本发明涉及动物模型技术领域，具体地说，是一种建立小鼠肺纤维化合并肺气肿模型的方法。
背景技术：
肺纤维化合并肺气肿综合征(combined pulmonary fibrosis and emphysema syndrome，CPFE)近年来逐渐被认为是一种独立的疾病，主要特征为上肺野为主的肺气肿和下肺野为主的纤维化同时存在，临床表现为严重的运动性呼吸困难，肺功能指标异常，弥散能力明显下降及活动后低氧血症，同时CPEF病人并发肺动脉高压、肺癌的风险显著升高。随着吸烟人群的增多和城市空气污染的不断加重，肺纤维化合并肺气肿的发病率和死亡率逐年上升。
目前有研究者对小鼠进行连续13个月的香烟烟雾暴露联合博来霉素气管滴入，成功建立了CPFE模型，但此法建模时间较长，且气管滴入博来霉素易导致小鼠死亡，耗时且耗力。
本发明采用小鼠鼻腔内滴入PM2.5联合臭氧暴露的方法建立小鼠肺纤维化合并肺气肿(CPEF)模型，通过对其肺功能、BALF中炎症细胞计数、肺组织形态学指标及肺组织匀浆羟脯胺酸含量的检测分析，并评价该方法建立CPEF模型的可行性。
经检索，本发明的小鼠肺纤维化合并肺气肿模型的建立方法目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供PM2.5联合臭氧的一种新用途。
本发明的第二个目的是，提供一种建立小鼠肺纤维化合并肺气肿模型的方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：PM2.5和臭氧在制备建立肺纤维化合并肺气肿动物模型的药物中的应用。
进一步地，PM2.5混悬液和臭氧在制备建立肺纤维化合并肺气肿动物模型的药物中的应用。
进一步地，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用PBS缓冲液配制而成。
进一步地，所述的动物为啮齿类动物。
进一步地，所述的啮齿类动物为小鼠。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种肺纤维化合并肺气肿动物模型的建立方法，所述的建立方法为：经鼻滴入PM2.5混悬液及暴露于臭氧中建立肺纤维化合并肺气肿动物模型。
进一步地，所述的PM2.5混悬液为PM2.5用PBS缓冲液配制而成。
进一步地，所述的PM2.5混悬液的制备方法为：使用PM2.5采样器，采用玻璃纤维滤膜，采集大气PM2.5，将采集到颗粒物的滤膜置于去离子水中，使用超声波清洗器洗脱下来，然后冷冻真空干燥，收集PM2.5，用PBS缓冲液配制成PM2.5混悬液，超声震荡混匀。
进一步地，所述的动物为小鼠，所述的PM2.5混悬液剂量为7.8mg/kg，滴注体积为50μl。
进一步地，所述的建立方法为：给予小鼠PM2.5混悬液经鼻滴入，剂量为7.8mg/kg，滴注体积为每只50μl/195μg，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧中，浓度为2.5ppm，3小时；每周两次，连续8周。
本发明优点在于：
1、本发明采用PM2.5鼻腔滴入联合臭氧暴露的方法探索建立CPFE模型，通过对小鼠进行肺功能检测、肺部病理分析及肺组织羟脯氨酸含量测定等方法，证明了连续8周的PM2.5鼻腔滴入联合臭氧暴露可成功建立CPFE模型。
2、本发明的小鼠肺纤维化合并肺气肿模型的建立方法操作简便，创伤性小。
附图说明
附图1是肺组织病理染色观察。图A、B、C为肺组织HE染色，A：对照组；B：臭氧暴露组；C、臭氧暴露+PM2.5组。图D、E、F为气管Masson染色，D：对照组；E：臭氧暴露组；F、臭氧暴露+PM2.5组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
材料与方法
一、材料
C57/BL6小鼠24只，22-25g，由上海西必普凯公司提供，饲养于本院动物中心的SPF级环境中，本实验得到医院伦理委员会许可。臭氧制造仪Model 300由德国AB Aqua Medic GmbH公司提供。肺功能仪(Forced Maneuvers系统)由英国EMMS公司提供。小鼠气体麻醉机和异氟烷购自上海玉研仪器公司。细胞离心机(Shandon Cytospin)由美国Thermo Fisher公司提供。刘氏染液购自珠海贝索生物技术有限公司。羟脯氨酸试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
二、PM2.5采集及其悬液制备
PM2.5使用崂应2030型中流量PM2.5采样器(青岛崂山应用技术研究所)于上海市某建筑物楼顶连续采集，采样时间为2017年1月到2017年6月。将采集到颗粒物的玻璃纤维素滤膜剪裁后，浸入超纯水中，低温超声震荡，洗脱PM2.5，然后真空冷冻干燥，收集PM2.5，-20℃保存备用。使用前，称取一定量的PM2.5，用PBS缓冲液配制实验所需浓度的PM2.5悬液，超声震荡混匀。
三、实验方法
1、建立CPFE模型：24只C57/BL6小鼠适应性喂养一周后，随机分为对照组、臭氧暴露+PBS滴鼻组、臭氧暴露+PM2.5滴鼻组，每组8只。鼻滴前，小鼠被放在气体麻醉机麻醉箱中，异氟烷雾化麻醉，对照组和臭氧暴露+PBS滴鼻组给予PBS 50μl经鼻滴入，臭氧暴露+PM2.5滴鼻组给予PM2.5混悬液经鼻滴入，剂量为7.8mg/kg，滴注体积为每只50μl/195μg。24小时后，臭氧暴露组和臭氧暴露+PM2.5滴鼻组小鼠置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，浓度为2.5ppm，3小时。对照组小鼠进行空气暴露。每周两次，连续8周。
2、肺功能测定：造模结束24小时后，小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠150-200μl后，气管切开并插管，置入体积描记箱(Forced Maneuvers系统)，并连接电脑控制的呼吸机，呼吸频率150次/分。监测吸气量(IC)、功能残气量(FRC)、肺总量(TLC)、用力肺活量(FVC)、第25ms、50ms的用力呼气量(FEV25,FEV50)、肺顺应性(Cchord)。
3、支气管肺泡灌洗液(BALF)：腹腔注射0.2ml的1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，用2ml PBS进行支气管肺泡灌洗，回收BALF，4℃，1000r/min离心10分钟。弃上清，200μl PBS重悬沉淀，显微镜下计数，通过细胞离心机进行细胞涂片，采用刘氏染液染色。显微镜下计数至少500个细胞，并区分各类炎症细胞的比例。
4、组织病理分析：左肺应用4％福尔马林灌注、固定，石蜡包埋，切片，片厚4μm，进行HE染色及Masson染色。HE染色评估支气管周围的肺部炎症积分。0＝无炎症反应，1＝轻度炎症反应，支气管壁、血管壁或肺泡间隔有少量炎症细胞，2＝中度炎症反应，支气管壁、血管壁、肺泡间隔有成片炎症，3＝重度炎症反应，支气管壁、血管壁、肺泡间隔有广泛的炎症。在显微镜下，测量平均内衬间隔(Lm)，应用目镜测微尺，计数5条线(长度500μm)上的肺泡间隔数。Lm(μm)＝500/肺泡间隔数。Masson染色后，通过Image J图像分析软件测量气道上皮下胶原沉积面积(Wcol)、气道基底膜周长(Pbm)，计算气道上皮下胶原沉积厚度(Wcol/Pbm)。
5、肺组织羟脯氨酸的测定：用碱水解法按试剂盒说明书操作测定肺组织羟脯氨酸含量，计算公式：羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)＝(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5μg/ml)×水解液总体积(10ml)/组织湿重(mg)。
四、统计学处理
数据以表示。采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，两组数据之间的差异性进行t检验，各组之间的差异性进行单因素方差分析，Bonferroni检验或DunnettT3检验。P<0.05表示差异有显著性。
结果
一、肺功能
臭氧暴露+PBS组小鼠的IC、FRC、TLC、Cchord均高于对照组小鼠，FEV25/FVC、FEV50/FVC均低于对照组小鼠。臭氧暴露+PM2.5组小鼠的IC、Cchord、FEV25/FVC和FEV50/FVC均低于对照组和臭氧暴露组，FRC高于空气组和臭氧暴露组，TLC高于对照组小鼠。结果见表1。
表1各组肺功能参数
注：与对照组小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01。与臭氧暴露组小鼠相比，#P<0.05，##P<0.01。
二、BALF细胞计数
与对照组小鼠相比，臭氧暴露+PBS组和臭氧暴露+PM2.5组小鼠细胞总数、巨噬细胞数、中性粒细胞数及嗜酸性粒细胞数均增高。同时，臭氧暴露+PM2.5组小鼠BAL液中细胞总数、中性粒细胞数及淋巴细胞数均明显高于臭氧暴露+PBS组。结果见表2。
表2各组BALF细胞计数(×103/ml)
注：与对照组小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01。与臭氧暴露组小鼠相比，#P<0.05，##P<0.01。
三、肺组织病理染色观察
1、肺组织HE染色
臭氧暴露+PBS组和臭氧暴露+PM2.5组出现明显的肺泡壁断裂，肺泡空间扩大，平均肺泡内衬间隔Lm高于对照组小鼠。肺部炎症积分PM2.5鼻腔滴入组小鼠Lm与对照组小鼠无差别。典型的肺组织图片见图1的A、B、C，结果见表3。
2、肺组织Masson染色
臭氧暴露+PM2.5组小鼠支气管、血管壁周围出现明显的炎症细胞浸润，且蓝色胶原沉积明显加重，炎症积分和气道上皮下胶原沉积厚度(Wcol/Pbm)明显高于对照组和臭氧暴露+PBS组。典型的Masson染色图片见图1的D、E、F，结果见表3。
四、肺组织羟脯氨酸含量
与对照组和臭氧暴露+PBS组相比，臭氧暴露+PM2.5组小鼠肺组织内羟脯氨酸含量明显增高。结果见表3。
表3各组肺部炎症积分、Lm、胶原沉积厚度及肺组织羟脯氨酸含量
注：与对照组小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01。与臭氧暴露组小鼠相比，#P<0.05，##P<0.01。
讨论
本发明采用PM2.5鼻腔滴入联合臭氧暴露的方法探索建立CPFE模型，通过对小鼠进行肺功能检测、肺部病理分析及肺组织羟脯氨酸含量测定等方法，证明了连续8周的PM2.5鼻腔滴入联合臭氧暴露可成功建立CPFE模型。
肺泡灌洗液细胞计数分析及肺组织病理炎症积分结果表明，臭氧暴露+PM2.5组小鼠肺组织炎症细胞浸润明显增强，表现为BALF中巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数增加，支气管壁、肺血管平滑肌周围及肺泡间隔炎症细胞增多。既往研究表明，COPD患者肺泡巨噬细胞能够分泌大量的GM-CSF、TGF-β、CCL2和CXCL8等，促使其他炎性细胞(包括嗜中性粒细胞和单核细胞)被募集入肺，引起炎症介质、弹性蛋白酶、组织金属蛋白酶等分泌增多，还能激活CD8+T淋巴细胞释放颗粒酶和穿孔素，介导肺泡破坏和肺泡腔扩大。肺纤维化患者肺泡巨噬细胞可高表达CD204而促进CCL18、CCL2和IL-1ra的分泌，导致胶原分泌增多。临床病例分析显示，肺纤维化合并肺气肿患者肺泡灌洗液中淋巴细胞数明显增多，而淋巴细胞能够分泌TGF-β和IL-13介导成纤维细胞的活化，引起胶原等细胞外基质的分泌增多。
肺组织HE染色显示，臭氧暴露+PM2.5组和臭氧暴露+PBS组肺泡破坏严重，肺泡腔扩大，同时肺泡平均内衬间隔(Lm)增加，表明出现肺气肿样改变；同时，Masson染色显示，相比对照组和臭氧暴露+PBS组，臭氧暴露+PM2.5组肺组织出现更加明显的蓝绿色基质胶原沉积，广泛分布与肺泡壁、支气管壁和肺血管平滑肌周围，气道上皮下胶原沉积厚度(Wcol/Pbm)测量结果也显示胶原在气道壁的大量沉积，表明臭氧暴露+PM2.5组小鼠出现了肺纤维化表型。另外，臭氧暴露+PM2.5组小鼠肺组织羟脯胺酸(HYP)含量也高于臭氧暴露组和对照组，有研究表明HYP在体内主要用于合成胶原纤维，因此HYP含量的升高同样标示着臭氧暴露+PM2.5组小鼠肺纤维化的形成。
肺功能测定中，臭氧暴露+PBS组和臭氧暴露+PM2.5组的小鼠肺功能指标均明显下降。其中臭氧暴露组小鼠肺容量增加(表现为IC和TLC增大)，肺顺应性升高(表现为Cchord增大)，呼出气流受限(表现为FEV25/FVC和FEV50/FVC降低)，和肺气肿患者的肺功能改变大体一致，表现为阻塞性通气功能障碍。在臭氧暴露的基础上，臭氧暴露+PM2.5组小鼠进行了连续8周的PM2.5鼻腔滴入，肺容量增加(表现为TLC和FRC增大)，但吸气能力IC明显降低，肺顺应性Cchord相比空气组略有降低，呼出气流受限程度进一步增大(表现为FEV25/FVC和FEV50/FVC相比臭氧组进一步降低)，出现了限制性通气功能障碍和阻塞性通气功能障碍交互共存的现象。
综上所述，对小鼠进行连续8周、每周两次的PM2.5(7.8mg/kg)鼻腔滴入和臭氧暴露(2.5ppm，3小时)可成功建立CPFE模型。
实施例2
给予大鼠PM2.5混悬液经鼻滴入，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，3小时。每周两次，连续8周。
实施例3
给予豚鼠PM2.5混悬液经鼻滴入，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，3小时。每周两次，连续8周。
实施例4
给予家兔PM2.5混悬液经鼻滴入，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，3小时。每周两次，连续8周。
实施例5
给予猴子PM2.5混悬液经鼻滴入，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，3小时。每周两次，连续8周。
实施例6
给予狗PM2.5混悬液经鼻滴入，24小时后，置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，3小时。每周两次，连续8周。
实施例7
小鼠置于臭氧暴露密闭箱中，暴露于臭氧制造仪产生的臭氧中，浓度为2.5ppm，3小时。鼻滴前，小鼠被放在气体麻醉机麻醉箱中，异氟烷雾化麻醉，给予PM2.5混悬液经鼻滴入，剂量为7.8mg/kg，滴注体积为每只50μl/195μg。每周两次，连续8周。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。