本发明涉及一种天然产物提取的方法，具体涉及银杏叶粉快速发酵生产高品质提取物的方法。
背景技术：
：银杏叶提取物(GinkoBilobaExtract，GBE)是从银杏科植物银杏干燥的茎叶中提取得到的一种浅棕黄色可流动性粉末，其主要含有黄酮类化合物和二萜内酯类化合物，具有扩张心脑血管、改善微循环、抑制血小板凝聚、抗氧化、清除和抑制氧自由基、延缓衰老、抗病毒、抗菌消炎、调节内分泌等生理作用。黄酮类化合物在银杏叶中的含量约占6％，有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及其苷类，其主要成分为槲皮素，山奈酚和异鼠李素；内酯类化合物主要有银杏内酯A，银杏内酯B，银杏内酯C和白果内酯。现行国际通用的银杏叶提取物质量标准，即标准银杏叶提取物(银杏总黄酮含量≥24％，总内酯含量≥6％，银杏酸含量≤10ppm)，由上世纪七十年代德国率先制定。研究表明高含量的银杏黄酮较之标准银杏黄酮在治疗心脑血管疾病方面有更好的疗效。现有的银杏叶提取物的生产方法有水提法，有机溶剂提取法，超临界流体萃取法，超声辅助提取法等，但都存在提取效率底，成本高等缺陷。银杏叶中黄酮类和内酯类物质包裹在细胞壁内(由β-D葡糖以1，4-β糖苷键连接)，传统方法大多不能完全破碎细胞壁，限制了黄酮类物质的溶出，严重影响了提取效率。采用里氏木霉对银杏叶进行发酵，产生的纤维素酶能将组成银杏叶细胞壁的纤维素骨架降解成葡萄糖，进而破坏细胞骨架结构，增加细胞内黄酮和内脂等活性成分的溶出。鉴于银杏叶提取物其独特的生理作用、临床治疗和保健作用，使其成为国际国内研究开发的热点之一。因此不断开发新的提取工艺技术提高银杏叶提取物的品质对工业化生产具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术中存在的银杏叶提取物中黄酮类和内酯类提取率低、有毒物质银杏酸含量高等缺点而提出的一种银杏叶粉快速发酵生产高品质银杏叶提取物的方法，其操作简单，显著地提高了银杏叶提取物的产率和品质，适合于工业化生产。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种银杏叶粉快速发酵生产高品质银杏叶提取物的方法，其方法步骤包括：(1)李氏木霉菌株活化后取1mL菌悬液加入到100～200倍灭菌的液体培养基中在恒温摇床上于30℃、200r/min条件下培养1～5天，然后转入液体发酵瓶中补加10～20倍的培养基于30℃、200r/min条件下通入无菌空气培养2～5天制成种子液。(2)将干燥的银杏叶粉碎至20～40目，按料液比1:5～1:8浸泡于去离子水中调整pH3～6，抽入发酵罐中116～125℃灭菌3～10min；(3)发酵液灭菌后降温至25～30℃，然后按发酵液中银杏叶粉干重质量的1％～10％加入里氏木霉种子液，25～30℃通气发酵2～10天，搅拌转速180～300r/min；(4)发酵结束后按料液比1:7～1:12用20％～95％的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1～3h，合并提取液过滤后减压浓缩；(5)浓缩液用LX-5大孔吸附树脂纯化，依次用去离子水和10％～20％的乙醇溶液洗杂，最后用65％～85％的乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩至无醇味，过滤后用去离子水调整至合适浓度；(6)然后用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，脱酸提取液经浓缩、干燥、粉碎得银杏叶提取物。作为优选，步骤一中菌种活化后加入100倍的液体培养基在恒温摇床上于30℃、200r/min条件下培养3天，然后转入液体发酵瓶中补加15倍的培养基于30℃、200r/min条件下通入无菌空气培养5天制成种子液。作为优选，步骤二中所用的干燥银杏叶粉末为采摘于7～9月份的银杏鲜叶经清洗、50～70℃恒温干燥、粉碎至20～40目的原料。作为优选，步骤二中发酵液固液比为1:5～1:8。作为优选，步骤二中调整发酵液pH值时所用的酸为2mol/L的盐酸或醋酸。作为优选，步骤二中发酵液灭菌温度为116～125℃，灭菌时间为3～10min。作为优选，步骤三中发酵液灭菌后降温至25～30℃，然后按发酵液中银杏叶粉干重质量的1％～10％加入里氏木霉种子液进行发酵。作为优选，步骤三中发酵条件为25～30℃通气发酵2～10天，搅拌转速180～300r/min。作为优选，步骤四中发酵结束后按料液比1:7～1:12用20％～95％的乙醇溶液提取2～3次，每次1～3h，合并提取液过滤后减压浓缩。作为优选，步骤四中回流提取温度为40～80℃，搅拌转速120～300r/min。作为优选，步骤五中选用LX-5大孔吸附树脂对银杏提取浓缩液进行纯化，使用之前需对期进行预处理：(1)NaOH处理：用3～4BV的4％NaOH溶液，以1BV/h的流速通过树脂层，将液面放至树脂层上20～30mm处保留溶液2～4h，然后将剩余的4％NaOH溶液以1～2BV/h的速度过柱，全部通入后再用去离子水冲洗，直到出水pH7～9即可。(2)HCl处理：用约3～4BV的4％的HCl溶液，按上述通过NaOH的方法通入，浸泡2～4h，全部通入后，用去离子水冲洗至pH5～7为止。(3)醇处理：用3～4BV的95％以上的乙醇或甲醇以1BV/h的速度过柱，出口醇浓度达到进口醇浓度时，停止进醇，树脂层上方保留至少20～30mm液面，保留溶液2～4h，然后将剩余的乙醇以1BV/h的速度过柱，注意观察流出液，至清澈无浑浊时停止。然后用去离子水以1～2BV/h的流速淋洗2～3h，树脂层上方保留5～15mm液体，以免干柱。新树脂柱及使用过3～5次的树脂柱需进行上述处理，以保证树脂柱的吸附性能。作为优选，步骤五中选用LX-5大孔吸附树脂进行纯化，上样吸附速率为1～2BV/h，待树脂柱出口物料浓度为进料口浓度5％时判定为吸附饱和(1t树脂大约可吸附1.5t银杏叶的提取物浓缩液)。作为优选，步骤五中树脂柱吸附饱和后分别用3～4BV的去离子水和10％～20％的乙醇溶液洗杂，控制流速3～4BV/h。作为优选，步骤五中洗杂结束后用3～4BV65％～85％的乙醇溶液以1～2BV/h的速度进行洗脱，洗脱液减压浓缩至原体积的1/3～1/4，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。作为优选，步骤六中将步骤四中所得溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率2BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中60～75℃干燥，粉碎后得银杏叶提取物。在本发明提供的生产方法中，选用里氏木霉对银杏叶进行发酵，在发酵过程中将产生大量的纤维素酶，能更好的破除植物细胞壁，使细胞内生物活性成分更好的溶出，从而大大提高提取效率。同时配合使用LX-5大孔吸附树脂和LXD-200型脱酸树脂可大幅提高银杏叶提取物中黄酮类和内酯类目标成分的富集比，脱除有毒物质银杏酸，提高产品质量。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做详细阐述，所述的实施例仅是对本发明的技术方案进行解释和阐述，而不是对本发明的技术方案进行限制。实施例1(1)取20～40目干燥的银杏叶粉末50.0g，按1:5(m/v)的料液比用水稀释，搅拌均匀后用2mol/L盐酸调整溶液pH至3.0，装入500mL三角瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中116℃灭菌10min。(2)灭菌结束后降温至25℃，无菌环境下按2％接种量加入1mL里氏木霉种子液，于25℃恒温摇床上发酵10天，摇床转速180r/min。(3)发酵结束后加入200mL95％乙醇溶液进行回流提取，提取温度40℃，提取时间3h，提取结束后过滤，滤渣再加500mL20％乙醇按上述条件提取1次，过滤，合并2次滤液，浓缩至300mL。(4)用LX-5大孔吸附树脂对提取液进行纯化，柱床体积100mL，上样速率1BV/h，然后依次用3BV的去离子水和10％的乙醇溶液洗杂，控制流速3BV/h，最后用4BV55％的乙醇溶液以1BV/h的速度进行洗脱，洗脱液在50℃，-0.1Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/3，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。(5)上述溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率1BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中70℃干燥至恒重，粉碎后得银杏叶提取物。(6)取适量银杏叶提取物按照中国药典所示方法对其中的总黄酮和总内酯含量进行测定。结果所示获得银杏叶提取物3.08g，提取率为6.16％，总黄酮含量为30.19％，总内酯含量7.96％，总银杏酸含量为3.73ppm。实施例2(1)取20～40目干燥的银杏叶粉末100.0g，按1:6(m/v)的料液比用水稀释，搅拌均匀后用2mol/L盐酸调整溶液pH至4.0，分装入4个500mL三角瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中118℃灭菌8min。(2)灭菌结束后降温至27℃，无菌环境下按4％接种量每瓶加入1mL里氏木霉种子液，于27℃恒温摇床上发酵8天，摇床转速220r/min。(3)发酵结束后每瓶加入250mL95％乙醇溶液进行回流提取，提取温度55℃，提取时间2h，提取结束后过滤，滤渣再加800mL40％乙醇按上述条件提取2次，过滤，合并3次滤液，浓缩至1000mL。(4)用LX-5大孔吸附树脂对提取液进行纯化，柱床体积150mL，上样速率1.5BV/h，然后依次用3BV的去离子水和15％的乙醇溶液洗杂，控制流速3BV/h，最后用4BV65％的乙醇溶液以1BV/h的速度进行洗脱，洗脱液在60℃，-0.09Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/3，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。(5)上述溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率1BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中70℃干燥至恒重，粉碎后得银杏叶提取物。(6)取适量银杏叶提取物按照中国药典所示方法对其中的总黄酮和总内酯含量进行测定。结果所示获得银杏叶提取物6.35g，提取率为6.35％，总黄酮含量为29.88％，总内酯含量8.04％，总银杏酸含量为5.24ppm。实施例3(1)取20～40目干燥的银杏叶粉末200.0g，按1:7(m/v)的料液比用水稀释，搅拌均匀后用2mol/L醋酸调整溶液pH至5.0，分装入7个1000mL三角瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌6min。(2)灭菌结束后降温至28℃，无菌环境下按6％接种量每瓶加入1.7mL里氏木霉种子液，于28℃恒温摇床上发酵6天，摇床转速250r/min。(3)发酵结束后每瓶加入300mL95％乙醇溶液进行回流提取，提取温度70℃，提取时间1.5h，提取结束后过滤，滤渣再加2000mL60％乙醇按上述条件提取2次，过滤，合并3次滤液，浓缩至2000mL。(4)用LX-5大孔吸附树脂对提取液进行纯化，柱床体积300mL，上样速率1.5BV/h，然后依次用3BV的去离子水和15％的乙醇溶液洗杂，控制流速3BV/h，最后用4BV75％的乙醇溶液以1BV/h的速度进行洗脱，洗脱液在70℃，-0.08Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/3，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。(5)上述溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率1BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中70℃干燥至恒重，粉碎后得银杏叶提取物。(6)取适量银杏叶提取物按照中国药典所示方法对其中的总黄酮和总内酯含量进行测定。结果所示获得银杏叶提取物12.77g，提取率为6.38％，总黄酮含量为30.26％，总内酯含量8.12％，总银杏酸含量为8.69ppm。实施例4(1)取20～40目干燥的银杏叶粉末500.0g，按1:8(m/v)的料液比用水稀释，搅拌均匀后用2mol/L醋酸调整溶液pH至6.0，分装入20个1000mL三角瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中125℃灭菌4min。(2)灭菌结束后降温至30℃，无菌环境下按8％接种量每瓶加入2mL里氏木霉种子液，于30℃恒温摇床上发酵5天，摇床转速300r/min。(3)发酵结束后每瓶加入100mL95％乙醇溶液进行回流提取，提取温度80℃，提取时间1.0h，提取结束后过滤，滤渣再加5000mL85％乙醇按上述条件提取2次，过滤，合并3次滤液，浓缩至5000mL。(4)用LX-5大孔吸附树脂对提取液进行纯化，柱床体积800mL，上样速率1.5BV/h，然后依次用3BV的去离子水和15％的乙醇溶液洗杂，控制流速3BV/h，最后用4BV85％的乙醇溶液以1BV/h的速度进行洗脱，洗脱液在70℃，-0.08Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/3，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。(5)上述溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率1BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中70℃干燥至恒重，粉碎后得银杏叶提取物。(6)取适量银杏叶提取物按照中国药典所示方法对其中的总黄酮和总内酯含量进行测定。结果所示获得银杏叶提取物31.05g，提取率为6.21％，总黄酮含量为29.33％，总内酯含量8.26％，总银杏酸含量为7.54ppm。空白组(1)取20～40目干燥的银杏叶粉末500.0g，按1:8(m/v)的料液比用水稀释，搅拌均匀后用2mol/L醋酸调整溶液pH至6.0，分装入20个1000mL三角瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中125℃灭菌4min。(2)灭菌结束后降温至30℃，无菌环境下按8％接种量每瓶加入2mL蒸馏水，于30℃恒温摇床上震荡5天，摇床转速300r/min。(3)结束后每瓶加入100mL95％乙醇溶液进行回流提取，提取温度80℃，提取时间1.0h，提取结束后过滤，滤渣再加5000mL85％乙醇按上述条件提取2次，过滤，合并3次滤液，浓缩至5000mL。(4)用LX-5大孔吸附树脂对提取液进行纯化，柱床体积800mL，上样速率1.5BV/h，然后依次用3BV的去离子水和15％的乙醇溶液洗杂，控制流速3BV/h，最后用4BV85％的乙醇溶液以1BV/h的速度进行洗脱，洗脱液在70℃，-0.08Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/3，过滤后用去离子水调整至浓缩液体积的2倍。(5)上述溶液选用LXD-200大孔吸附树脂脱除银杏酸，控制上样速率1BV/h，收集流出液，减压浓缩至浸膏状，然后于真空干燥箱中70℃干燥至恒重，粉碎后得银杏叶提取物。(6)取适量银杏叶提取物按照中国药典所示方法对其中的总黄酮和总内酯含量进行测定。结果所示获得银杏叶提取物21.20g，提取率为4.24％，总黄酮含量为30.07％，总内酯含量7.48％，总银杏酸含量为6.68ppm。实施例1-4和空白组进行对比如表1所示，结果显示采用银杏叶粉快速发酵的方法生产银杏叶提取物的方法较普通方法生产银杏叶提取物能显著提高银杏叶中有效成分黄酮和内酯的浸出，极大的提高提取效率。表1发酵法和普通方法生产银杏叶提取物结果比较组别提取物总黄酮含量/％提取物总内酯含量/％提取物产率/％实施例130.197.966.16实施例229.888.046.35实施例330.268.126.38实施例429.338.266.21空白组30.077.484.24应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。当前第1页1 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