a c B全片段为模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQ ID NO ? 1)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQ ID _.2)为下游引物，使用狀高保真酶（购自141^1^公司，货号为 N390 1 CA)，通过PCR扩增获得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以该片段为模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQ ID NO ? 3)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQ ID NO ? 4)为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A-C-Kam-SacB-B片段（约 3042bp)，即UL5基因同源重组片段。
[0027] 2.4携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选 将所述UL5基因同源重组片段电转化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因 Kam进行重组细菌的筛选;对转化获得的单克隆进行PCR鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基 因的成功去除及正反标记基因的正确插入;通过第一次同源重组，完成了 UL5基因的敲除， 但引入了外源基因。
[0028] 2.5去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定 鼠李糖诱导I-Scel内切酶合成，切除Kam-SacB片段，发生第二次同源重组，即在A-C-Kam-SacB-B片段的C片段与UL5基因下游片段之间进行第二次同源重组，得到不含UL5基 因和外源基因的重组菌株。通过SacB反向筛选标记基因对正确去除标记基因的细菌进行 筛选，获得完全去除标记基因的UL5敲除菌株，不含外源基因。通过PCR对挑选的克隆进 行鉴定，除了阳性对照组能够扩增出UL5基因外，阴性对照及三个克隆均不能够扩增出 UL5基因，证明了 UL5基因的成功敲除。通过Kam和SacB扩增引物对Kam和SacB进行验证， 除了阳性对照能扩增出Kam和SacB片段外，其余组均不能够扩增出Kam和SacB片段，说明 Kam片段和SacB片段已从HSV-1基因组内去除成功，PCR扩增产物的电泳图如图3所示。
[0029]实施例3 BAC载体的切除及HSV-1 UL5基因缺陷型毒株的获得 将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，采用BAC大量抽提试剂盒进 行质粒抽提，获得BAC-17.37 A UL5质粒，电转化至实施例1构建的Ver〇-pCDNA3.1-UL5-Cre 细胞，使用含2%体积百分含量的胎牛血清和lug/ml的G418的DMEM培养基进行培养，在细胞 发生病变前24h，移去细胞培养液，然后用含1%琼脂糖和2%FBS的DMEM培养基覆盖，当形成 可见病理效果后，加入含有400ug/ml X-gal(购自BioSynth AG瑞士)磷酸盐缓冲液，然后 通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清，得到HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗。 [0030] 将得到的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗感染实施例1制得的Ver〇-pCDNA3.1-UL5 细胞，再通过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV-1 UL5基因 缺失的DNA疫苗(HSV-1- A UL5)。
[0031 ] 实施例4重组HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗的复制感染 六孔板内每孔接种4 X 105个Vero细胞，培养24小时，按感染复数(M0I )0.1、0.5和1分别 用野生型HSV-1(购自美国ATCC公司）和实施例3制得的HSV-1-AUL5感染Vero细胞，每个 滴度四个复孔，并设置不加病毒的正常细胞为对照。实验结果表明野生型HSV-1病毒株72小 时完全产生细胞病变效应(CPE)，而HSV-1-AUL5病毒株>10天未观察到CPE，说明重组HSV-1-A UL5病毒株相对于野生型HSV-1而言复制和感染能力明显降低，基本无感染能力。 崖衡細璐繼減果:
[0032]实施例5重组HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的致病能力及免疫能力 本实施例，皆采用小鼠为实验观察。每次都以l〇〇ul体积的病毒悬液或其他对照溶剂腹 腔接种清洁级BALB/c小鼠（雄性，6-8周龄，体重(20土2) g，购自广东省实验动物中心）。注射 前使用N0进行短暂处理。若无特别说，病毒均悬浮于含2%PFBS的DMEM中。每天保证小鼠同等 且充足的食物和水。
[0033] 分别向小鼠腹腔注射100ul体积5X105pfu HSV-1、HSV-1_AUL5病毒株，并设注射 不含病毒株的溶剂为对照组，每组12只小鼠。结果如表2所示，野生型HSV-1注射组全部小鼠 由于感染于8天后死亡。而其它小鼠组均得以存活。
[0034] :導2注離不謂毒:_着的结巣表
继续饲养以上存活的小鼠，30天后以最初给予的相同剂量的野生型HSV-1病毒株腹腔 注射进行免疫攻击，结果发现HSV-1-A UL5病毒感染组的小鼠都未发现死亡，只是在注射后 初期表现出一些不适。而溶剂对照组小鼠在注射9天后皆死亡。
[0035] 表3经免疫后注射HSV-1的结果表
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征在于:包括如下步 骤： S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌 株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI重组质粒的宿主菌； S2 BAC载体的切除及HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的获得。2. 根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述步骤S1包括如下步骤： SI. 1 pREDI重组质粒的构建:设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片 段;设计I-Scel的PCR扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段;将所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通过重组PCR连接，得到PrhaB-1-SecI片段;将所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒； S1.2重组敲除系统的构建:将所述pREDI重组质粒转入含BAC-HSV-1载体的宿主菌中， 得到同源重组敲除的重组敲除系统； S1.3 UL5基因同源重组片段的PCR扩增：以所述重组敲除系统的Kam-SacB全片段为 模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA 为上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAA TGGCGC为下游引物，通过PCR扩增获得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以该片段为模板，以 GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC 为上游 引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC 为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A-C-Kam-SacB-B片段，即UL5基因同源重组片段； S1.4携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选:将所述UL5基因同源重组片段电转 化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因 Kam进行重组细菌的筛选;对转化获得 的单克隆进行PCR鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基因的成功去除及正反标记基因的正确 插入； S1.5去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定：鼠李糖诱导I-Scel内切酶合成，切除 Kam-SacB片段，发生第二次同源重组，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株。3. 根据权利要求1所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述步骤S2包括如下步骤： S2.1将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，进行质粒抽提，获得 BAC-17.37AUL5质粒，电转化至Ver〇-pCDNA3.1-UL5-Cre细胞，使用含G418的培养基进行培 养，通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清得到HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗； S2.2将S2.1得到的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗感染Ver〇-pCDNA3.1-UL5细胞，再 通过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV-1 UL5基因缺失的 DNA疫苗。4. 根据权利要求3所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述质粒抽提采用BAC大量抽提试剂盒进行;所述含G418的培养基包括DMEM基础培养 基、1 ~4%体积百分含量的胎牛血清和0 · 5~2 ug/ml的G418。5. 根据权利要求3所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述Ver〇-pCDNA3.1 -UL5-Cr e细胞的制备包括如下步骤： A) 以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到p⑶NA3.1 (+)质粒，得到p⑶NA3.1-UL5质粒； B) 通过反转录P1噬菌体的RNA，扩增得到Cre基因片段，将所述p⑶NA3.1-UL5质粒和Cre 基因片段经BamHI酶切后用T4连接酶进行连接，挑选单克隆进行Cre基因和UL18基因的PCR 鉴定和测序，得到真核表达P⑶NA3.1-UL5-CRE质粒； C) 将所述PCDNA3.1-UL5-CRE质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶 液进行筛选，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE细胞。6. 根据权利要求3所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述Ver〇-pCDNA3.1-UL5细胞的制备包括如下步骤： A) 以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到p⑶NA3.1 (+)质粒，得到p⑶NA3.1-UL5质粒； B) 将所述PCDNA3.1-UL5质粒利用lip〇2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶液进 行筛选，得到Ver〇-pCDNA3 · 1-UL5细胞。7. 根据权利要求5所述的单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，其特征 在于:所述UL5基因的扩增引物包括:上游引物:AATTGGATCCGAGCGTGGTGCGGTC ATG;下游引物:AAGCTCGAGAGGGGACGGCGGGTTAATAG 〇
【专利摘要】本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI？重组质粒的宿主菌；S2？BAC载体的切除及HSV-1？UL5？基因缺失的DNA疫苗的获得。本发明属于生物医药技术领域，通过本发明提供的方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。
【IPC分类】C12N15/63, A61K39/245
【公开号】CN105561303
【申请号】CN201511007008
【发明人】王一飞, 任哲, 程江, 王巧利, 廖晓凤
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2015年12月30日