本发明涉及生物治疗领域，尤其涉及一种肿瘤细胞疫苗及其制备方法。
背景技术：
免疫细胞治疗癌症的技术可分为被动免疫和主动免疫。被动免疫使用的是体外激活的免疫效应细胞，主要是CD8-T细胞及其衍生种类的细胞，输入体内后，直接攻击肿瘤细胞。这方面的主要技术有CAR-T(嵌合抗原受体—T细胞)，CTL(细胞毒T淋巴细胞)，TCR-T(T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞)，TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)等技术。这些细胞在临床上的表现喜忧掺半。除了CAR-T在对一些血液癌有效，FDA因此批准两款CAR-T产品上市，其它的都依然在研究或临床试验阶段。一个不容忽视的事实是，这些细胞对实体瘤的疗效都不理想。这个限制看上去是针对细胞疗法，因为针对相同靶分子的抗体药物却能有效地作用于实体瘤。由此可见，体液免疫是肿瘤免疫治疗中(至少对于实体瘤)不可或缺的一个方面。
眼下，主动免疫治疗一般指的是用肿瘤细胞疫苗和免疫树突状细胞疫苗免疫癌症患者。曾经，病原菌菌体和菌体的提取物备用做疫苗免疫肿瘤病人，但是这类免疫手段已经不再作为癌症的免疫治疗手段，因此被移出了这个分类。最早的肿瘤疫苗采用的患者的肿瘤细胞或提取物辅以免疫刺激剂免疫患者，但无数的临床实践证明这种策略是无效的：自体的肿瘤细胞疫苗免疫不能在患者体内刺激出有效的免疫应答，从而限制肿瘤的生长和发展。尽管FDA批准过一款这样疫苗Provenge，用于治疗前列腺癌，但临床效果十分有限，预计不久就会被淘汰。因此，一般认为肿瘤疫苗并不是癌症治疗的出路。
自从树突细胞的发现和其在免疫启动中的关键功能的阐明，以及发现装载了异体抗原后的自体树突细胞具有抗原性(Madhav V.Dhodapka r et al.,J.Clin.Invest.104:173-180(1999)，基于树突细胞的各种疫苗便被设计和开发出来，试验的内容包括各种细胞培养条件，抗原的来源和装载策略，以及免疫的途径和佐剂的配伍。可是，经过多年的努力，直到最近以前，临床结果都表明，这些疫苗并不能在患者身上刺激出足够强的应答(Gabriela Andrea Pizzurro and María Marcela Barrio Frontiers in Imuunology,March 2015,Volume 6,Article 91)。
融合患者的树突细胞和肿瘤细胞制成的融合细胞疫苗曾被寄予希望，因为融合细胞中的肿瘤细胞部分的蛋白组分会在融合细胞中继续合成，而被融合细胞中树突细胞成分所加工。从理论上说，肿瘤细胞的所有新生抗原肽都有可能被递呈到融合细胞的表面。用这样的融合细胞疫苗去免疫自体患者，有望刺激出强烈的免疫应答，限制肿瘤的生长。遗憾的是，虽然这个策略在体外系统中非常成功，而在体内却不能刺激出足够强的免疫应答，因而在临床中败下阵来(Gong J,et al.,.Nat Med 3(5):558-561,1997,Koido S,Gong J.Anticancer Res 33(2):347-354,2013)。
前不久，斯坦福大学的研究人员报道了新的DC疫苗策略。在体外，他们将异源抗体和肿瘤细胞共保温形成复合体，然后将复合体和同肿瘤同源的DC共保温。作者发现，如此得到的DC疫苗可以在同源个体中诱导出强烈的免疫应答，不仅能够抑制新接种的同种肿瘤细胞的生长，还能抑制已经存在的同种肿瘤的发展(Yaron Carmi et al.,Nature，2015May 7；521(7550):99–104)。后续的研究进一步阐明，为了有效抑制和杀伤体内的肿瘤，必须整体激活免疫系统(Spitzer MH et al.,Cell，2017Jan 26；168(3):487-502.)。但是，任何以DC疫苗为手段的策略，都存在操作上的困难，费时，费用昂贵的问题。
最近，美国和德国的研究团队分别报道了利用肿瘤新生抗原肽抗击肿瘤的成果。他们都是通过对肿瘤组织的基因组的全序列分析，或表达基因组的全序列分析，定位所有的突变点，然后利用MHC结合肽预测软件分析，确定新生抗原肽的范围。哈佛团队直接合成抗原肽，然后将抗原肽连同免疫刺激剂一同免疫同源患者(Ott PA et al.,Nature.2017Jul 13；547(7662):217-221.)；德国的团队则是合成编码抗原肽的RNA，并将其包埋在脂质体内，然后将脂质体回输到同源患者，激活血浆中的DC细胞(Kranz LM et al.,Nature.2016Jun 16；534(7607):396-401.)。从有限的临床数据看，两种方法都获得了理想的治疗效果。
以上这些研究的一个共同的特点是体现了一对一的治疗思想，即试图用个体肿瘤组织的全部突变信息来刺激或制备DC细胞，从而激发同源个体体内的免疫系统，对体内的同源肿瘤实施攻击。这样的策略代表着癌症治疗的方向，但是，其操作的代价是巨大的，无论是时间上还是金钱上。
技术实现要素：
针对上述存在的现有技术的问题，本发明提供了一种肿瘤疫苗制备的新思路和新方法，本发明一方面提供了一种肿瘤细胞疫苗，具体方案如下：
一种肿瘤细胞疫苗，该肿瘤细胞疫苗以经过化合物修饰的肿瘤细胞作为主要活性成分，所述化合物为抗原递呈细胞可识别分子；所述肿瘤细胞为灭活的同源肿瘤细胞，即，来源于患者本人的肿瘤细胞。
优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子直接修饰所述肿瘤细胞的表面。
优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子通过中间化合物间接修饰肿瘤细胞表面。
优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子是异体抗体，所述异体抗体即为外源性抗体。所述异体抗体来源于没有经过特异免疫反应刺激的异体血清或抗体制剂，或经肿瘤细胞或者肿瘤细胞提取物免疫刺激的异体血清或抗体制剂。
优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子是抗原递呈细胞上模式识别受体(pattern-recognition receptors)所识别的分子，包括自然存在的和人工合成的。
优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子是病原菌表面相关分子。更优选的，所述抗原递呈细胞可识别分子是甘露聚糖肽。
优选的，所述经过化合物修饰的肿瘤细胞为所述肿瘤疫苗的唯一活性成分。所述肿瘤疫苗的其他成分均为辅料，不具有活性。
本发明第二方面提供了制备上述肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：
S1：将同源的肿瘤细胞提取后进行灭活处理，然后用抗原递呈细胞可识别分子修饰其表面后得到经修饰后的肿瘤细胞；
S2：采用人体疫苗制剂常规方法将S1中得到的经修饰后的肿瘤细胞制备成任何可药用的疫苗注射剂。
优选的，在步骤S1之前，还包括步骤S0：将同源的肿瘤细胞提取后进行大规模的细胞培养得到大量的同源肿瘤细胞。
优选的，所述S1中灭活处理为辐照灭活。
更优选的，所述辐照灭活是钴60灭活，灭活条件为10～20Grays的剂量照射10～20分钟。
所述S1中的抗原递呈细胞可识别分子可以直接修饰肿瘤细胞表面或者通过中间化合物间接修饰肿瘤细胞表面。修饰反应可以包括一种或数种抗原递呈细胞识别的化合物；修饰反应的化学本质可以是共价连接或是非共价亲和结合，或两种方式的联合使用。
本发明第三方面还公开了一种上述肿瘤细胞疫苗在制备治疗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开创性地使用抗原递呈细胞可识别分子体外修饰肿瘤细胞，如此修饰后的肿瘤细胞疫苗可以在体内被抗原递呈细胞识别，进而被吞噬。内吞后的肿瘤细胞内容物(包括肿瘤相关抗原分子和新生抗原肽)被抗原递呈细胞加工后表现或递呈在细胞表面，继而激活相应的免疫效应细胞，启动免疫系统的整体反应，达到限制肿瘤发展和治疗肿瘤的目的。本发明中公开的肿瘤疫苗制备简单，成本低，并且制备周期短，为本领域提供了一种新的有效的肿瘤疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于帮助说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1肿瘤疫苗的制备
1.1实验材料
sp2/0细胞，源于美国ATCC；甘露聚糖肽-购于上海源叶生物科技有限公司(中检所产品)；EDC，购于上海源叶生物科技有限公司(Acros产品)；MES溶液(0.1mol/L，pH5.0)，购于上海源叶生物科技有限公司。
1.2实验步骤
本实施例中采用甘露聚糖肽直接修饰sp2/0细胞，具体操作如下：
将107个sp2/0细胞、1毫克甘露聚糖肽，1毫克EDC加入1毫升MES缓冲液(0.1mol/L，pH5.0)中，室温下在摇床上混匀。反应2小时后得到经修饰后的sp2/0细胞，然后灭活细胞，采用疫苗制剂常规方法将其制备成任何可药用的疫苗注射剂即得到肿瘤疫苗。
实施例2肿瘤疫苗的制备
1.1实验材料
sp2/0细胞，源于美国ATCC；甘露聚糖肽-购于上海源叶生物科技有限公司(中检所产品)；EDC，购于上海源叶生物科技有限公司(Acros产品)；MES溶液(0.1mol/L)，购于上海源叶生物科技有限公司；链亲和素(SA)，购于北京索莱宝科技有限公司；生物素化试剂，购于美国Pierce公司。
1.2实验步骤
本实施例中采用甘露聚糖肽间接修饰sp2/0细胞，具体操作如下：
(1)生物素化sp2/0细胞
将107个sp2/0细胞和10-200微克生物素化试剂加入1毫升PBS(pH7.6)中，在室温下不停混匀，反应2小时后，离心收集细胞，离心条件800-1500rpm，5min。然后用PBS反复洗涤2次，去除细胞中残留的生物素化试剂，然后将细胞用PBS重悬浮在PBS中，得到生物素化的sp2/0细胞。
(2)用EDC法连接链亲和素和甘露聚糖肽
将0.1毫克链亲和素、1毫克甘露聚糖肽，0.1毫克EDC加入1毫升MES缓冲液(0.1mol/L，pH5.0)中，室温下在摇床上不停混匀。反应2小时后得到链亲和素/甘露聚糖肽耦合物。
(3)生产肿瘤疫苗
在1毫升PBS中，按107细胞和0.1-1毫克SA的比例混合步骤(1)中得到的生物素化的sp2/0细胞和步骤(2)中得到的相互结合的链亲和素和甘露聚糖肽，室温放置20分钟，不时混匀。反应结束后，离心收集细胞(800-1500rpm，5min)。然后用PBS反复洗涤2次，去除细胞中残留的反应物，然后将细胞用PBS重悬得到经修饰后的sp2/0细胞(107细胞/毫升)。
实施例3肿瘤疫苗用于免疫实验
1.1实验动物
BALB/C小鼠购于中国科学院上海实验动物中心。Sp2/0肿瘤细胞源于BALB/C小鼠，所以具有同源性。接种到BALB/C小鼠能导致肿瘤发生。
1.2免疫反应
10只小鼠分两组，实验组和对照组，每组5只。实验组接受sp2/0细胞疫苗(～106细胞)，对照组接受PBS。免疫共两次，间隔6天(D1，D7)。大腿内侧的皮下注射，两点，每点0.25毫升。
1.3肿瘤细胞接种
第12天给所有小鼠接种没有修饰过的sp2/0细胞(105细胞/每只)，腹部接种。随后观察肿瘤发生的情况。
1.4实验结果
对照组全部长出肿瘤，并在一个月内死亡。而实验组3只小鼠没长出肿瘤，一个月后再次接种sp2/0瘤细胞，也不长肿瘤。这样的结果表明，修饰过的肿瘤细胞在小鼠体内刺激出了免疫抗性，能抵抗同种肿瘤细胞的挑战，并且获得了免疫记忆，可防止同类肿瘤的发生。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。