本发明属于水产动物细菌性疾病防控领域，涉及琥珀酸在制备水产动物链球菌病防治药物中的用途，尤其是一种可以抑制水产养殖动物无乳链球菌主要致病因子β-溶血/溶细胞的天然化合物及其应用方法，特别涉及罗非鱼无乳链球菌病的防控领域。
背景技术：
：无乳链球菌革兰氏阳性条件致病菌，呈球形或卵圆形，是人、畜、鱼共患的病原菌。作为鱼类病原，其广泛危害罗非鱼、虹鳟、斑点叉尾、牙鲆和多耙等淡海水养殖鱼类，其对温水性鱼类尤其是罗非鱼危害最为严重。我国是全球最大的罗非鱼养殖国，2017年我国罗非鱼养殖产量达160万吨，占全球罗非鱼产量的40％，是我国水产品出口创汇的主要品种之一，然而2009年以来，我国养殖罗非鱼深受无乳链球菌病危害，该病发病速度快、流行范围广、死亡率高，据统计广东、海南、福建和广西等罗非鱼主要养殖区，链球菌发病率达20％～50％，死亡率达50％～70％。2011年以来，罗非鱼链球菌病不仅发病时间提前，而且危害范围扩大，逐渐向原来不发病的小规格鱼种和鱼苗蔓延，损失极为惨重。目前，罗非鱼无乳链球菌的防治仍以磺胺类化学合成药物或青霉素类抗生素为主。这些药物使用初期效果较为显著，然而无乳链球菌具有多种耐药和免疫逃避途径，如改变细胞表面电荷、青霉素结合蛋白调节和菌毛调节等耐药途径；由荚膜多糖抗原、Alp家族、β蛋白、C5a肽酶、Lmb、FbsA、Sip等介导的免疫逃避途径，导致这些药物后期疗效下降，使用量增大，病情反复等情况，此外，化学合成类和抗生素类药物存在残留风险高、环境污染和破坏微生态环境等负面影响。大量化学合成类和抗生素类药物已被列为禁用或限用药物，急需开发一种绿色安全高效的水产养殖动物无乳链球菌病防治新药。天然化合物来源于自然，在动物体内易于吸收、代谢、消除，残留风险小、毒副作用低、来源丰富、价格低廉，是水产动物细菌性新药研发的理想候选化合物。然而迫于生存压力，病原菌对直接抑杀作用的天然化合物耐药机率高，导致该类天然化合物疗效下降。病原菌通过定植、入侵、免疫逃避、激发炎症、干扰宿主细胞信号传导和损伤宿主等过程引发疾病，致病因子在此过程中发挥着至关重要的作用，通过抑制病原菌致病因子的活性，阻断病原菌引发疾病，降低病原菌迫于生存压力而产生耐药的机率，是较为理想的细菌性疾病防治策略。β-溶血/溶细胞素是无乳链球菌最为关键的致病因子之一，也是诊断无乳链球菌引发的疾病的诊断依据。有研究表明，无乳链球菌β-溶血/溶细胞素合成关键基因缺陷株浸染力显著低于野生株，为此，β-溶血/溶细胞素合成阻断剂或活性抑制剂作为无乳链球菌病防治新药具有良好的开发潜力。天然化合物琥珀酸，化学名为丁二酸，为三羧酸循环中间产物，也是厌氧代谢的发酵产物之一，它也广泛存在于多种植物、动物的组织中。也可通过丁烯二酸还原法或丁二腈水解法等化学合成方法制备，具有解毒、利尿、镇静、止血、抗菌、抗溃疡等药理活性，已被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为“一般认为安全”(GenerallyRecognizedasSafe，GRAS)。迄今为止，尚未见琥珀酸在水产动物细菌性疾病防控方面，尤其是在抑制罗非鱼源无乳链球菌β-溶血/溶细胞素活性方面的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种琥珀酸在制备水产动物链球菌病防治药物中的用途，该药物属天然化合物，具有来源丰富、价格低廉、病原耐药风险低、无残留、无污染、环境友好、疗效显著等优势，具有显著的抑制罗非鱼源无乳链球菌β-溶血/溶细胞素活性，对罗非鱼无乳链球菌病具有显著的疗效，作为防治水产养殖动物细菌性疾病药物完全符合发展无公害水产业、生产绿色水产品的病害防治准则。本发明所采用的技术方案：琥珀酸在制备水产动物链球菌病防治药物中的用途。所述水产动物链球菌病是罗非鱼无乳链球菌病。所述的药物是以琥珀酸作为活性组份与赋型剂配制成兽药上允许的任意一种剂型。或与其它兽药复配，与兽药赋型剂混合制成兽药上允许的任意一种剂型。所述的剂型可以是乳剂和脂质体等，所用赋型剂可为水、去离子水、硬脂酸钙脂肪酸山梨糖等，复配所用的其它兽药可为无乳链球菌其它致病因子活性抑制剂，如透明质酸酶活性抑制剂、促溶血因子CAMP抑制剂等。本发明通过体外抑制无乳链球菌致病因子β-溶血/溶细胞素活性、拌料投喂对患病罗非鱼进行防治等方法研究琥珀酸防治水产养殖动物细菌性疾病的效果，实验结果表明：琥珀酸浓度达到1.25mg/mL时，对无乳链球菌β-溶血/溶细胞素活性的抑制率为100％；按鱼体重的2％拌料投喂含5.2g/kg琥珀酸饲料，可预防水产动物无乳链球菌病；对于患病罗非鱼，按鱼体重2％拌料投喂含5.2g/kg琥珀酸饲料，连续投喂至所有病鱼痊愈。显示琥珀酸具有显著的抑制罗非鱼源无乳链球菌β-溶血/溶细胞素的活性，对罗非鱼无乳链球菌病具有显著的防治疗效。本发明具有如下有益效果：采用微孔板法筛选获得具有体外抑制无乳链球菌致病因子β-溶血/溶细胞素活性天然化合物琥珀酸，采用罗非鱼病害模型考察琥珀酸防治罗非鱼链球菌病效果，结果显示，琥珀酸对患无乳链球菌病罗非鱼的预防和治疗保护率分别为37.5％和67.74％。琥珀酸通过抑制无乳链球菌致病因子β-溶血/溶细胞素活性，破坏其对宿主的浸染过程，降低其浸染力，达到防治无乳链球菌病的目的，而由于其对菌体无直接杀灭作用，降低病原菌迫于生存压力而产生耐药突变的机率。以琥珀酸为活性成分用于防治水产动物无乳链球菌病，具有来源丰富、价格低廉、无毒、无残留、无污染、高效等优势，符合发展无公害水产业、生产绿色水产品的病害防治准则。具体实施方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施案例中用到的动物模型为罗非鱼，购于海南省某养殖场；无乳链球菌PBSA0901于2009年分离于海南省文昌市，PBSA1505和WC1501于2015年分离于海南省文昌市，HN1404和FWL1402由中国水产科学研究院珠江水产研究所馈赠，以上菌株用作供试菌株。实施例一：琥珀酸体外抑制无乳链球菌致病因子β-溶血/溶细胞素活性按1％的接种量，将OD620nm为1.2各供试菌的菌悬液分别接入含0μg/mL(空白对照组)和0.05mg/mL琥珀酸(实验组)的脑心浸液培养基中，震荡培养6h，3500r/min离心5min，收集菌体，用0.01mmol/LPBS(pH7.4)重悬菌体，OD620nm下测定菌悬液浓吸光值，计算琥珀酸对各供试菌的生长抑制率；采用二倍梯度稀释法测定对照组和实验组菌悬液的溶血活性，平行测定3次，以其平均值计算琥珀酸的溶血抑制率。结果显示，琥珀酸对选取的5株供试菌的β-溶血/溶细胞素活性均有不同程度抑制作用(见表1)。表1琥珀酸对各供试菌株β-溶血抑制的情况供试菌株生长抑制率β-溶血抑制率PBSA09014.47％29.34％PBSA15052.83％83.75％WC15015.79％61.29％HN14042.51％31.05％FWL14020.69％34.12％按1％的接种量，将OD620nm为1.2的无乳链球菌PBSA0901菌悬液分别接入含0(空白对照)、0.078、0.156、0.312、0.625和1.250mg/mL琥珀酸的脑心浸液培养基中，震荡培养6h，3500r/min离心5min，收集菌体，用0.01mmol/LPBS(pH7.4)重悬菌体，测定620nm处菌悬液吸光值，计算琥珀酸对无乳链球菌PBSA0901的生长抑制率；采用二倍梯度稀释法测定各组菌悬液的β-溶血活性，平行测3次，以平均值计算不同浓度琥珀酸的溶血抑制率，并计算琥珀酸半溶血抑制浓度(EC50)。结果显示(见表2)，琥珀酸浓度为1.250mg/mL时对无乳链球菌PBSA0901生长抑制率为(4.25±2.25)％，β-溶血抑制率为100％。表2不同浓度琥珀酸条件下生长抑制和β-溶血抑制的情况培养基中琥珀酸浓度mg/mL生长抑制率β-溶血抑制率0000.0781.80％23.01％0.156-4.64％24.98％0.313-2.89％25.27％0.6251.06％60.08％1.2504.25％100.00％EC500.536mg/mL实施例二：琥珀酸对患无乳链球菌病罗非鱼的治疗效果取体长(10±2)cm、体重(25±5)g的健康罗非鱼，在玻璃水缸(1m×0.5m×0.25m)中暂养7d，每个水缸20尾，水体24h连续充氧，每天投喂鱼体重2％的饲料，每3天换水一次，每次换水量1/3，水体温度为(34±2)℃，将暂养好的罗非鱼分成空白组、对照组和琥珀酸组3组，每组两个平行缸，对照组和琥珀酸组腹腔注射浓度为7.5×107cfu/mL无乳链球菌PBSA0901菌悬液200μL，空白组腹腔注射PBS200μL，2h后，琥珀酸组罗非鱼按鱼体重2％投喂含5.2g/kg琥珀酸饲料，空白组和对照组罗非鱼投喂日常饲料，一日两次，连续观察14d，结果见表3，保护率为(67.7±4.6)％。表3琥珀酸拌料投喂感染无乳链球菌罗非鱼的死亡情况空白组对照组琥珀酸组平均死亡量015.5±0.75.0±0.0平均死亡率(％)0.0±0.077.5±3.525.0保护率(％)67.7±4.6实施例四：琥珀酸对患无乳链球菌病罗非鱼的预防效果选取体长(10±2)cm、体重(25±5)g的健康罗非鱼，在玻璃水缸(0.5m×0.5m×0.4m)中暂养7d，每个水缸12尾，24h连续充氧，每天按2％鱼体重投喂空白饲料，每天2次，每3天换水一次，每次换水量1/3，水体温度为(34±2)℃，将暂养好的罗非鱼分成空白、对照和琥珀酸3组，每组1个缸，琥珀酸组罗非鱼按鱼体重2％投喂含5.2g/kg琥珀酸饲料，空白组和对照组罗非鱼投喂空白饲料，一日两次，连续投喂7天，第8天对照组和琥珀酸组罗非鱼腹腔注射浓度为7.5×108cfu/mL无乳链球菌PBSA0901菌悬液200μL，空白组腹腔注射PBS200μL，继续按原方法投喂饲料，连续观察14d。对照组死亡10尾，琥珀酸组死亡5尾(见表4)，保护率为40.0％。表4琥珀酸拌料投喂感染无乳链球菌罗非鱼的死亡情况空白组对照组琥珀酸组死亡量0106死亡率(％)0.083.350.0保护率(％)40.0以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3