膜在pbsodyssey封闭缓冲液(li-corbiosciences)中封闭1小时。将抗黄病毒类抗原(mab10216-克隆d1-4g2-4-15)抗体以1:500稀释以检测疫苗表达，并将来自小鼠和rm的免疫血清1:50稀释于含0.2％tween20(bio-rad)的odyssey封闭缓冲液中并在4℃下与膜一起温育过夜。将该膜用pbst洗涤，然后与针对小鼠血清以1:15,000稀释的适当的二抗[用于小鼠血清的山羊抗小鼠irdye680cw(licor)和黄病毒抗体；及用于rm血清的山羊抗人irdye800cw(licor)]一起在室温下温育1小时。洗涤后，使膜在odyssey红外成像仪(li-cor)上成像。

对于免疫荧光测定，使hela或vero细胞在盖玻片上生长并用5μg寨卡prem+env疫苗转染。转染后两天，将细胞用4％pfa固定15分钟。然后在室温下用稀释于pbs中的正常山羊血清阻断非特异性结合1小时。然后将载玻片在pbs中洗涤5分钟，随后与以1:100稀释的来自免疫小鼠或rm的血清一起在4℃下温育过夜。如上所述的那样洗涤载玻片，并将其与以1:200稀释的适当的二抗[用于小鼠血清的山羊抗小鼠igg-af488(sigma)和用于rm血清的山羊抗人igg-af488]一起在室温下温育1小时。洗涤后，添加含有dapi(abcam)的flouroshield封固剂(flouroshieldmountingmedia)以使所有细胞的细胞核染色。之后，安装盖玻片并在显微镜(evos细胞成像系统；lifetechnologies)下观察载玻片(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)。另外，使vero、sk-n-sh或u87-mb细胞在经组织培养物处理的四腔室载玻片(falcon产品编号#354114)上生长，并用moi为0.01的mr766zv感染4-6天，然后如所述的那样进行染色。

脾细胞和pbmc分离

从所有小鼠制备脾细胞的单细胞悬浮液。简言之，将来自小鼠的脾脏单独收集在5ml补充有10％fbs的rpmi1640(r10)中，然后用stomacher80桨式掺混机(a.j.sewardandco.ltd.)高速处理30秒。将处理过的脾脏样品通过45-mm尼龙过滤器过滤，然后在4℃下以1500rpm离心10分钟。使细胞团块在室温下重新悬浮于5mlack(氯化铵-钾)裂解缓冲液(lifetechnologies)中5分钟，然后添加pbs以终止反应。将样品在4℃下以1500rpm再次离心10分钟。使细胞团块以1×107个细胞/ml浓度重新悬浮于r10中，然后使其通过45-mm尼龙过滤器，之后用于elispot测定和流式细胞术分析(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)。对于rm，在edta管中收集血液(每个时间点20ml)，并用accuspin管(sigma-aldrich,st.louis,mo)使用标准泛影葡胺(ficoll-hypaque)程序分离外周血单核细胞(pbmc)。

elispot测定

简言之，将96孔elispot板(millipore)用抗小鼠ifn-γ捕获ab(r&dsystems)涂铺，并在4℃下温育过夜。第二天，用pbs洗涤板并用pbst+1％bsa封闭2小时。向每个孔中添加20万个来自pzv-prm+env免疫小鼠的脾细胞，并在37℃下于5％co2中在单独的培养基(阴性对照)、含有pma/离子霉素(ionomycin)的培养基(阳性对照)或含有肽库(1μg/ml)的培养基存在下温育过夜，所述肽库由9个氨基酸重叠并且跨越寨卡包膜蛋白(genscript)的长度的15聚体组成。24小时之后，将细胞洗涤，然后与生物素化抗小鼠ifn-γab(r&dsystems)一起在4℃下温育过夜。洗涤后向每个孔中添加链霉亲和素碱性磷酸酶(r&dsystems)，然后在室温下温育2小时。洗涤板，然后添加5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸酯对甲苯胺盐和氯化硝基四氮唑蓝(色原显色试剂；r&dsystems)。最后，用蒸馏水冲洗板，在室温下干燥，并通过自动化elispot读取器(ctllimited)量化斑点形成单位，并将原始值标准化为每百万个脾细胞的sfu。对于rm样品，如制造商所述的那样使用猴ifn-γ试剂盒(mabtech)的elispotpro，用肽库刺激二十万个pbmc，洗涤板并如先前所述的那样使斑点显色并计数(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132；mallilankaraman等人，12011,plosnegltropdis5:e928)。

体液免疫应答：抗体结合elisa

如先前所述(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)，使用酶联免疫吸附测定(elisa)来测定小鼠和rm血清的滴度。简言之，使用1μg/ml纯化寨卡包膜蛋白包被96孔微量滴定板(nalgenenuncinternational,naperville,il)，在4℃下过夜。在用含有10％fbs的pbs封闭至少一小时后，将板用0.05％pbst(在pbs中的tween20)洗涤4次。在1％fbs、0.2％pbst中连续稀释来自免疫小鼠和rm的血清样品，将其添加到板中，然后在室温下温育1小时。将板在0.05％pbst中再洗涤4次，然后与针对小鼠血清以1:35,000稀释的hrp缀合的抗小鼠igg(sigma)一起在室温下温育1小时。对于rm血清，抗猴igghrp(southernbiotech)是以1:5000稀释的形式在室温下使用1小时。通过添加sigmafast^tmopd(邻苯二胺二盐酸盐)片剂，根据制造商的说明书(sigmaaldrich)检测结合的酶。15分钟后通过添加1nh2so4终止反应。然后以450nm的光密度读取板。一式两份测定所有小鼠血清和rm血清样品。使用frey等人描述的方法(frey等人，1998,jimmunolmethods221:35-41)测定终点滴度。

中和(prnt50)测定

先前描述了涉及mr766和vero细胞的噬斑减少中和试验(prnt)(sun等人，2006,jinfectdis193:1658-65)。简言之，将小鼠或rm血清在无血清dmem中连续稀释(1:10至1:1280)，并与等体积的mr766寨卡病毒(100pfu)一起在37℃下温育两小时。将混合物添加到vero细胞融合层中，并在37℃下静置吸附两小时。将2xdmem培养基:软琼脂(1:1)覆盖物添加到细胞上，并将板在37℃下温育5天。从孔中取出琼脂覆盖物并将细胞用4％多聚甲醛固定，用1xpbs洗涤，用结晶紫溶液染色，用1xpbs洗涤，并让板晾干。手动计数在24孔板中进行的测定中的噬斑。用自动免疫斑点读取器(ctllimited)扫描在96孔板中进行的测定中的噬斑，并且使用随elispot读取器一起提供的自动化软件来对样品孔中的噬斑以及阴性对照(仅dmem)和阳性对照(仅100pfumr766寨卡病毒)中的噬斑进行计数。如下计算噬斑减少百分比：减少％＝100x[1-(每个稀释度的噬斑平均数/阳性对照孔中的噬斑平均数)]。使用graphpadprism软件对噬斑减少％与每个单独血清稀释度的对数变换进行非线性回归分析，以便于在接种应答后峰值时对实际50％prnt滴度进行线性插值。对于每个中和目标总体和按疫苗处理组，计算50％中和时的中位数和四分位数间距；还计算了几何平均滴度。滴度表示导致噬斑数量减少50％的最高稀释度的倒数。

流式细胞术和细胞内细胞因子染色(ics)测定。

将脾细胞添加到96孔板(2×106/孔)中并且在蛋白转运抑制剂混合物(布雷菲德菌素a(brefeldina)和莫能菌素(monensin))(ebioscience)存在下在37℃/5％co2下用寨卡prem和包膜汇集的肽刺激5小时。细胞刺激混合物(加上蛋白转运抑制剂)(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)、离子霉素、布雷菲德菌素a以及莫能菌素)(ebioscience)用作阳性对照而r10培养基用作阴性对照。然后如制造商说明书(bd,sandiego,ca)所述针对表面和细胞内蛋白质对所有细胞染色。简言之，将细胞在facs缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和1％fcs的pbs)中洗涤，之后用荧色物缀合的抗体进行表面染色。将细胞用facs缓冲液洗涤，固定并且使用bdcytofix/ctyopermtm(bd,sandiego,ca,usa)，根据制造商的方案进行渗透化，接着进行细胞内染色。以下抗体用于表面染色：live/deadfixablevioletdeadcell染色试剂盒(invitrogen)、cd19(v450；克隆1d3；bdbiosciences)、cd4(fitc；克隆rm4-5；ebioscience)、cd8(apc-cy7；克隆53-6.7；bdbiosciences)、cd44(bv711；克隆im7；biolegend)。对于细胞内染色，使用以下抗体：ifn-γ(apc；克隆xmg1.2；biolegend)、tnf-α(pe；克隆mp6-xt22；ebioscience)、cd3(percp/cy5.5；克隆145-2c11；biolegend)、il-2(pecy7；克隆jes6-sh4；ebioscience)。使用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences)收集所有数据并且使用flowjo软件(treestar,ashland,or)来分析。

统计分析

利用graphpad，prism4(graphpadsoftware,inc.sandiego,ca)进行统计分析。将log10转换应用于终点结合elisa滴度和全病毒prnt50滴度

现在描述这些实验的结果。

zikv-prme共有dna疫苗的构建

使用1952年至2015年间分离的导致人感染的各种寨卡病毒的prm和e序列产生寨卡prm(前体膜)和e(包膜)基因(zikv-prme)的共有序列(图27a)。在将zika-prme共有序列克隆到pvax1载体中之前，要进行另外的修饰和优化以改善其体内表达，所述修饰和优化包括添加高效免疫球蛋白e(ige)前导肽序列(图27b)。使用核酸内切酶限制性消化和基因测序验证最终的疫苗质粒(图27c)。通过在84转染后48小时用疫苗转染的293t细胞进行western分析和间接免疫荧光测定来确认脱离质粒的zika-prme蛋白的表达(图27d和27e)。

寨卡-pmedna疫苗在小鼠中诱导抗原特异性t细胞或功能性体液应答

评价zika-prme质粒疫苗诱导细胞免疫应答的能力。如所述(muthumani等人，2015,scitransmed7:301ra132)，用对照质粒主链(pvax1)或zika-prme质粒疫苗，通过肌肉内注射，接着通过电穿孔(ep)，在92递送部位以2周间隔对每组中的五只c57/bl6小鼠免疫三次。在第三次注射后一周处死动物，并且在标准酶联免疫斑点测定中评价从每只动物收获的大量脾细胞在离体暴露于涵盖zika-env的肽库后分泌干扰素-γ的能力。测定结果显示来自zika-prme免疫小鼠的脾细胞在用多个zika-env肽库刺激后产生明显的细胞免疫应答(图28a)。通过对使用22个由(11个氨基酸重叠的)跨越整个zika-prme蛋白的15聚体组成的肽库，以矩阵格式进行的elispot执行映射分析，来评价引起最强细胞应答(一种或多种)的zika-env的区域(一个或多个)。如图28b所示，几个库诱导升高的t细胞应答，但每106次应答，肽库15诱导最高的sfu。映射数据揭示了序列的一个显性prme表位‘ircigvsnrdfvegm’。通过使用免疫表位数据库分析资源idep共有工具确认所列出的显性肽含有一个h2-db限制性表位，揭示该抗原的有效加工。

进一步评价zika-prme疫苗的细胞免疫原性需要确定最后一次免疫后一周收集的cd8+t细胞的多功能特性。结果显示，zika-prme疫苗增加了表达肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和ifn-γ的双功能疫苗特异性t细胞的比例(图28c)。重要的是，zika-prme接种表现出强大的扩大t细胞功能的能力。为了对比研究，用质粒115进行进一步的疫苗研究，所述质粒115编码最近鉴定的brazilianzika毒株或原始mr766zika毒株的prme序列。在第三次注射后一周，在用与图28a中使用的相同zika-preme肽库刺激脾细胞后通过ifn-γelispot测量经任一质粒免疫的小鼠中细胞免疫应答的诱导情况。结果显示，由新的共有zika-prmedna疫苗构建体诱导的t细胞应答和抗体应答比由这两种非共有质粒疫苗中的任一种所产生的那些应答高至少两倍(图29a和29b)。对于由brazilian或mr766prme疫苗诱导的细胞应答的详细作图分析揭示，两者均诱导其对图28b中对于共有zika-prme质粒所鉴定的显性env特异性ctl表位最显著的细胞应答(数据未示出)。总体而言，共有免疫原在这些测定中似乎始终更加稳健并且进一步研究。

评价共有zika-prme疫苗在小鼠中诱导体液免疫应答的能力。用25μg空对照质粒或共有zikaprme疫苗质粒，通过i.m.注射然后进行ep，以2周间隔对多组c57/bl6小鼠免疫三次。在第0天(第一次免疫之前)、第14天(第一次免疫后两周)、第21天(第二次免疫后一周)和第35天(第三次免疫后一周)从每只经过注射的小鼠获得血清。使用固定的rzika-env作为捕获抗原，通过elisa测试收集的每种血清的zika特异性igg应答。第21天观察到抗zika特异性igg的显著增加，并且在第35天的血清中看到血清igg水平进一步提高(图30a)。第138天来自已接种动物的60份血清显示在第35天血清中看到的高抗体应答在最后一次加强后长期保持。最重要的是，来自已接种小鼠的血清含有非常高水平的抗体，如终点滴度所示(图30b)。通过对第35天的合并血清，针对其用于通过western分析检测rzika-e(图30c)和通过免疫荧光测定对寨卡感染的细胞染色(图30d)的能力进行筛选来进行疫苗诱导的抗体的特异性的附加评估。这两项分析的结果均证实了特异性。

此外，还在用编码来自上述brazilian毒株和mr766菌株的prme序列的质粒免疫的小鼠中评估了zika特异性结合抗体应答。在elisa中分析来自虚假免疫小鼠或疫苗免疫小鼠的第35天血清与rzika-e的结合。该分析表明两种质粒均诱导显著的抗体结合(图29c和29d)，并且用共有zika-prmedna疫苗免疫产生良好的体液应答，对异源zika包膜的亲和力增加。

使用由先前描述的用于分析dv、wnv和其它黄病毒15的技术改编的方法，对来自用空pvax1、共有zika-prme质粒疫苗或共有zika-衣壳质粒疫苗免疫三次的小鼠的第35天合并血清进行噬斑减少中和试验(prnt)测定。如图30e所示，第三次接种后抗zika倒数prnt50稀释滴度在160接受zika-prme疫苗的小鼠中显著高于接受zika-衣壳dna疫苗或对照dnapvax1的小鼠。由该实验中使用的zika-prme疫苗诱导的中和抗体具有prnt50滴度＝456。对于1:100血清稀释液，底部示出了病毒噬斑的代表性照片。

非人灵长类动物中由zika-prmedna疫苗引发的细胞和体液应答

基于先前的研究，通过皮内(id)免疫，接着进行电穿孔来使nhp免疫，表明该方法可以增强dna疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答。向恒河猴(rm；n＝5只/组)施用(id+ep)2.0mg疫苗质粒，并在第0天(免疫前即第一次免疫之前)、第2周(第一次免疫后2周)、第6周(第二次免疫后2周)从rm收集血清和pbmc。为了测量疫苗诱导的细胞免疫应答，对用图28a中使用的zika-e肽库离体刺激的第6周pbmc进行elispot分析。结果显示，与免疫前的血清中的应答相比，zikaprme免疫加强了所有rm中的抗寨卡t细胞应答并扩大了它们的抗原识别(图31a)。

通过elisa评估来自id+ep接种的rm的血清181中的特异性抗寨卡病毒抗体应答。在初次接种后，在第一次免疫后两周可在rm中检测到zika-env特异性结合抗体，随后进行免疫来进一步加强(图31b)。将来自相同的免疫后时间点的已接种rm的血清稀释至研究终点滴度并再次测定rzika-env(图31c)。使用来自已接种组的合并rm血清通过western分析来确认elisa结果(图31d)。此外，在免疫荧光测定中来自免疫rm的血清也能够识别受zika-mr766感染的vero细胞(图31e)。接下来，尝试检测来自zika免疫rm的血清中的中和抗体(nab)应答。prnt50(50％的对照zika感染受抑制时的血清稀释度的倒数)用于测试nab活性，并且对每只单独的免疫动物进行。对于每组动物，分配抗体滴度<10的样品，该抗体滴度是所述测定的检测极限。有趣的是，zika-prme免疫猴的滴度范围为161至1380(平均501±224)(图32a)。

nhp免疫血清在受zika感染的神经母细胞瘤细胞(sk-n-sh细胞)和神经祖细胞(u-87mg)中阻断感染的能力很重要。用对照或疫苗血清处理含mr766或pr209的细胞系，并在24小时分析感染情况。来自已接种rm的血清在感染后抑制两种细胞系中的任一种病毒(感染复数为1.0)(图21b和21c)。这些数据支持来自接种zika-prmedna的rm的血清抑制zika感染的有效性。

在缺少i型干扰素(ifnar)受体，用zikaprmedna疫苗免疫的小鼠中的zika特异性功能免疫应答和针对寨卡病毒的防御

zika诱导的疾病和免疫机制定义不明确，并且对zika感染的免疫应答的保护性与假设致病性特征尚不清楚。大多数小鼠品系对zika感染具有抗性，然而，发现缺少ifn-α/β受体(ifnar)的小鼠对感染和疾病敏感，大多数在攻击6-7天内死亡16。研究了共有zika-prme质粒疫苗在该小鼠品系中诱导细胞和体液免疫应答的能力。用空对照质粒或用共有zika-prme质粒以2周间隔通过ep免疫多组ifnar小鼠3次。在第0、14、21和35天从免疫小鼠收集血清，并在最后一次免疫后一周从小鼠收获脾细胞。来自经疫苗免疫的ifnar小鼠的脾细胞产生明显的细胞免疫应答，如elispot测定中每106个细胞的sfu水平所示(图33a)。来自于使用rzika-env作为捕获抗原的elisa的结果显示，到第14天动物具有可检测的抗zika血清igg，并且这些水平在后续收集时间提高(图33b)。来自已接种小鼠的血清含有显著水平的抗体，如终点滴度所示(图33b)。结果表明用共有zika-prme疫苗免疫的ifnar小鼠能够具有抗zika细胞和体液免疫应答，支持在这种潜在攻击模型中进一步研究疫苗保护作用。

在探索性研究中，ifnar小鼠用1x106pfu的pr209分离株攻击，其通过皮下(s.c.)；腹膜内(i.v)；颅内(i.c.)和静脉内(i.v)施用。攻击后，监测所有动物的临床体征，包括常规体重，记录体温测量值以及濒死状态的其它体征，诸如后肢无力和麻痹。在接种后的前2天内未观察到小鼠的总体外观变化。然而，在第三天之后，所有四种感染途径都显示出活动减少、活动能力下降、弓背姿势；伴有后肢无力和饮水量减少和明显的体重减轻。不管攻击位点如何，动物在第6天和第8天之间死于感染，并将该攻击剂量用于后续研究中。

两组已接种动物(每组10只)或两组pvax1免疫的对照在第0天接种1x，在第14天接种1x，并在第21天用1x106pfu或2x106pfu的pr209攻击(图23b和23c)。100％的已接种动物存活，而仅30％经1x106pfu攻击的对照或10％经2x106pfu攻击的对照存活。接下来，将一组动物免疫1x并在免疫后第14天对其进行攻击。这些动物100％存活，而10％的对照动物存活。用zika-prme接种一次然后用寨卡病毒攻击的所有小鼠都受到保护而免受致死攻击(图34a)。在所有攻击中，已接种动物也未表现出疾病症状并且受到保护而免于体重减轻(图34d)。用寨卡病毒感染对照小鼠引起显著的体重降低，常常伴有活动能力降低、弓背姿势、后肢关节行走和/或有显著死亡率的双侧后肢麻痹(图23e和23f)。总的来说，这些数据说明zv-prmedna疫苗介导的免疫应答保护小鼠免受寨卡攻击。

在目前的研究中，在啮齿动物和非人类灵长类动物中记录了使用prme作为由基于dna的疫苗加上电穿孔产生的抗原的体液和细胞应答。通过ep递送方法进行的优化的增强型dna疫苗技术有效地刺激稳健且广泛的免疫应答和单次免疫诱导的免疫力，该免疫力在ifnar小鼠中对疾病和死亡具有防御作用。本研究支持这样一个观念，针对这种严重的新发病毒感染，使用灵活且在临床上可快速实施的dna疫苗接种策略可以产生保护性免疫。

实施例4

通过被动抗体转移和用prmenvdna疫苗主动免疫来对zikv感染和发病机制进行体内防御

在该研究中，产生了靶向zikv的前体膜+包膜蛋白(prmenv)的新的、合成dna疫苗并评价其体内功效。在质粒构建体的初始体外开发和评价研究之后，通过电穿孔介导的增强型dna递送，用这种基于prmenvdna的免疫原来免疫小鼠和非人灵长类动物。发现已接种动物会产生抗原特异性细胞和体液免疫及中和活性。在缺少干扰素(ifn)-α/β受体的小鼠(称为ifnar^-/-)中用该dna疫苗免疫，在体内病毒攻击后，除了预防脑组织中的病毒病理之外，还诱导针对感染相关的体重减轻或死亡的100％防御。另外，非人灵长类动物抗zikv免疫血清的被动转移保护ifnar^-/-小鼠免受后续病毒攻击。在致病性小鼠模型中对这种zikv疫苗的初步研究支持了靶向zikv感染中prme的免疫应答的重要性，并且表明对这种疫苗方法的额外研究可与人类中的zikv控制有关联。

现在描述材料和方法。

细胞、病毒和动物

将人胚肾293t(美国模式培养物保藏所(atcc)#crl-n268,manassas,va,usa)和veroccl-81(atcc#ccl-81)细胞保持在补充了10％胎牛血清(fbs)及1％青霉素和链霉素的dmem(杜尔贝科改良的伊格尔培养基；gibco-q3invitrogen)中，并使其在融合时传代。使zikv病毒株mr766(来自susanweiss博士的友好礼物)和pr209(bioqual,md)在vero细胞中扩增，并通过对vero细胞进行标准噬斑测定来滴定原液。五至六周龄的雌性c57bl/6(thejacksonlaboratory)和ifnar^-/-(mmrrc储存库-thejacksonlaboratory)小鼠根据美国国立卫生研究院、wistar和加拿大公共卫生局iacuc(机构动物护理和使用委员会)指导方针，在温度受控制的光循环设施中饲养和处理/接种。

rm在bioqual,md,usa进行饲养和处理/接种。本研究严格按照美国国立卫生研究院(nih)、动物福利办公室(officeofanimalwelfare)和美国农业部(u.s.departmentofagriculture)的实验动物护理和使用指南中描述的建议进行。所有动物免疫工作均通过bioqual动物护理和使用委员会(iacuc)批准。bioqual获得美国实验动物照护认证协会(americanassociationforaccreditationoflaboratoryanimalcare)的认可。所有程序均由经过培训的人员在兽医工作人员的监督下在氯胺酮麻醉下进行，并且进行所有努力都是为了保护动物福利并根据“weatherall关于使用非人灵长类动物的报告”的建议将动物的痛苦减到最少。在受控的湿度、温度和光照(12小时光照/12小时黑暗循环)条件下，将动物饲养在相邻的单独灵长类动物笼中，允许社群相互作用。食物和水可随意获得。由经过培训的人员每天监测动物两次，每天喂食商业猴子食物、零食和水果两次。

zikv-prmedna疫苗的构建

zikv-prme质粒dna构建体编码全长膜前体(prm)加上包膜(e)并且合成衣壳蛋白。使用共有策略并通过比对当前zikvprme蛋白序列来确定共有序列。对疫苗插入序列进行遗传优化(即密码子和rna优化)以增强在人类中的表达，并添加ige前导序列以促进表达。该构建体是商业合成的(genscript,nj,usa)，然后如前所述(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)将其亚克隆到经修饰的pvax1表达载体中处于巨细胞病毒立即早期启动子的控制下。最终构建体命名为zikv-prme疫苗，对照质粒主链为pvax1。另外，还设计了许多其它匹配的dna构建体，其编码来自mr766(dq859059.1)和2016brazilin(ama12084.1)爆发株的prm和e基因，用于进一步评价。dna构建体的大规模扩增由inoviopharmaceuticalsinc.(plymouthmeeting,pa,usa)进行并将纯化的质粒dna配制于水中用于免疫。通过琼脂糖凝胶电泳确认dna插入序列的大小。使用mega第5版软件(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)，用clustalw进行多重比对进行系统发育分析。

dna免疫和电穿孔介导的递送增强

经体内电穿孔递送，将25μg的dna于总体积为20或30μl的水中递送到胫骨前肌中，使雌性c57bl/6小鼠(6-8周龄)和ifnar^-/-小鼠(5-6周龄)免疫。dna注射后立即用cellectra自适应恒流电穿孔装置(inoviopharmaceuticals)在相同部位递送体内电穿孔。将三叉cellectra微创装置插入肌肉内～2mm。通过由26号规格的实心不锈钢电极组成的三角形三电极阵列递送方波脉冲，并且递送两个0.1安培的恒流脉冲，52μs/个脉冲，间隔1秒延迟。先前已经详细描述了使用电穿孔的其它方案(flingai等人，2015,scirep5:12616)。以2周间隔使小鼠免疫三次，并在最后一次免疫后1周处死。在每次免疫后收集血液用于分析细胞和体液免疫应答(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。恒河猴免疫原性研究：五只恒河猴在两个部位用2mgzikv-prme疫苗以5周间隔经皮内免疫两次。立即使用针对小鼠免疫描述的相同装置递送电穿孔。

蛋白质印迹分析

对于体外表达研究，使用genejammer试剂，按照制造商的方案(agilent)进行转染。简言之，使细胞在35mm培养皿中生长至50％融合，并用1μgzikv-prme疫苗转染。转染后2天收集细胞，用pbs洗涤两次并用细胞裂解缓冲液(cellsignalingtechnology)裂解。通过使用来自接种zikv-prme的小鼠的抗黄病毒或免疫血清，使用蛋白质印迹来验证来自收获的细胞裂解物的zikv-prme蛋白的表达以及小鼠和rm血清的免疫特异性，如先前所述(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。简言之，向3-12％bis-trisnupage凝胶(lifetechnologies)装载5μg或1μg的zikv包膜重组蛋白(rzikv-e)；经转染的细胞裂解物或上清液和odyssey蛋白分子量标记物(产品#928-40000)。使凝胶在mops缓冲液中在200v下运行50分钟。使用iblot2凝胶转移装置(lifetechnologies)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。在室温下将膜在pbsodyssey封闭缓冲液(li-corbiosciences)中封闭1小时。为了检测疫苗表达，将抗黄病毒类抗原(mab10216-克隆d1-4g2-4-15)抗体以1:500稀释，并将来自小鼠和rm的免疫血清1:50稀释于含0.2％tween20(bio-rad)的odyssey封闭缓冲液中并在4℃下与膜一起温育过夜。用pbst洗涤该膜，然后用用于小鼠血清的适当二抗(山羊抗小鼠irdye680cw；li-corbiosciences)和黄病毒抗体；及用于rm血清的山羊抗人irdye800cw(li-corbiosciences)以用于小鼠血清的1:15,000稀释度在室温下温育1小时。洗涤后，将膜在odyssey红外成像仪(li-corbiosciences)上成像。

免疫荧光测定

对于免疫荧光测定，使细胞在盖玻片上生长并用5μgzikv-prme疫苗转染。转染两天后，将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟。然后在室温下用稀释于pbs中的正常山羊血清阻断非特异性结合1小时。然后将载玻片在pbs中洗涤5分钟，随后用来自免疫小鼠或rm的血清以1:100稀释度在4℃下温育过夜。如上所述洗涤载玻片，并用适当的二抗(用于小鼠血清的山羊抗小鼠igg-af488和用于rm血清的山羊抗人igg-af488]以1:200稀释度在室温下温育1小时。洗涤后，添加含有dapi(abcam)的flouroshield封固剂以使所有细胞的细胞核染色。之后，安装盖玻片并在显微镜(evos细胞成像系统；lifetechnologies)下观察载玻片(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。另外，使vero、sk-n-sh或u87-mb细胞在四室组织培养处理的载玻片上生长，并以用/未用rm免疫血清(1:200)预先温育的zikv-mr766或pr209，以0.01的moi感染，并且在zikv感染后4天使用泛黄病毒抗体如所述进行染色(rossi等人，2016,jropmedhyg94:1362-9)。

组织病理学分析

对于组织病理学，将福尔马林固定的、石蜡包埋的脑组织切成5μm厚的矢状切片，置于superfrost显微镜载玻片(fisherscientific)上并在37℃下背衬(backed)过夜。更换两次二甲苯对切片进行脱石蜡，并通过浸入100％、90％乙醇中，然后浸入70％乙醇中使其再水合。使用harris苏木精(surgipath)对切片的核结构染色2分钟，接着在1％酸醇(surgipath)中分化并用scott自来水处理2分钟。随后，使用曙红(surgipath)对切片的细胞质结构复染2分钟。用70％、90％和100％乙醇使载玻片脱水，在二甲苯中澄清并使用permount(fisherscientific)封固。

脾细胞和pbmc分离

从所有小鼠制备脾细胞的单细胞悬浮液。简言之，将来自小鼠的脾脏单独收集在5ml补充有10％fbs的rpmi1640(r10)中，然后用stomacher80桨式掺混机(a.j.sewardandco.ltd.)高速处理30秒。将处理过的脾脏样品通过45mm尼龙过滤器过滤，然后在4℃下以1,500g离心10分钟。使细胞团块在室温下重新悬浮于5mlack(氯化铵-钾)裂解缓冲液(lifetechnologies)中5分钟，然后添加pbs以终止反应。将样品在4℃下以1500g再次离心10分钟。使细胞团块重新悬浮于r10中，然后使其通过45mm尼龙过滤器，之后用于elispot测定和流式细胞术分析(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。对于rm，在edta管中收集血液(每个时间点20ml)，并用accuspin管(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)，使用标准泛影葡胺(ficoll-hypaque)程序分离pbmc。在每个时间点还将五毫升血液收集到血清管中以进行血清分离。

流式细胞术和细胞内细胞因子染色测定

将脾细胞添加到96孔板(2×10⁶/孔)并且在蛋白转运抑制剂混合物(布雷菲德菌素a和莫能菌素；ebioscience)存在下在37℃/5％co2下用zikv-prme合并肽刺激5小时。细胞刺激混合物(加上蛋白转运抑制剂；pma(佛波醇12-肉豆蔻酸盐13-乙酸盐)、离子霉素、布雷菲德菌素a和莫能菌素；ebioscience)用作阳性对照而r10培养基用作阴性对照。然后如制造商说明书(bdbiosciences,sandiego,ca,usa)所述就表面和细胞内蛋白质对所有细胞染色。简言之，将细胞在facs缓冲液(含有0.1％叠氮化钠和1％fbs的pbs)中洗涤，之后用荧色物缀合的抗体进行表面染色。将细胞用facs缓冲液洗涤，固定并且使用bdcytofix/ctyopermtm(bdbiosciences)，根据制造商方案进行透化，接着进行细胞内染色。以下抗体用于表面染色：live/deadfixablevioletdeadcell染色试剂盒(invitrogen)、cd19(v450；克隆1d3；bdbiosciences)、cd4(fitc；克隆rm4-5；ebioscience)、cd8(apc-cy7；克隆53-6.7；bdbiosciences)、cd44(bv711；克隆im7；biolegend)。对于细胞内染色，使用以下抗体：ifn-γ(apc；克隆xmg1.2；biolegend)、tnf-α(pe；克隆mp6-xt22；ebioscience)、cd3(percp/cy5.5；克隆145-2c11；biolegend)、il-2(pecy7；克隆jes6-sh4；ebioscience)。使用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences)收集所有数据并且使用flowjo软件(treestar,ashland,or,usa)来分析。

elispot测定

简言之，用抗小鼠ifn-γ捕获ab(r&dsystems)涂铺96孔elispot板(millipore)，并在4℃下温育过夜。第二天，用pbs洗涤板并用pbst+1％bsa封闭2小时。向每个孔中添加二十万个来自免疫小鼠的脾细胞，并在37℃下于5％co2中在单独的培养基(阴性对照)、含有pma/离子霉素的培养基(阳性对照)或含有肽库(1μg/ml)的培养基存在下温育过夜，所述肽库由九种氨基酸重叠并且跨越zikvprme蛋白(genscript)的长度的15聚体组成。24小时之后，将细胞洗涤，然后在4℃下用生物素化抗小鼠ifn-γab(r&dsystems)温育过夜。洗涤后向每个孔中添加链霉亲和素-碱性磷酸酶(r&dsystems)，然后在室温下温育2小时。洗涤板，然后向每个孔中添加5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸对甲苯胺盐和氯化硝基四氮唑蓝(色原显色试剂；r&dsystems)。最后，用蒸馏水冲洗板，在室温下干燥，并通过自动化elispot读取器(ctllimited)量化sfu，并将原始值标准化为每百万个脾细胞的sfu。对于rm样品，如制造商所述使用猴ifn-γ试剂盒(mabtech)的elispot^pro；用肽库刺激二十万个pbmc；并且洗涤板并如前所述使斑点显影并计数(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。

体液免疫应答：抗体结合elisa

如先前所述(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)，使用elisa来测定小鼠和rm血清的滴度。简言之，使用1μg纯化rzikv-e蛋白涂铺96孔微量滴定板(nalgenenuncinternational,naperville,il,usa)，在4℃下过夜。在用pbs中的10％fbs封闭至少一小时后，将板用0.05％pbst(在pbs中的tween20)洗涤四次。在1％fbs中连续稀释来自免疫小鼠和rm的血清样品，添加到板中，然后在室温下温育1小时。将板在0.05％pbst中再洗涤四次，然后用hrp缀合的抗小鼠igg(sigma)以用于小鼠血清的1:35,000稀释度在室温下温育1小时。对于rm血清，以1:5000稀释度使用抗猴igghrp(southernbiotech)，在室温下持续1小时。通过添加sigmafastopd(邻苯二胺二盐酸盐)底物溶液，根据制造商的说明书(sigma-aldrich)来检测结合的酶。15分钟之后通过添加1nh2so4终止反应。在synergy酶标仪上读取450nm下的光密度。测定所有小鼠和rm血清样品，一式两份。使用先前描述的方法(frey等人，1998,jimmunolmethods21:35-41)测定终点滴度。

中和(prnt50)测定

先前描述了涉及mr766和vero细胞的prnt(sun等人，2006,jinfectdis193:1658-65)。简言之，将热灭活的小鼠或rm血清在无血清dmem中连续稀释(1:10至1:1280)，并与等体积的zikvmr766(100pfu)一起在37℃下温育2小时。将混合物添加到vero细胞融合层中，并在37℃下静置吸附2小时。将2×dmem培养基：软琼脂(1:1)覆盖物添加到细胞上，并将板在37℃下温育5天。取出琼脂覆盖物并将细胞用4％多聚甲醛固定，用1×pbs洗涤，用结晶紫溶液染色，用1×pbs洗涤，并将板静置至干。用自动免疫斑点读取器(ctllimited)扫描在24孔板中进行的测定中的噬斑，并且使用随elispot读取器一起提供的自动化软件来对样品孔中的噬斑以及阴性对照(仅dmem)和阳性对照(仅100pfumr766zikv病毒)中的噬斑进行计数。如下计算噬斑减少百分比：减少％＝100×{1-(每个稀释度的噬斑平均数/阳性对照孔中的噬斑平均数)}。使用graphpadprism软件进行噬斑减少％相对于每个单独血清稀释度的对数变换的非线性回归分析，以促进接种应答后峰值时实际50％prnt滴度的线性插值。对于每个中和目标总体和按疫苗处理组，计算50％中和时的中位数和四分位数间距；还计算了几何平均滴度。滴度表示导致噬斑数量减少50％的最高稀释度的倒数。

在ifnar^-/-小鼠中的zikv攻击研究

对于zika攻击研究，ifnar^-/-小鼠(n＝10只/组)用zika-prme疫苗或pvax1免疫一次或两次。小鼠在第15天(单次免疫组)或在第21天即第二次免疫后一周(两次免疫组)用1×10⁶pfu或2×10⁶pfuzikv-pr209病毒攻击。同样，还有其它组的ifnar^-/-小鼠(n＝10只/组)免疫一次并在第15天用2×10⁶pfuzikv-pr209病毒攻击。攻击后，对动物称重并通过位于皮下的温度芯片每天测量体温。另外，观察其疾病的临床体征，每天两次(活动能力降低；弓背姿势；后肢关节行走(部分麻痹)，一侧后肢麻痹或双侧后肢麻痹)并抽取血液进行病毒载量测定。基于公益角度的处死标准由20％的体重减轻或一侧或双侧后肢麻痹组成。

用于测量zikv载量的实时rt-pcr测定

将来自于经处理的小鼠的脑浸入4℃的rnalater(ambion)中1周，然后在-80℃下保存。然后将脑组织称重并使用带有不锈钢珠的tissuelyser(qiagen)，在2ml冷冻管中的600μlrlt缓冲液中以循环30次/秒匀化6分钟。还用rneasyplusmini试剂盒(qiagen)从血液中分离病毒rna。利用zikv特异性实时rt-pcr测定检测来自受试动物的病毒rna。使rna逆转录并使用引物zikv835和zikv911c以及探针zikv860fam，用taqmanfastvirus1-stepmastermix(appliedbiosystems)扩增rna。对于每个板平行生成标准曲线并用于量化病毒基因组拷贝数。使用steponeplus实时pcr系统(abi)软件2.3版计算循环阈值(ct)值，并且对于至少一个重复而言ct值≤38被视为阳性，如先前所述(lanciotti等人，2008,emerginfectdis14:1232-9)。在该测定中，放血前为阴性。

统计分析

使用mann-whitney分析来比较抗体滴度的倍数增加的差异。使用graphpad，prism4(graphpadsoftware,inc.sandiego,ca,usa)进行统计分析。对于所有分析，p<0.05视为显著。向终点结合elisa滴度和全病毒prnt50滴度应用log10转换。

现在描述实验的结果。

zikv-prme共有dna疫苗的构建

使用来自1952年至2015年间分离的在人类中引起感染的各种zika的prm和env序列产生zikvprm(前体膜)和env(包膜)基因的共有序列。在进行另外的修饰和优化以改善其体内表达(包括添加高效免疫球蛋白e(ige)前导肽序列)后，将zikv-prme共有序列克隆到pvax1载体中(图35a)。使用同源模型进行zikv包膜序列的最佳比对并在discoverystudio4.5上可视化。参考模型包括pdb5jhm和pdb5iz7。为了可视化目的，在模型中标记对应于prme抗原上的特定区域的比对残基(图35b)。相对于在该研究中分析的多个zikv毒株，优化的共有疫苗选择通常是保守性或半保守性的。ede特异性中和抗体的结构研究已揭示，这些识别决定簇可以在包膜-二聚体界面的血清型不变位点处找到，其包括融合环的暴露主链和两条保守性聚糖链(n67-和n153-连接的聚糖)(rouvinski等人，2015,nature520:109-13)。这两个糖基化位点在其它黄病毒中不是高度保守的。而且，zikv不具有n67连接的糖基化位点，并且在一些分离的zikv毒株中不存在n154连接的糖基化位点(相当于登革热病毒中的n153连接的糖基化位点)。作为共有设计的一部分，因此设计了省去该糖基化位点的构建体。已将该位点糖基化的缺少与ede1型广谱中和抗体(bnab)与zikv-包膜蛋白的结合改善联系起来(rouvinski等人，2015,nature520:109-13)。

构建后，通过蛋白质印迹分析和间接免疫荧光测定确认由质粒表达zikv-prme蛋白。使用泛黄病毒抗体(图35c)和从zikv-prme免疫小鼠收集的血清(图35d)，通过蛋白质印迹分析由用zikv-prme瞬时转染的细胞制备的蛋白质提取物。通过在用抗zikv-prme特异性抗体转染后48小时对用zikv-prme质粒转染的293t细胞染色，通过ifa进一步检测zikv-prme表达(图35e)。

zikv-prmenvdna疫苗在c57bl/6小鼠中诱导抗原特异性t细胞

评价zikv-prmenv质粒疫苗诱导细胞免疫应答的能力。用对照质粒主链(pvax1)或zikv-prme质粒疫苗以2周间隔通过在递送部位肌肉内(i.m.)注射，接着进行电穿孔，对各四只雌性c57bl/6小鼠的多个组免疫三次(图36a)。在第三次注射后1周处死动物，并且在elispot测定中评价从每只动物收获的松散脾细胞在离体暴露于涵盖zika-prme的肽库后分泌干扰素-γ(ifn-γ)的能力。测定结果显示来自zikv-prme免疫小鼠的脾细胞在用多个zikv-e肽库刺激后产生细胞免疫应答(图36b)。使用22个由(11个氨基酸重叠的)跨越整个zika-prme蛋白的15聚体组成的肽库，以矩阵形式通过elispot测定来评价zikvenv引起最强细胞应答的区域。有几个库展示出升高的t细胞应答，肽库15表现出最高数量的斑点形成单位(sfu)(图36c)。该矩阵作图分析揭示了显性prme表位，即‘ircigvsnrdfvegm’(aa167-181)。通过利用免疫表位数据库分析资源工具(http://tools.iedb.org)进行分析，确认该肽含有h2-db限制性表位，这支持在这种单倍型中抗原被有效加工。

进一步评价zikv-prmenv疫苗的细胞免疫原性需要确定最后一次免疫后1周收集的cd8⁺t细胞的多功能特性。结果表明，zikv-prmenv接种增加了表达tnf-α(肿瘤坏死因子-α)和ifn-γ的双功能疫苗特异性t细胞的比例。重要的是，zikv-prmenv接种表现出强大的扩大t细胞功能的能力(图36d)。

另外，用优化质粒进行对比免疫研究，所述质粒编码最近鉴定的brazilianzika毒株或原始mr766zika毒株的prmenv序列。在第三次接种后1周，在用zika-prmenv肽库刺激脾细胞后通过ifn-γelispot分析来测量经任一质粒免疫的小鼠中细胞免疫应答的诱导情况。结果说明，由共有zikvprmedna疫苗构建体诱导的t细胞应答始终高于由这两种非共有质粒疫苗中的任一种所产生的那些应答(图42a和42b)。对于由brazilian或mr766prme疫苗诱导的细胞应答的详细作图分析揭示，两种疫苗均诱导针对图36b和图36c中对于共有zikv-prmenv质粒所鉴定的显性env特异性ctl表位显著的细胞应答(数据未示出)。共有免疫原在这些t细胞测定中在相同剂量下始终诱导更稳健的应答，并在另外的测定中对其进一步评价。

zikv重组包膜蛋白的产生

在这些研究开始时，无可用商业试剂用于评价特异性抗zikv免疫应答。因此，必要时，产生重组zikv-包膜蛋白(rzikv-e)以支持在该研究中进行的测定。为了产生这种试剂，将基于zikv-prme疫苗共有抗原的共有zikv-包膜序列克隆到pet30a大肠杆菌表达载体中(图43a)。在大肠杆菌培养物中产生rzikv-e抗原，使用镍柱色谱法纯化并使用sds-page分析，显示可以使用抗his标签抗体通过western分析检测到来自rzikv-e转染细菌的裂解物中预测大小的过表达蛋白质(图43b)。血清来自于用与在elisa(酶联免疫吸附测定；图43c)中用作捕获抗原的与rzikv-env结合的zikv-prme疫苗免疫的小鼠。与多种黄病毒的包膜蛋白反应的商业抗体(称为泛黄病毒)，也与rzikv-e结合。western分析证明来自zikv-prmenv免疫小鼠的免疫血清特异性识别rzikv-e(图43d)。这些数据表明产生的rzikv-e与来自接种zikv-prmenv的小鼠的免疫血清特异性反应，因此将这种重组蛋白用于进一步的免疫原性研究。

zikv-prmedna疫苗在c57bl/6小鼠中对功能性体液应答的诱导

评价共有zikv-prmenv疫苗在小鼠中诱导体液免疫应答的能力。各四只c57bl/6小鼠的多个组通过电穿孔介导的递送以2周间隔用25μg空对照pvax1或共有zikv-prmenv疫苗质粒经肌肉内(i.m.)免疫三次。从每只免疫小鼠获得血清，并使用固定的rzikv-e作为捕获抗原，通过elisa测试其zikv特异性igg应答。第21天观察到抗zika特异性igg的显著增加，并且在第35天注意到血清igg水平进一步提高(图37a)。来自已接种动物的第60天的血清显示在最后一次加强后长期维持升高的zikv特异性抗体应答。最重要的是，来自已接种小鼠的血清含有非常高水平的rzikv-e特异性抗体，如终点滴度所示(图37b)。通过对来自接种了zikvprmenv质粒的小鼠的合并血清，针对其通过western分析检测rzika-e(包膜)(图37c)和通过免疫荧光测定对zikv(mr766毒株)感染的细胞染色(图37d)的能力进行筛选来进行疫苗诱导的抗体的特异性的附加评估。来自这两项分析的结果确认了疫苗诱导的体液应答的特异性。

此外，还在用编码来自上述brazilian毒株和mr766毒株的prmenv序列的质粒免疫的小鼠中评估zikv特异性结合抗体应答。通过elisa分析来自pvax1-和两种非共有疫苗免疫的小鼠第35天(第三次免疫后1周)的血清与rzikv-e的结合。该分析表明mr766和brazil疫苗质粒均诱导显著的抗体结合，并且用共有zikv-prmedna疫苗免疫产生针对rzikv-e的有效体液应答(图43c和43d)。

对来自于用对照pvax1质粒、共有zikv-prmenv质粒疫苗或共有zikv-c(衣壳)质粒疫苗免疫(3x)的小鼠的第35天合并血清进行噬斑减少中和试验(prnt)测定。使用的prnt测定是由先前描述的用于分析登革热病毒、西尼罗病毒(westnilevirus)和其它黄病毒的技术改编的方法(davis等人，2001,jvirol75:4040-7)。如图37e所示，接种zikv-prme产生显著的中和反应，抗zikv倒数prnt50稀释滴度(50％的对照zika感染受抑制时的血清稀释度的倒数)为456±5，而接种zikv-帽dna疫苗的小鼠展示出的滴度(33±6)仅最低限度地高于接种pvax1对照质粒的动物(滴度＝15±2)。

在缺少i型干扰素受体(ifnar^-/-)的小鼠中用zikv-prmedna疫苗免疫后针对zikv的免疫应答和防御作用

zika诱导的疾病和免疫机制定义不明确，并且对zika感染的免疫应答的保护性与假设致病性特征尚不清楚(rossi等人，2016,jropmedhyg94:1362-9)。大多数小鼠品系对zika感染具有抗性，然而，发现缺少ifn-α/β受体(ifnar^-/-)的小鼠对感染和疾病敏感，大多数在攻击后的6-7天内死亡(lazear等人，2016,cellhostmicrobe19:720-30)。研究了共有zika-prme质粒疫苗在该小鼠品系中诱导细胞和体液免疫应答的能力。五至六周龄的雌性ifnar^-/-小鼠(n＝4)用电穿孔介导的递送，用对照pvax1质粒或zikvprme疫苗质粒疫苗以2周间隔i.m免疫三次。在第0、14、21和35天从免疫小鼠收集血清，并在最后一次免疫后1周(第35天)从小鼠收获脾细胞。来自经疫苗免疫的小鼠的脾细胞产生明显的细胞免疫应答，如elispot测定中每10⁶个细胞的sfu水平所示(图44a)。来自于使用rzika-e作为捕获抗原的elisa的结果显示，到第14天具有可检测的抗zika血清igg(滴度为～1:1,000)，并且这些水平随后续接种而提高，结合抗体滴度达到至少1:100,000(图44b和44c)。相比之下，免疫后第35天的样品的prnt50滴度为1:60(数据未示出)。结果表明用共有zikv-prmenv疫苗免疫的ifnar^-/-小鼠能够产生抗zikv细胞和体液免疫应答，支持在致病性攻击中的这种推定疫苗效应模型中的进一步研究。

非人灵长类动物中由zika-prmenvdna疫苗引发的zikv特异性功能细胞和体液应答

基于显示出较低电压皮内形式的有效免疫应答的新近研究，通过使用皮内电穿孔进行皮内免疫来使nhp免疫(hutnick等人，2012,humgenether23:943-50；broderick等人，molthernucleicacids1:e11)。恒河猴(rm；n＝5只/组)通过电穿孔皮内施用2.0mg疫苗质粒，每只动物间隔4周接种两次。在第0天(免疫前)和第6周(第二次免疫后2周)收集血清和外周血单核细胞(pbmc)。用zikv-prmenv肽库离体刺激的免疫前和第6周的pbmc的elispot分析显示zikv-prmenv免疫在rm中诱导稳健的抗zikvt细胞应答(图38a)。

通过elisa评估来自已接种rm的血清中的特异性抗zikv抗体应答。在第6周，在接种zikvprmenv的动物中可检测到rzikv-env特异性结合抗体(图27b)。在第2周(1次免疫后)和第6周(2次免疫后；图38c)测定每只动物的终点滴度。使用来自各个已接种动物的rm血清，通过蛋白质印迹分析来确认elisa结果(图38d)。通过prnt50测定来评价第6周在rm中产生的抗体的中和活性。所有已接种的猴子都具有显著的中和活性，抗zikv倒数prnt50稀释滴度范围为161至1380(平均值501±224标准平均误差；图38e)。prnt滴度与elisa滴度不直接相关(数据未示出)。

通过ifa检查nhp疫苗免疫血清在体外阻断vero细胞、神经母细胞瘤(sk-n-sh)或神经祖(u-87mg)细胞的zikv感染的能力。将zikvq2毒株(mr766或pr209)在血清或nhp免疫血清稀释液中预温育，并添加到每种细胞类型的单层中。感染后四天，使用泛黄病毒抗体通过ifa鉴定zikv阳性细胞(图45a-45c)并量化zikv阳性细胞(图45b-45d)。来自接种zika-prme的rm的血清抑制每种细胞类型中的zikv感染。

在ifnar^-/-小鼠中在zikv-prme免疫后针对zikv感染和疾病的防御

在探索性研究中，5-6周龄的ifnar^(-/-)小鼠(n＝10)用1×10⁶个噬斑形成单位(pfu)的zikv-pr209分离株攻击，其通过皮下(s.c.)；腹膜内(i.p.)；颅内；或静脉内(i.v.)途径施用。在攻击后，监测所有动物的临床感染体征，包括常规的体重测量以及检查濒死状态的其它体征，诸如后肢无力和麻痹。在接种后的前4天内未观察到小鼠的总体外观变化。然而，在第四天之后，每组中的小鼠均展示出总体活动减少、活动能力降低和弓背姿势，常常伴有后肢无力、饮水量减少和明显的体重减轻。无论病毒攻击的途径如何，动物都在第6天和第8天之间死于感染(图46a-46e)。基于这些数据，用于评价该模型中zikv-prme介导的保护作用的后续研究使用皮下途径进行攻击。

接下来在这种ifnar^-/-小鼠模型中评价zikv-prmenv疫苗的保护功效。通过i.m.途径，通过电穿孔介导的递送，用zikv-prme疫苗免疫两组小鼠(n＝10)(25μg疫苗)。另外，通过i.m.途径，通过电穿孔介导的递送，用对照pvax1载体免疫两组各10只的小鼠。进行两次免疫，间隔两周，并且在第21天(第二次免疫后1周)攻击所有动物。对照小鼠和已接种小鼠的一个集合通过s.c.途径接受1×10⁶pfu的zikv-pr209并且每一组的另一集合通过s.c.途径用总共2×10⁶pfuzikv-pr209攻击。在攻击后3周，所有接种zikv-prme的动物100％存活，而仅有30％的单剂量攻击的对照或10％的双剂量攻击的对照存活(图39a和39b)。在所有攻击中，已接种的动物没有疾病体征，包括没有体重减轻的迹象(图39c和39d)。用zikv-pr209病毒感染对照小鼠引起显著的体重降低，连同活动能力降低、弓背姿势、后肢关节行走和/或一侧或双侧后肢麻痹(图39e和39f)。

评价用zikvprmedna疫苗单次免疫保护ifnar^-/-小鼠免受zikv攻击的潜在能力。各10只小鼠的多个组用对照质粒或zikv-prme疫苗通过电穿孔在i.m.免疫一次，并在2周后施用双倍总剂量2×10⁶pfuzikv-pr209来进行攻击。在攻击后三周，接种zikv-prme的动物100％存活，而仅有10％的对照动物存活(图40a)。为了确定总的组织病理学变化，将脑组织切成5μm厚的矢状切片，对核结构染色并使用曙红对细胞质结构进行复染(图40b)。在攻击后第7或8天处死小鼠以进行组织学和病毒载量分析。zikv感染在小鼠中引起严重的脑病理。未接种的对照(pvax1)小鼠脑切片显示出嗜中性粒细胞内的核碎片(图40b)；皮质内血管的围管现象，大脑皮质的淋巴细胞浸润和变性细胞(图29b)和海马内的神经元变性(图40b)。然而，相比之下，接种zikvprme的动物在脑组织中呈现正常的组织病理学(图40b)，支持用合成zika-prme疫苗免疫所诱导的保护性抗体可以限制脑部中病毒诱导的疾病。该观察结果证明了在该模型中接种疫苗保护脑部的可能性。与zikv攻击后，已接种小鼠中体重减轻和活动能力受损的改善相一致，与高(2×10⁶pfu)剂量攻击组中受病毒攻击的接种pvax1的动物相比，注意到接种zikv-prme的动物的血液(图40c)和脑(图40d)中的病毒载量明显较低。总的来说，这些数据说明zikv-prmedna疫苗介导的免疫应答可以保护小鼠免受zikv攻击。

抗zikv免疫血清的被动转移保护小鼠免受zikv感染

接下来，测试来自接种zikvprmenv的rm的免疫血清转移是否会阻止ifnar^-/-小鼠中zikv介导的发病机制。为此，在zikv病毒攻击1天后将150μg来自第6周rm的等效igg(prnt50≈1/160)过继转移到ifnar^-/-小鼠中。包括两组对照小鼠，一组接受来自rm的免疫前血清，另一组接受磷酸盐缓冲盐水(pbs)。接受pbs或对照血清的小鼠在感染过程中减轻其原始体重的15至25％，并且在感染6-8天后全部死亡。当来自rm的疫苗免疫血清转移到感染易感小鼠中时，动物在第3天和第4天重量减轻，但随后从第5天开始重量恢复，80％最终在感染性攻击中存活(图41a)，证明了nhp血清转移在病毒攻击后赋予针对zikv感染的临床表现的防御作用的能力(图41b)。在为评价免疫血清转移在针对zikv攻击的防御作用中的功效而进行的重复实验中，zikv-prme免疫血清受者的存活率为80％至100％。这些研究表明，在不存在获得性适应性抗zikv免疫应答的情况下，抗zikv疫苗免疫血清具有赋予针对zikv感染的显著防御作用的能力。

接种zikv-prme共有构建体

最近zikv及其相关发病机制在人类中的传播引起了人们的高度关注。目前，没有许可的用于这种新兴感染因子的疫苗或治疗剂。最近，已经证实一组实验性zikv疫苗在非致病性动物感染模型中降低了攻击后的病毒载量(larocca等人，2016,nature536:474-8；abbink等人，2016,science353:1192-32)。这些数据令人鼓舞。在这点上，重要的是检查在其它模型中靶向zika的其它新的疫苗方法。这里，评价了设计用于表达新的共有zikv-prm和e抗原的合成dna疫苗在小鼠和非人灵长类动物中进行电穿孔增强免疫后的免疫原性。观察到接种zikv-prmedna具有免疫原性并且在小鼠和nhp中产生抗原特异性t细胞及结合和中和抗体。独特地，通过皮内途径通过电穿孔用zikv-prme免疫nhp，电穿孔使用比肌肉内电穿孔更低的电压和更小的转染面积，如最近所述(trimble等人，2016,lancet386:2078-88)。对此类方法的进一步研究可以在临床环境中提供优势。

zikv-prme共有构建体包括潜在nxs/t基序的设计变化，其去除了推定的糖基化位点。已将该位点糖基化的缺失与ede1型bnab(广谱中和抗体)对zikv-e蛋白的结合的改善联系起来(muthumani等人，2016,scitranslmed7:301ra132)。由共有zikv-prme诱导的抗体应答似乎与同样开发的zikv-prme-mr766和zikv-prme-brazil疫苗引发的抗体应答一样稳健或在一些情况下在幅度上更优异。这些构建体分别与原始zikv-mr766分离株或最近从巴西传来的zikv毒株序列匹配。虽然有支持，但进一步研究将更深入了解并入的此类设计变化对诱导的免疫应答的影响。

因为对于zikv而言致病性攻击模型很少，所以比较了zikv-prme疫苗在c57bl/6和ifnar^-/-小鼠中的免疫应答的推定保护性质。当用zikv-prme免疫时，两个小鼠品系都以稳健的体液免疫应答进行响应。还诱导了t细胞应答，但与ifnar^-/-动物中诱导的t细胞应答相比，在野生型c57bl/6中似乎更稳健，支持正如预期的那样由于小鼠的敲除表型，在先天性免疫向适应性免疫转换上有部分缺陷。然而，基于抗原特异性免疫的诱导，该模型可用于评价疫苗对感染和发病机制的影响。在ifnar^-/-小鼠中用zikv-prme单次接种在该模型中对疾病和死亡具有保护作用，包括对神经发病机制的保护作用。认为针对env抗原的黄病毒-中和抗体在针对疾病的防御方面具有关键作用，这一想法通过动物模型中的被动抗体转移实验得到直接支持，并通过来自易受蚊虫传播的病毒感染的地理区域的前瞻性研究的流行病学数据得到间接支持(weaver等人，2016,antiviralres130:69-80；roa等人，2016,lancet387:843；samarasekera等人，2016,lancet387:521-4)。虽然用zikv-prmedna疫苗以及来自已免疫nhp的血清转移来免疫ifnar^-/-小鼠在这种鼠类模型中具有保护作用，即接种ifnar^-/-的小鼠与血清转移的小鼠相反，表现出改善的体重减轻控制作为发病机制控制的指示。虽然需要进行另外的研究，但这一结果可能表明在该模型中t细胞应答在这一保护方面的作用。另外，观察到从攻击中恢复的对照ifnar^-/-小鼠通过pcr保持病毒阳性至少数周，表明接种的其它益处。该研究支持接种的潜力，并且在这种情况下，支持这种合成dna疫苗接种影响易感宿主的疾病预防的潜力。

实施例5

由dna编码的抗体预防和针对寨卡病毒的dna接种引起的快速和长期免疫

已知接种在产生免疫力之前表现出滞后期；因此，在免疫应答起效之前，感染期间存在时间间隔。以下提供了利用疫苗和天然免疫应答的益处以及使用dna合成抗体或dmab快速产生有效免疫的特定新方法。

设计基于抗体的预防/治疗，其需要电穿孔介导递送编码具有生物学活性的抗寨卡病毒包膜mab(命名为dmab)的合成质粒，并评价其抗病毒功效以及通过基于被动免疫的新策略克服常规主动接种的固有缺点的能力。肌内注射zikv-dmab一次比主动接种zikv-dna疫苗更快地在体内产生抗体。这种dmab中和不同的zikv临床分离株并保护小鼠免受病毒攻击。两者的组合提供了快速又长期的保护。

基于dna的dmab策略诱导针对新发病毒感染的快速防御，其可以与dna接种相结合，提供针对这种新发传染病的独特的短期和长期防御。这些研究对病原体治疗和控制策略有影响。

dmabigg定量和结合测定

用来自施用zikv-dmab的受试者的血清进行elisa测定以量化表达动力学和靶抗原结合。

dmab产生的igg的分析

通过蛋白质印迹分析zikv感染细胞的igg表达。对于免疫荧光分析，通过共聚焦显微镜在视觉上评价zikv感染的细胞，并定量或半定量分析。

dmabdna质粒施用和体内分析

在注射对照或zikv-dmab后，评价受试者中的表达动力学和功能性。对于包括dna疫苗的研究，施用zikv-dna疫苗质粒。

攻击研究

受试者接受zikv-dmab或对照质粒的电穿孔增强注射。如上所述递送zikv-dna疫苗。在dna递送后，用zikv攻击受试者。监测动物的存活率和感染体征。收集血清样品用于细胞因子定量和其它免疫分析。从感染后开始收集血液样品并测量病毒血症水平。

中和抗体分析

测定来自施用了zikv-dmab的受试者的抗zikv中和抗体滴度。中和滴度可以按在细胞中介导细胞病变效应100％减少的最高稀释度的倒数计算。

细胞因子定量分析

从注射了zikv-dmab和zikv-dna疫苗的受试者以及经zikv攻击的受试者中收集血清。测量tnf-α、il-1β和il-6血清细胞因子水平。

抗zikvdmab设计和表达的确认

针对igg和fab抗体设计由抗zikv中和mab构建的优化的合成质粒。用zikv-igg质粒或zikv-fab(vl、vh或组合)质粒转染细胞以验证体外表达。zikv-fab和zikv-igg在肌肉中表达抗体，这些抗体似乎正确组装并在体外具有生物学功能。

抗zikvdmab的体内表达和定量

在确认体外表达后，测量zikv-fab或zikv-igg在体内产生抗zikv抗体的能力。两种构建体都产生mab。向受试者施用zikv-igg或zikv-fab，并通过结合elisa评价血清抗体水平。注射后从zikv-igg和zikv-fab收集的血清与zikv蛋白结合但不与无关的对照抗原结合。这些数据表明，由zikv-igg或zikv-fab构建体在体内产生的抗zikv抗体具有与常规产生的抗原特异性抗体相似的生物学特征。

来自注射抗zikvdmab的血清中的体内特异性和广谱中和活性

受试者

测试抗zikvdmab产生的mab的结合特异性和抗zikv中和活性。血清抗体与zikv感染的细胞结合。由抗zikvdmab质粒产生的抗体具有很强的特异性。

此外，相对于在zikv毒株中的抗zikv中和活性，测量来自接受抗zikvdmab的受试者的血清中的抗zikv中和活性。来自注射了抗zikvdmab的受试者的血清有效中和zikv分离株，证明单次注射可以产生显著的中和水平的人抗zikvigg。因此，通过抗zikvdmab构建体在体内产生的抗体具有相关生物活性(即，针对zikv的结合和中和活性)。

抗zikvdmab注射保护小鼠免受致命性zikv攻击

为了确定由抗zikvdmab产生的抗体是否提供针对zikv早期暴露的防御，各10名受试者的多个组在第0天接受对照或抗zikvdmab。随后每个组用病毒皮下攻击以模拟天然zikv感染。随后记录受试者存活率和重量变化。抗zikvdmab质粒赋予保护性免疫。

接下来评价免疫保护的寿命。在第0天注射抗zikvdmab或对照质粒后，用zikv攻击第二组受试者。监测受试者的存活率。抗zikvdmab提供更持久的免疫保护。

与注射对照的受试者相比，抗zikvdmab保护受试者免受皮下病毒攻击和鼻内病毒攻击，证明抗zikvdmab可以防御全身和粘膜感染。

接下来进行比较抗zikvdmab施用与zikv-dna疫苗(zikv-dna)的保护功效的功效研究。我们的实验室开发了一种基于共有序列的新的dna疫苗，能够提供针对zikv攻击的防御。dna疫苗还诱导了可测量的细胞免疫应答，以及有效的中和抗体应答。向多组受试者施用抗zikvdmab、zikv-dna或pvax1单次注射，然后进行病毒攻击。抗zikvdmab比zikv-dna疫苗更快地提供保护性免疫。

通过施用抗zikvdmab和接种zikv-dna赋予的体内保护性免疫之间的比较

接下来，第0天接种zikv-dna疫苗或施用抗zikvdmab后进行长期zikv攻击保护研究。zikv-dna比抗zikvdmab赋予更长久的保护性免疫。

抗zikvdmab和zikv-dna疫苗的共同递送产生全身性

体液免疫、细胞介导的免疫和体内保护

组合抗体递送与接种方法的一个潜在问题是抗体可以中和许多传统疫苗，因此是不相容的平台。评价了在zikv攻击的情况下共同施用抗zikvdmab和zikv-dna对受试者存活率的影响。受试者在第0天施用抗zikvdmab和zikv-dna。随后，一些动物在第2天用zikv攻击，其它动物在第35天攻击。跟踪这些组中随时间而变化的存活率。抗zikvdmab介导保护免受感染，在对照(pvax1)动物中到攻击后4天存活百分比降至大约30％。检测到抗zikvdmab和zikv-dna疫苗所诱导的igg。抗zikvdmab在zikv攻击后介导快速保护免于感染和死亡。

此外，评价在注射了抗zikvdmab、zikv-dna或抗zikvdmab加zikv-dna的受试者中诱导的t细胞应答。无论是否与抗zikvdmab共同递送，zikv-dna都引发强烈的t细胞应答，表明这些方法没有干扰。相反，仅施用抗zikvdmab的动物未发展t细胞应答。抗zikvdmab和zikv-dna疫苗均可同时施用，无相互干扰，通过全身体液和细胞免疫提供即时和长期的保护(图8)。

电穿孔介导的优化dna质粒的递送用于体内快速产生生物功能性mab

施用抗zikvdmab的受试者在施用后不久就受到完全保护免受病毒攻击，而受试者在用zikv-dna疫苗进行单次免疫后不能在感染中存活，可能是因为没有足够的时间来发起保护性免疫。然而，zikv-dna在免疫方案，接着在稍后的时间点进行攻击后提供完全保护。在施用单剂量的抗zikvdmab的受试者中发生类似水平的保护，但保护作用随时间推移而减弱。值得注意的是，抗zikvdmab和zikv-dna的共同递送产生快速且持久的体液和细胞免疫，表明组合方法可具有累加或协同效应。重要的是，就短期或长期保护性免疫应答的发展而言，抗zikvdmab和zikv-dna的共同递送不是拮抗性的。

实施例6

序列

●seqidno:1zikv-3f12e9-vh的氨基酸序列

●seqidno:2zikv-3f12e9-vl的氨基酸序列

●seqidno:3zikv-8a9f9-vh的氨基酸序列

●seqidno:4zikv-8a9f9-vl的氨基酸序列

●seqidno:5zikv-8d10f4-vh的氨基酸序列

●seqidno:6zikv-8d10f4-vl的氨基酸序列

●seqidno:7zikv-ic2a6-vh的氨基酸序列

●seqidno:8zikv-ic2a6-vl的氨基酸序列

●seqidno:9zikv-id4g7-vh的氨基酸序列

●seqidno:10zikv-id4g7-vl的氨基酸序列

●seqidno:11人抗寨卡(3f12e9)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:12人抗寨卡(3f12e9)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:13人抗寨卡(8a9f9)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:14人抗寨卡(8a9f9)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:15人抗寨卡(8d10f4)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:16人抗寨卡(8d10f4)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:17人抗寨卡(1d4g7)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:18人抗寨卡(1d4g7)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:19人抗寨卡(8a9f9)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2(在第4和第5残基处具有lala变体)-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:20人抗寨卡(3f12e9)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2(在第4和第5残基处具有lala变体)-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:21人抗寨卡(ic2a6)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:22人抗寨卡(ic2a6)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人κ轻链信号肽-vl-cl(κ)

●seqidno:23，共有寨卡ige前导序列-prme蛋白

●seqidno:24共有寨卡ige前导序列-prme(构建体1)dna

●seqidno:25共有寨卡ige前导序列-prme(构建体1)蛋白

●seqidno:26，共有寨卡ige前导序列-ns1dna

●seqidno:27，共有寨卡ige前导序列-ns1蛋白

●seqidno:28，共有寨卡ige前导序列-衣壳dna

●seqidno:29，共有寨卡ige前导序列-衣壳蛋白

●seqidno:30，寨卡ige前导序列-prmemr766dna

●seqidno:31，寨卡ige前导序列-prmemr766蛋白

●seqidno:32，寨卡ige前导序列-prmebrazildna

●seqidno:33，寨卡ige前导序列-prmebrazil蛋白

●seqidno:34共有寨卡ige前导序列-ns1dna(pgx7211)

●seqidno:35共有寨卡ige前导序列-衣壳dna(pgx7212)

●seqidno:36寨卡ige前导序列-prmebrazildna(pgx7213)

●seqidno:37寨卡ige前导序列-prmemr766dna(pgx7214)

●seqidno:38寨卡preenv(mr766)，有/无衣壳dna(pgx7210)

●seqidno:39寨卡preenv(mr766)，有/无衣壳蛋白(pgx7210)

●seqidno:40，ige前导序列

应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

所公开的实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员将是显而易见的。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可进行与(包括但不限于)本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类变化和修改。

序列表

<110>卡鲁皮亚·穆苏马尼(muthumani,karuppiah)

大卫·韦纳(weiner,david)

严健(yan,jian)

<120>新的对抗寨卡病毒的疫苗和用于对抗寨卡病毒的dna抗体构建体的组合

<130>206194-0008-00-wo.606794

<150>62/396,750

<151>2016-09-19

<150>62/417,093

<151>2016-11-03

<160>40

<170>patentin版本3.5

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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metasnpheglyleuserleuilepheleualaleuileleulysgly

151015

valglncysgluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

serargtyrglymetsertrpglyargglnthrproasplysargleu

505560

glutrpvalalathrileserserglyglythrtyrthrtyrtyrpro

65707580

aspservallysglyargphethrileserargaspasnalalysasn

859095

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100105110

tyrtyrcysalaargsertrpphealatyrtrpglyargglythrleu

115120125

valthrvalserala

130

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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151015

gluthrasnglyaspvalvalmetthrglnthrproleuthrleuser

202530

valthrileglyglnproalaserilesercyslysserserglnser

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leuleuaspseraspglylysthrtyrleuasntrpleuleuglnarg

505560

proglyglnserprolysargleuiletyrleuvalserlysleuasp

65707580

serglyvalproaspargphethrglyserglyserglythraspphe

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thrleulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyr

100105110

cystrpglnglythrhispheprohisthrpheglyglyglythrlys

115120125

leugluilelys

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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metasnpheglyleuserleuilepheleuvalleuileleulysgly

151015

valglncysgluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

sersertyralametsertrpvalargglnserproglulysargleu

505560

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65707580

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100105110

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servalthrvalserser

130

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<212>prt

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<220>

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metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serargseraspvalvalmetthrglnileproleuserleuproval

202530

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

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valhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

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65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecys

100105110

pheglnserthrhisvalproprothrpheglyglyglythrlysleu

115120125

gluilelys

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metasnpheglyleuserleuilepheleuvalleuileleulysgly

151015

vallyscysgluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

sersertyralametsertrpvalargglnserproglulysargleu

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glutrpvalalagluileserserglyglysertyriletyrtyrpro

65707580

aspthr

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<212>prt

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metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serserseraspvalvalmetthrglnserproleuserleuproval

202530

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

valhisserasnglyasnthrtyrphehistrptyrleuglnlyspro

505560

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65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspleuglyleutyrphecys

100105110

serglnserthrhisvalproprothrpheglyglyglythrlysleu

115120125

gluilelys

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<211>134

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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metasnpheglyleuserleuilepheleuvalleuileleulysgly

151015

valglncysgluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

sersertyralametsertrpvalargglnserproglulysargleu

505560

glutrpvalalagluileserserglyglysertyrthrtyrtyrpro

65707580

aspthrvalthrglyargphethrileserargaspasnalalysasn

859095

thrleutyrleuglumetserserleuargsergluaspthralamet

100105110

tyrtyrcysalaseraspglytyrtyrserhistrpglyglnglythr

115120125

servalthrvalserser

130

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serserseraspvalvalmetthrglnthrproleuserleuproval

202530

cysleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

valhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

glyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecys

100105110

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115120125

gluilelys

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>zikv-id4g7-vh

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metalatrpvaltrpthrleuleupheleumetalaalaalaglnser

151015

alaglnalaglnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslys

202530

proglygluthrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrasntyrglymetasntrpvallysglnalaproglylysglyleu

505560

lystrpmetglytrpileasnthrtyrthrglygluprothrtyrala

65707580

aspaspphelysglyargphealapheserleugluthrseralaser

859095

thralatyrleuglnileasnasnleulysasngluaspthralathr

100105110

tyrphecysalaarggluileserlysiletyrtyrtyrglyserser

115120125

tyrgluasnglymetasptyrtrpglyglnglythrservalthrval

130135140

serser

145

<210>10

<211>131

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>zikv-id4g7-vl

<400>10

metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro

151015

glyserthrglyasnilevalleuthrglnserproalaserleuala

202530

valserleuglyglnargalathrilesercysargalasergluser

354045

valaspserpheglyasnserphemethistrppheglnglnlyspro

505560

glyglnproprolysleuleuiletyrleualaserasnleugluser

65707580

glyvalproalaargpheserglyserglyserargthraspphethr

859095

leuthrileaspprovalglualaaspaspalaalathrtyrtyrcys

100105110

glnglnasnasnglutyrprotyrthrpheglyglyglythrlysleu

115120125

gluilelys

130

<210>11

<211>728

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>人抗寨卡(3f12e9)-igg4：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人ƙ轻链信号肽-vl-cl(ƙ)

<400>11

metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly

151015

thrhisalagluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

serargtyrglymetsertrpglyargglnthrproasplysargleu

505560

glutrpvalalathrileserserglyglythrtyrthrtyrtyrpro

65707580

aspservallysglyargphethrileserargaspasnalalysasn

859095

thrleutyrleuglnmetserserleulyssergluaspthralamet

100105110

tyrtyrcysalaargsertrpphealatyrtrpglyargglythrleu

115120125

valthrvalseralaalaserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

195200205

leuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

210215220

thrlysvalasplysargvalserproasnmetvalprohisalahis

225230235240

hisalaglnalaproglupheleuglyglyproservalpheleuphe

245250255

proprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluval

260265270

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275280285

asntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlyspro

290295300

argglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuthr

305310315320

valleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysval

325330335

serasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlysala

340345350

lysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproprosergln

355360365

gluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysgly

370375380

phetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnpro

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gluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyser

405410415

phepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpglnglu

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glyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhis

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tyrthrglnlysserleuserleuserleuglylysargglyarglys

450455460

argargserglyserglyalathrasnpheserleuleulysglnala

465470475480

glyaspvalglugluasnproglyprometvalleuglnthrglnval

485490495

pheileserleuleuleutrpileserglyalatyrglyaspvalval

500505510

metthrglnthrproleuthrleuservalthrileglyglnproala

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serilesercyslysserserglnserleuleuaspseraspglylys

530535540

thrtyrleuasntrpleuleuglnargproglyglnserprolysarg

545550555560

leuiletyrleuvalserlysleuaspserglyvalproaspargphe

565570575

thrglyserglyserglythraspphethrleulysileserargval

580585590

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595600605

prohisthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargthrval

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alaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulys

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serglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarg

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glualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasn

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serglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrser

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leuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislys

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valtyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthr

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lysserpheasnargglyglucys

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<211>731

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人ƙ轻链信号肽-vl-cl(ƙ)

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metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly

151015

thrhisalagluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

serargtyrglymetsertrpglyargglnthrproasplysargleu

505560

glutrpvalalathrileserserglyglythrtyrthrtyrtyrpro

65707580

aspservallysglyargphethrileserargaspasnalalysasn

859095

thrleutyrleuglnmetserserleulyssergluaspthralamet

100105110

tyrtyrcysalaargsertrpphealatyrtrpglyargglythrleu

115120125

valthrvalseralaalaserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

195200205

leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn

210215220

thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhis

225230235240

thrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproserval

245250255

pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr

260265270

progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu

275280285

vallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalys

290295300

thrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalser

305310315320

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

325330335

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

340345350

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

355360365

proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

370375380

vallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasn

385390395400

glyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspser

405410415

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420425430

trpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleu

435440445

hisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylysarg

450455460

glyarglysargargserglyserglyalathrasnpheserleuleu

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lysglnalaglyaspvalglugluasnproglyprometvalleugln

485490495

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500505510

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565570575

aspargphethrglyserglyserglythraspphethrleulysile

580585590

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyrcystrpglngly

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argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

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glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

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tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

660665670

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

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thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

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lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

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provalthrlysserpheasnargglyglucys

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<223>人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人ƙ轻链信号肽-vl-cl(ƙ)

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metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly

151015

thrhisalagluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallys

202530

proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe

354045

sersertyralametsertrpvalargglnserproglulysargleu

505560

glutrpvalalagluileserserglyglysertyrthrtyrtyrpro

65707580

aspthrvalthrglyargphethrileserargaspasnalalysasn

859095

thrleutyrleuglumetserserleuargsergluaspthralamet

100105110

tyrtyrcysalaseraspglytyrtyrserhistrpglyglnglythr

115120125

servalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

130135140

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tyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythr

210215220

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>人抗寨卡(8a9f9)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2(在第4和第5残基处具有lala变体)-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人ƙ轻链信号肽-vl-cl(ƙ)

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serprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyval

565570575

proaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulys

580585590

ileserargvalglualagluaspleuglyvaltyrphecysphegln

595600605

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610615620

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645650655

phetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleu

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675680685

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690695700

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

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180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser

195200205

leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn

210215220

thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhis

225230235240

thrcysproprocysproalaproglualaalaglyglyproserval

245250255

pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr

260265270

progluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspproglu

275280285

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290295300

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305310315320

valleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlys

325330335

cyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrile

340345350

serlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleupro

355360365

proserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcysleu

370375380

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385390395400

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565570575

aspargphethrglyserglyserglythraspphethrleulysile

580585590

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyrcystrpglngly

595600605

thrhispheprohisthrpheglyglyglythrlysleugluilelys

610615620

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

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660665670

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

675680685

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

690695700

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

705710715720

provalthrlysserpheasnargglyglucys

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly

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thrhisalagluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallys

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225230235240

alavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthr

245250255

valproserserserleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasp

260265270

hislysproserasnthrlysvalasplysargvalserproasnmet

275280285

valprohisalahishisalaglnalaproglupheleuglyglypro

290295300

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

305310315320

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325330335

progluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

340345350

alalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargval

355360365

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

370375380

tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulys

385390395400

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595600605

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serprovalthrlysserpheasnargglyglucys

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<210>22

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>人抗寨卡(ic2a6)-igg1：人igg重链信号肽-vh-ch1-铰链区-ch2-ch3-定制弗林蛋白酶切割位点-'gsg'接头和p2a肽-人ƙ轻链信号肽-vl-cl(ƙ)

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metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly

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sersertyralametsertrpvalargglnserproglulysargleu

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100105110

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servalthrvalserservalthrglyargphethrileserargasp

130135140

asnalalysasnthrleutyrleuglumetserserleuargserglu

145150155160

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165170175

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225230235240

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245250255

valproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasn

260265270

hislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolysser

275280285

cysasplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleu

290295300

glyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu

305310315320

metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser

325330335

hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalglu

340345350

valhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthr

355360365

tyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasn

370375380

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385390395400

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405410415

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glutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpro

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provalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthr

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valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval

485490495

methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu

500505510

serproglylysargglyarglysargargserglyserglyalathr

515520525

asnpheserleuleulysglnalaglyaspvalglugluasnprogly

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prometvalleuglnthrglnvalpheileserleuleuleutrpile

545550555560

serglyalatyrglyaspvalvalmetthrglnthrproleuserleu

565570575

provalcysleuglyaspglnalaserilesercysargsersergln

580585590

serleuvalhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleugln

595600605

lysproglyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnarg

610615620

pheserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythrasp

625630635640

phethrleulysileserargvalglualagluaspleuglyvaltyr

645650655

phecyspheglnserthrhisvalproprothrpheglyglyglythr

660665670

lysleugluilelysargthrvalalaalaproservalpheilephe

675680685

proproseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcys

690695700

leuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplysval

705710715720

aspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrglugln

725730735

aspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuser

740745750

lysalaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthrhis

755760765

glnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys

770775780

<210>23

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>共有寨卡ige前导序列-prme

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ilethrargargglyseralatyrtyrmettyrleuaspargasnasp

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alaglyglualaileserpheprothrthrleuglymetasnlyscys

505560

tyrileglnilemetaspleuglyhismetcysaspalathrmetser

65707580

tyrglucysprometleuaspgluglyvalgluproaspaspvalasp

859095

cystrpcysasnthrthrserthrtrpvalvaltyrglythrcyshis

100105110

hislyslysglyglualaargargserargargalavalthrleupro

115120125

serhisserthrarglysleuglnthrargserglnthrtrpleuglu

130135140

serargglutyrthrlyshisleuileargvalgluasntrpilephe

145150155160

argasnproglyphealaleualaalaalaalailealatrpleuleu

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glyserserthrserglnlysvaliletyrleuvalmetileleuleu

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thralaalaphethrphethrlysvalproalagluthrleuhisgly

515520525

thrvalthrvalgluvalglntyralaglythraspglyprocyslys

530535540

valproalaglnmetalavalaspmetglnthrleuthrprovalgly

545550555560

argleuilethralaasnprovalilethrgluserthrgluasnser

565570575

lysmetmetleugluleuasppropropheglyaspsertyrileval

580585590

ileglyvalglyasplyslysilethrhishistrphisargsergly

595600605

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610615620

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625630635640

valpheasnserleuglylysglyilehisglnilepheglyalaala

645650655

phelysserleupheglyglymetsertrppheserglnileleuile

660665670

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675680685

serleuthrcysleualaleuglyglyvalmetilepheleuserthr

690695700

alavalserala

705

<210>32

<211>2130

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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100105110

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leuvalmetileleuleuilealaproalatyrserileargcysile

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valaspvalvalleugluhisglyglycysvalthrvalmetalagln

225230235240

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245250255

metalagluvalargsertyrcystyrglualaserileseraspmet

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275280285

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325330335

gluasnleuglutyrargilemetleuservalhisglyserglnhis

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500505510

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515520525

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530535540

valproalaglnmetalavalaspmetglnthrleuthrprovalgly

545550555560

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565570575

lysmetmetleugluleuasppropropheglyaspsertyrileval

580585590

ileglyvalglyglulyslysilethrhishistrphisargsergly

595600605

serthrileglylysalapheglualathrvalargglyalalysarg

610615620

metalavalleuglyaspthralatrpasppheglyservalglygly

625630635640

alaleuasnserleuglylysglyilehisglnilepheglyalaala

645650655

phelysserleupheglyglymetsertrppheserglnileleuile

660665670

glythrleuleumettrpleuglyleuasnthrlysasnglyserile

675680685

serleumetcysleualaleuglyglyvalleuilepheleuserthr

690695700

alavalserala

705

<210>34

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<211>435

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>共有寨卡ige前导序列-衣壳dna(pgx7212)

<400>35

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<213>人工序列(artificialsequence)

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gtggagaactggatctttcgcaatcccggcttcacactggtggcagtggcaatcgcatgg540

ctgctgggcagctccacctctcagaaagtgatctacctggtcatgatcctgctgatcgcc600

cctgcctattccatccggtgcatcggcgtgtctaatagagactttgtggagggaatgtcc660

ggcggcacctgggtggatgtggtgctggagcacggcggatgcgtgacagtgatggcccag720

gacaagccaaccgtggatatcgagctggtgaccacaaccgtgagcaacatggccgaggtg780

cggtcctactgctatgaggcctccatctctgacatggccagcgattccagatgtcccacc840

cagggcgaggcctacctggacaagcagtccgatacacagtacgtgtgcaagaggaccctg900

gtggacaggggatggggaaatggatgtggcctgtttggcaagggctctctggtgacatgc960

gccaagttcacctgttctaagaagatgacaggcaagagcatccagcccgagaacctggag1020

taccggatcatgctgagcgtgcacggctctcagcacagcggcatgatcgtgaacgacgag1080

ggctatgagacagatgagaatcgggccaaggtggaggtgacacctaacagcccaagagcc1140

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aacaataaggaggccctggtggagttcaaggatgcccacgccaagaggcagacagtggtg1380

gtgctgggcagccaggagggagcagtgcacaccgccctggcaggcgccctggaggccgag1440

atggacggagcaaagggccgcctgttctccggccacctgaagtgcaggctgaagatggat1500

aagctgcgcctgaagggcgtgtcttacagcctgtgcacagccgccttcaccttcaccaag1560

gtgcctgccgagacactgcacggcacagtgaccgtggaggtgcagtatgccggcacagac1620

ggcccctgtaaggtgcctgcccagatggccgtggatatgcagacactgacccctgtgggc1680

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gtgttcaattctctgggcaagggcatccaccagatcttcggcgccgcctttaagagcctg1980

ttcggcggaatgtcctggttttctcagatcctgatcggcacactgctggtgtggctgggc2040

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<210>38

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<400>38

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gtcgactgttggtgcaacaccacctccacttgggtcgtgtacggcacttgccaccacaag300

aagggcgaggccagaagaagcagaagagccgtgaccctgcctagccacagcaccagaaag360

ctgcagaccaggagccagacttggctggaaagccgcgagtacaccaagcacctgatcaag420

gtggagaattggatcttccggaaccccggcttcacactggtggccgtggcaatcgcttgg480

ctgctgggatctagcaccagccagaaagtgatctacctggtcatgatcctgctgatcgcc540

ccagcctacagcatccgctgtatcggagtgagcaaccgggacttcgtggagggaatgagc600

ggaggaacttgggtggacgtggtgctggaacacggaggttgcgtgacagtgatggctcag660

gacaagcccaccgtggatatcgagctggtgaccaccaccgtgtccaacatggccgaagtg720

cgcagctactgctacgaggccagtatctccgacatggccagcgatagccgctgtcctaca780

cagggagaggcctatctggacaagcagagcgacacccagtacgtctgcaagaggaccctc840

gtggatagaggctggggaaacggttgcggactgttcggaaagggcagcctcgtgacttgc900

gccaagttcacttgcagcaagaagatgaccggcaagtctatccagcccgagaacctggag960

taccggatcatgctgagcgtgcacggaagccagcacagcggcatgatcgtgaacgacgag1020

ggatacgagaccgacgagaacagggccaaggtggaagtgacccctaacagccctagagcc1080

gaagccacactgggaggatttggcagcctgggactggattgcgagcctagaacaggcctg1140

gacttcagcgacctgtactacctgaccatgaacaacaagcattggctggtgcacaaggag1200

tggttccacgacatccctctgccttggcacgcaggagccgatacaggcacacctcattgg1260

aacaacaaggaggccctggtggagttcaaggacgctcacgccaagagacagacagtggtg1320

gtgctgggaagccaggaaggagcagtgcatacagccctggcaggagctctggaagcagaa1380

atggacggcgctaagggcagactgttcagcggacacctcaagtgccggctgaagatggac1440

aagctgcggctgaagggcgtgtcttacagcctctgcaccgcagccttcaccttcaccaag1500

gtgccagcagagacactgcacggaacagtgaccgtggaagtgcagtacgccggaacagac1560

ggaccttgcaaagtgccagcccagatggcagtggacatgcagacactgaccccagtggga1620

aggctgatcaccgctaaccccgtcatcaccgagagcaccgagaacagcaagatgatgctg1680

gagctggacccccccttcggcgatagctacatcgtgatcggcgtgggcgacaagaagatc1740

acccaccattggcacagaagcggcagcacaatcggcaaggctttcgaggccaccgtgaga1800

ggagctaagagaatggccgtgctgggagacaccgcttgggattttggcagcgtgggagga1860

gtgttcaacagcctgggcaagggcatccaccagatcttcggagccgccttcaagagcctg1920

ttcggcggcatgtcttggttcagccagatcctgatcggaacactcctcgtctggctggga1980

ctgaacaccaagaacggcagcatcagcctgacttgtctggccctgggaggcgtgatgatc2040

ttcctgagcaccgccgtgtccgcttgataa2070

<210>39

<211>688

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寨卡preenv(mr766)，有/无衣壳蛋白(pgx7210)

<400>39

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisserilethrargargglyseralatyrtyrmettyrleuasparg

202530

seraspalaglylysalaileserphealathrthrleuglyvalasn

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lyscyshisvalglnilemetaspleuglyhismetcysaspalathr

505560

metsertyrglucysprometleuaspgluglyvalgluproaspasp

65707580

valaspcystrpcysasnthrthrserthrtrpvalvaltyrglythr

859095

cyshishislyslysglyglualaargargserargargalavalthr

100105110

leuproserhisserthrarglysleuglnthrargserglnthrtrp

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leugluserargglutyrthrlyshisleuilelysvalgluasntrp

130135140

ilepheargasnproglyphethrleuvalalavalalailealatrp

145150155160

leuleuglyserserthrserglnlysvaliletyrleuvalmetile

165170175

leuleuilealaproalatyrserileargcysileglyvalserasn

180185190

argaspphevalgluglymetserglyglythrtrpvalaspvalval

195200205

leugluhisglyglycysvalthrvalmetalaglnasplysprothr

210215220

valaspilegluleuvalthrthrthrvalserasnmetalagluval

225230235240

argsertyrcystyrglualaserileseraspmetalaseraspser

245250255

argcysprothrglnglyglualatyrleuasplysglnseraspthr

260265270

glntyrvalcyslysargthrleuvalaspargglytrpglyasngly

275280285

cysglyleupheglylysglyserleuvalthrcysalalysphethr

290295300

cysserlyslysmetthrglylysserileglnprogluasnleuglu

305310315320

tyrargilemetleuservalhisglyserglnhisserglymetile

325330335

valasnaspgluglytyrgluthraspgluasnargalalysvalglu

340345350

valthrproasnserproargalaglualathrleuglyglyphegly

355360365

serleuglyleuaspcysgluproargthrglyleuasppheserasp

370375380

leutyrtyrleuthrmetasnasnlyshistrpleuvalhislysglu

385390395400

trpphehisaspileproleuprotrphisalaglyalaaspthrgly

405410415

thrprohistrpasnasnlysglualaleuvalgluphelysaspala

420425430

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435440445

valhisthralaleualaglyalaleuglualaglumetaspglyala

450455460

lysglyargleupheserglyhisleulyscysargleulysmetasp

465470475480

lysleuargleulysglyvalsertyrserleucysthralaalaphe

485490495

thrphethrlysvalproalagluthrleuhisglythrvalthrval

500505510

gluvalglntyralaglythraspglyprocyslysvalproalagln

515520525

metalavalaspmetglnthrleuthrprovalglyargleuilethr

530535540

alaasnprovalilethrgluserthrgluasnserlysmetmetleu

545550555560

gluleuasppropropheglyaspsertyrilevalileglyvalgly

565570575

asplyslysilethrhishistrphisargserglyserthrilegly

580585590

lysalapheglualathrvalargglyalalysargmetalavalleu

595600605

glyaspthralatrpasppheglyservalglyglyvalpheasnser

610615620

leuglylysglyilehisglnilepheglyalaalaphelysserleu

625630635640

pheglyglymetsertrppheserglnileleuileglythrleuleu

645650655

valtrpleuglyleuasnthrlysasnglyserileserleuthrcys

660665670

leualaleuglyglyvalmetilepheleuserthralavalserala

675680685

<210>40

<211>16

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ige前导序列

<400>40

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015