单纯疱疹病毒i型ul5基因缺失的dna疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 单纯痕疼病毒(Herpes simplex virus，HSV)，属于痕疼病毒科(Herpesviridae family)，a痕疼病毒亚科(Alpha herpesvirinae familyXHSV病毒为双链DNA病毒，从 外到内含有囊膜、皮层、衣壳及基因组等四种病毒结构。HSV-1是单纯疱疹病毒的一种，主 要引起喉、口、眼、脸及神经系统的感染，可引起疱疹性脑炎，唇疱疹等多种疾病。有调查结 果显示，90%以上的人一生中均会受到疱疹病毒的感染，单纯疱疹病毒感染已成为世界上第 四大的传染性疾病。
[0003] HSV病毒在细胞内的增殖是一个有序的复杂过程，按先后顺序HSV病毒的胞内增殖 过程大致可以分为以下几个阶段：1)病毒吸附于宿主细胞膜的表面;2)病毒穿过细胞膜;3) 病毒基因组进入细胞核内；4)病毒基因的表达;5)基因组DNA的复制;6)病毒核衣壳的组装； 7)病毒颗粒的形成;8)子代病毒的释放。HSV病毒在细胞内基因组DNA的复制是病毒产生致 病性的必须过程，若缺少该过程，将不能组装成完整的病毒颗粒，从而严重减低对机体的致 病性。
[0004] 病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养 筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。 中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗及其制备方 法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒I型基因组中的见43、此44、1^45、1^46和1^47基因。 该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的免疫应 答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之处：（1) 选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组成同源 重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2)选择pShuttle-CMV载体，同源重组框整合到 拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3)用荧光蛋白基因代替拟敲除病毒基因 用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减毒活疫 苗仍表达该蛋白。
[0005] 因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。
【发明内容】
[0006 ]为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制备方法，通过该方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生 毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。
[0007]本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下 步骤： S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌 株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI重组质粒的宿主菌； S2 BAC载体的切除及HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的获得。
[0008] 优选地，所述步骤S1包括如下步骤： SI. 1 pREDI重组质粒的构建:设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片 段;设计I-Scel的PCR扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段;将所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通过重组PCR连接，得到PrhaB-1-SecI片段;将所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒； S1.2重组敲除系统的构建:将所述pREDI重组质粒转入含BAC-HSV-1载体的宿主菌中， 得到同源重组敲除的重组敲除系统； S1.3 UL5基因同源重组片段的PCR扩增：以所述重组敲除系统的Kam-SacB全片段为 模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGAITTAITCAACAAAGCCA (SEQ ID N0.1) 为上游引物，以 GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID NO . 2 )为下游引物，通过PCR扩增获得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以该片段为模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQ ID NO ? 3)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQ ID NO. 4)为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A-C-Kam-SacB-B片段，即UL5 基因同源重组片段； S1.4携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选:将所述UL5基因同源重组片段电转 化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因Kam进行重组细菌的筛选;对转化获得 的单克隆进行PCR鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基因的成功去除及正反标记基因的正确 插入； S1.5去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定：鼠李糖诱导I-Scel内切酶合成，切除 Kam-SacB片段，发生第二次同源重组，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株。
[0009] 本发明中重组敲除系统的构建与中国专利申请CN104894046中HSV-1病毒体外基 因敲除系统的构建方案相同，在此将中国专利申请CN104894046的相关内容引入本发明中。
[0010] 优选地，所述步骤S2包括如下步骤： S2.1将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，进行质粒抽提，获得 BAC-17.37 AUL5质粒，电转化至Ver〇-pCDNA3.1-UL5-Cre细胞，使用含G418的培养基进行培 养，通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清得到HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗； S2.2将S2.1得到的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗感染Ver〇-pCDNA3.1-UL5细胞，再 通 过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV-1 UL5基因缺失的 DNA 疫苗。
[0011] 优选地，所述质粒抽提采用BAC大量抽提试剂盒进行;所述含G418的培养基包括 DMEM基础培养基、1~4%体积百分含量的胎牛血清和0.5~2 ug/ml的G418。
[0012] 优选地，所述Ver〇-pCDNA3.卜UL5-Cre细胞的制备包括如下步骤： A) 以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到p⑶NA3.1 (+)质粒，得到p⑶NA3.1-UL5质粒； B) 通过反转录P1噬菌体的RNA，扩增得到Cre基因片段，将所述p⑶NA3.1-UL5质粒和Cre 基因片段经BamHI酶切后用T4连接酶进行连接，挑选单克隆进行Cre基因和UL18基因的PCR 鉴定和测序，得到真核表达P⑶NA3.1-UL5-CRE质粒； C) 将所述PCDNA3.1-UL5-CRE质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶 液进行筛选，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE细胞。
[0013] 优选地，所述Vero_pCDNA3.1-UL5细胞的制备包括如下步骤： A) 以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到p⑶NA3.1 (+)质粒，得到p⑶NA3.1-UL5质粒； B) 将所述PCDNA3.1-UL5质粒利用lip〇2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶液进 行筛选，得到Ver〇-pCDNA3 ? 1-UL5细胞。
[0014] 优选地，所述UL5基因的扩增引物包括:上游引物:AATTGGATCCGAGCGTGGTGCG
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括： (1)本发明提供的制备方法简单、高效，制得的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗不易发 生毒力回复，其病毒度滴度和感染能力明显减弱，保留了较高的免疫原性，进入机体后仅能 刺激机体产生免疫应答而无致病作用，安全有效。
[0016] (2)本发明提供的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法合理、简单、高效， BAC载体上的red基因表达能够提高同源重组效率，鼠李糖诱导的I -See I内切酶合成使基因 组发生第二次同源重组，切除外源性抗性基因和SacB基因，在敲除目的基因的同时未引入 外源基因，可控性强。
[0017] (3)构建的Ver〇-pCDNA3.1-UL18-CRE细胞可以在切割去掉BAC质粒的同时，还可以 提供基因缺失病毒株生长所需的VP23蛋白，使得HSV-1 UL18基因缺失减活疫苗得到顺利的 纯化筛选，提高了纯化效率。
【附图说明】
[0018] 图1 Cre基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中，M指DNA marker，1指Cre基因目标 条带。
[0019]图2 UL5基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中，M指DNA marker，l指阳性对照，2指 UL5基因目标条带。
[0020]图3去除正反选择标记基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中A指UL5基因的验证 电泳图，B指Kam片段的验证电泳图，C指SacB片段的验证电泳图，M指DNA marker，P指阳性对 照，N指阴性对照。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0022]实施例1 UL5基因表达载体的真核细胞株的构建 以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物（SEQ ID N0.5、SEQ ID ^).6)扩增此5基因 (2696bp)，将该基因片段用BamHI和BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到pCDNA3.1( + )质粒 (购自优宝生物公司，货号VT1001)，得到pCDNA3 ? 1-UL5质粒； 通过反转录P1噬菌体的RNA，扩增得到Cre基因片段，将所述p⑶NA3.1-UL5质粒和Cre基 因片段经BamHI酶切后用T4连接酶进行连接，挑选单克隆进行Cre基因和UL5基因的PCR鉴定 和测序，结果如图1和图2所示，得到真核表达p⑶NA3.1-UL5-CRE质粒； 将所述PCDNA3.1-UL5-CRE质粒利用lipo2000脂质体（购自invitrogen，货号为11668-019 )转染到Vero细胞(购自美国ATCC公司）内，使用lmg/ml浓度的G418溶液(购自东巨化 工公司）进行筛选，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE细胞。
[0023] 将所述pCDNA3.1-UL5质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用lmg/ml浓 度的G418溶液进行筛选，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5细胞。
[0024] 实施例2 HSV-1 UL5基因的同源重组敲除 2.1 pREDI重组质粒的构建 设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片段(2. Okb);设计I-Scel的PCR 扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段(0.7 kb);将所述PrhaB片段和所述I-SecI片段通过重 组PCR连接，得到PrhaB-1-SecI片段；将所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒。pREDI重组质粒具有由L-阿拉伯糖诱导启动 的入-red recombinase，以及由鼠李糖诱导启动的I-SecI内切酶基因。
[0025] 2.2重组敲除系统的构建 将构建的pREDI重组质粒转入含BAC-HSV-1载体的宿主菌中，宿主菌为EPI300E.Coli， 得到同源重组敲除的重组敲除系统。
[0026] 2.3 UL5基因同源重组片段的PCR扩增 以重组敲除系统的K a m - S