新型自由基高效产生的可降解纳米材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种新型自由基高效产生的可降解纳米材料及其制备方法和应用，属于生物医用纳米材料技术领域。

背景技术：

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的特殊疾病，对它的诊断和治疗已受到人们越来越多的关注。其中以低pH值，低过氧化氢酶活性和乏氧为特征的肿瘤微环境是决定肿瘤发展的关键因素。此外，作为改变肿瘤微环境的一种方式，第二信使过氧化氢(H2O2)水平的调节和强氧化性的羟基自由基(·OH)的产生是抗肿瘤的有效方式。随着当前纳米技术的不断发展，利用功能化纳米材料例如肿瘤微环境响应药物递送的纳米载体，光动力纳米剂和光热纳米材料来不断探索新的可能性，从而丰富放疗和化疗的传统治疗方式。然而，对于使用肿瘤微环境响应性纳米材料本身用于肿瘤的治疗缺乏研究，例如产生大量的过氧化氢和·OH，消耗肿瘤微环境氧气。目前为止，人们开发了非晶Fe用于化学动力学疗法和用于饥饿疗法的Mg2Si。遗憾的是，肿瘤微环境H2O2的量限制了CDT淋巴水肿综合消肿治疗技术的效率，并且Mg2Si产生的SiO2难降解也抑制了饥饿疗法的临床转化。

可降解的纳米材料是有很高的生物相容性的，在包括药物递送和组织工程在内的生物学应用中不断发挥着重要作用。尽管如此，在肿瘤成像或治疗中仍然较少使用有使用可降解的纳米材料，其中大部分是天然或合成的脂质和聚合物以及有机硅。而结合调节自由基水平例如过氧化氢和羟自由基来消灭肿瘤的理论基础，需要寻找这类新型的纳米材料。从化学科学的观点来看，H2O2和·OH在有机合成中和催化有机物的降解等方面占据独特的位置。然而，对于大量的H2O2和·OH的产生仍然是一个很大的挑战，更不用说在体内极其温和的条件下。因此，发展肿瘤微环境响应的自由基高效产生且可降解的纳米材料，是生物医学领域中一个重要的方向。

技术实现要素：

为满足生物医学应用领域的需求，本发明的目的在于提供一种新型自由基高效产生的可降解纳米材料，可以应用于肿瘤的高效定制化治疗。

在此，一方面，本发明提供一种纳米材料，所述纳米材料包括过氧化物纳米片和负载在所述过氧化物纳米片上的铁源，所述铁源的负载量为6-9wt％，优选为6-7wt％。

较佳地，所述铁源为转铁蛋白。

较佳地，所述过氧化物纳米片为过氧化镁纳米片。本发明中，过氧化物纳米片的尺寸(具体而言径向尺寸)可以为100～200nm。

本发明纳米材料具备能在微酸下快速产生过氧化氢并可降解的过氧化物(如过氧化镁)纳米片以及静电吸附于纳米片表面的铁源(如转铁蛋白)。所述微酸优选是指pH值为6.5左右。本发明以微酸环境响应的高效产生过氧化氢和羟自由基的过氧化物(如过氧化镁)为主要材料，表面负载铁源(如转铁蛋白)来催化过氧化氢产生羟自由基和提高其生物相容性，可作为纳米载体应用，可用于制备肿瘤自由基治疗药物。由于肿瘤特异性的微酸及过氧化氢酶低表达的环境，可以在肿瘤部位原位产生大量过氧化氢和羟自由基来消灭肿瘤，同时在正常环境下可缓慢降解，例如以过氧化镁为主要材料，表面负载转铁蛋白时，在正常环境下可缓慢降解为无毒的镁离子和水及氧气，实现高效的治疗与可降解。因此，这种在肿瘤内部微环境刺激下的新型自由基高效产生且可降解的纳米材料具有重要的医学临床应用前景。

另一方面，本发明还提供一种制备上述纳米材料的制备方法，其特征在于，包括：

将过氧化物前驱体溶解在溶剂中，并加入助溶剂和表面活性剂A形成反相微乳液；

调节所述反相微乳液的pH值至10～12，加入过氧化剂溶液进行反应，然后利用表面活性剂B破乳，得到过氧化物纳米片；

通过静电吸附将铁源负载在过氧化物纳米片上，得到负载铁源的过氧化物纳米片材料。

本发明通过在过氧化物前驱体溶液(如氯化镁)中加入助溶剂、表面活性剂形成反相微乳液并调节pH值后破乳得到过氧化物纳米片上，并通过静电吸附将铁源负载在过氧化物纳米片上，得到负载铁源的过氧化物纳米片材料。通过反相微乳液法制备过氧化物纳米片具有简单且可制备大量样品的优点。过氧化物纳米片通过静电吸附与铁源结合，操作简单且高效。本发明合成工艺简单易行，制备成本低，效率高，所制得的材料具有非常好的分散性，微酸pH 6.5的响应性以及生物相容性，具有重要的研究意义和应用前景。

较佳地，所述助溶剂为环己烷溶液。助溶剂的浓度可以为90wt.％以上，例如可以为99.5wt.％。本发明中，助溶剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(30～40)：(1～2)。可以在加入助溶剂和表面活性剂A形成反相微乳液后搅拌1～2小时。

较佳地，所述过氧化物前驱体为氯化镁。

较佳地，所述溶剂为水。本发明中，助溶剂与溶剂的质量比可以为(30～40)：(5～10)。

本发明中，所述过氧化剂溶液可以为过氧化氢溶液。

本发明中，所述过氧化剂溶液的浓度可以为20～40wt％(例如30wt％)。本发明中，过氧化剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(5～10)：(1～2)。加入过氧化剂溶液的速度可以为5ml每小时～10ml每小时。

本发明中，所述表面活性剂A可以为聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚。本发明中，表面活性剂A与过氧化物前驱体的质量比可以为(1～2)：(1～2)。

较佳地，所述表面活性剂B为无水乙醇。本发明中，表面活性剂B与过氧化物前驱体的质量比可以为(20～30)：(1～2)。

较佳地，所述反应的时间为1～2小时。

本发明中，可以将破乳后得到过氧化物纳米片洗涤并分散于无水乙醇等中，以使其不会缓慢分解。

以过氧化镁负载转铁蛋白的纳米材料为例，通过静电吸附将铁源负载在过氧化镁纳米片上例如可以包括：将过氧化镁纳米片置于水等中以使转铁蛋白吸附在表面，加入2mg/ml～30mg/ml(例如10mg/ml)的转铁蛋白溶液，在水中转铁蛋白通过静电吸附负载在过氧化镁纳米片上。可以将得到的负载铁源的过氧化物纳米片材料洗涤后分散于水中用于后期的细胞实验及活体实验。转铁蛋白溶液例如可以通过市售牛转铁蛋白加入超纯水中配制得到。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的过氧化镁纳米片的XRD图谱；

图2为本发明实施例1所制得的过氧化镁纳米片分散于乙醇中的透射电镜(TEM)(上排左图、上排中图(图中箭头所指为组成纳米片的单个过氧化镁纳米小颗粒)和高分辨电镜(上排右图)及mapping照片(下排左图、上排中图、下排右图)；下排的左图是纳米片的明场像，中图是Mg元素的mapping图，有图是O元素的mapping图；

图3为本发明实施例1所制得的结合转铁蛋白的过氧化镁纳米片分散于水中的透射电镜(TEM)照片；

图4(a)是示出本发明实施例1所制得的转铁蛋白与过氧化镁纳米片结合前后的Zeta电位的变化的图；图4(b)为本发明实施例1所制得的转铁蛋白与过氧化镁纳米片结合前后的质谱图；

图5为本发明实施例2所制得的结合转铁蛋白的过氧化镁纳米片的电子顺磁共振(ESR)图；

图6为本发明实施例3所制得的结合转铁蛋白的过氧化镁纳米片离子释放曲线图；

图7(a)为本发明实施例4所制得的结合转铁蛋白的过氧化镁纳米片的细胞吞噬实验图；

图7(b)为本发明实施例4所制得的结合转铁蛋白的过氧化镁纳米片的细胞治疗效果图。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明涉及一种新型自由基高效产生纳米材料的制备方法与应用，所述纳米材料可特异性响应肿瘤的微环境产生大量自由基且可降解，包括：能在微酸下快速产生大量过氧化氢并可降解的过氧化物纳米片、静电吸附于纳米片表面的铁源。本发明以微酸环境响应的高效产生过氧化氢和羟自由基的过氧化物为主要材料，表面负载铁源来催化过氧化氢产生羟自由基和提高其生物相容性，可作为纳米载体应用，可用于制备肿瘤自由基治疗药物，用于肿瘤的高效治疗。由于肿瘤特异性的微酸及过氧化氢酶低表达的环境，可以在肿瘤部位原位产生大量过氧化氢和羟自由基用来消灭肿瘤，同时在正常环境下可缓慢降解为无毒的离子和水及氧气，在向临床转换中有着得天独厚的优势。

本发明的过氧化物纳米片可以为过氧化镁纳米片，铁源可以为转铁蛋白。铁源的负载量可以为6～9wt％，优选为6～7wt％。铁源的负载量为6～9wt％时，可以保持良好分散性。以下，具体说明本发明的自由基高效产生纳米材料的制备方法。

(过氧化物纳米片)

本发明中，可以通过反微乳液法制备过氧化物纳米片。以下示例性说明反微乳液法制备过氧化物纳米片的方法。

首先，将过氧化物前驱体溶解在溶剂中，并加入助溶剂和表面活性剂形成反相微乳液。过氧化物前驱体可采用卤化镁(例如氯化镁)。溶剂可以是水。本发明中，助溶剂与溶剂的质量比可以为(30～40)：(5～10)。

助溶剂可以为环己烷。助溶剂的浓度可以为90wt.％以上，例如可以为99.5wt.％。本发明中，助溶剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(30～40)：(1～2)。用于形成反相微乳液的表面活性剂可以为聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚，表面活性剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(1～2)：(1～2)。可以在加入助溶剂和表面活性剂形成反相微乳液后搅拌1～2小时，以使反应体系充分均匀。

接着，调节反相微乳液的pH值，提供碱性环境，从而防止生成物分解。例如可以通过加入氨水，调节pH值至10～12。在一个示例中，例如向反相微乳液快速加入微量氨水，提供碱性环境，搅拌1～2小时。

接着，加入过氧化剂溶液进行反应。氧化剂溶液可以为过氧化氢溶液。过氧化剂溶液的浓度可以为20～40wt％(例如30wt％)。本发明中，过氧化剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(5～10)：(1～2)。为了使纳米颗粒缓慢生成，可以以5ml每小时～10ml每小时的速度缓慢滴入过氧化剂溶液。过氧化物前驱体与过氧化剂反应生成过氧化物，反应的时间为1～2小时。

接着，利用破乳剂(即用于破乳的表面活性剂)破乳，得到过氧化物纳米片。用于破乳的表面活性剂可以为无水乙醇，表面活性剂与过氧化物前驱体的质量比可以为(20～30)：(1～2)。本发明中，可以将破乳后得到过氧化物纳米片洗涤并分散于无水乙醇等中，以防止生成物在水中的分解。

由此，得到能在微酸下快速产生大量过氧化氢并可降解的过氧化物纳米片，其中O的价态为负一价。过氧化物纳米片的尺寸可以为100～200nm。通过类反微乳液法制备过氧化物纳米片具有分散性良好的优点。

(使铁源负载于过氧化物纳米片)

本发明中，通过静电吸附将铁源通过负载在过氧化物纳米片上。吸附过程中可以，将过氧化物纳米片置于水等中以用于转铁蛋白的负载。由于正负电荷的互相吸引，因此可以使铁源静电吸附于纳米片表面。以过氧化镁负载转铁蛋白的纳米材料为例，通过静电吸附将铁源负载在过氧化镁纳米片上例如可以包括：将过氧化镁从无水乙醇中转移到水中，加入2mg/ml～30mg/ml(例如10mg/ml)的转铁蛋白水溶液，在水中转铁蛋白通过静电吸附负载在过氧化镁纳米片上。可以将得到的负载铁源的过氧化物纳米片材料洗涤(例如用水离心清洗)后分散于水中以用于后期的细胞实验及活体实验。过氧化物纳米片通过静电吸附与铁源结合，使其可产生大量羟自由基，并且提高其生物相容性。

由此，得到自由基高效产生可降解的纳米材料(即负载铁源的过氧化物纳米片材料)，负载铁源的过氧化物纳米片材料的尺寸为100～200nm，过氧化物纳米片表面负载的铁源可催化过氧化氢产生羟自由基和提高其生物相容性，过氧化物纳米片具有肿瘤微环境响应高效产生自由基且可降解能力，可实现对肿瘤的高效治疗与无毒可降解。由于肿瘤特异性的微酸及过氧化氢酶低表达的环境，可以在肿瘤部位原位产生大量过氧化氢和羟自由基用来消灭肿瘤，同时在正常环境下可缓慢降解，在向临床转换中有着得天独厚的优势。本发明的自由基高效产生可降解纳米材料可以应用在肿瘤的自由基治疗中。

本发明的优点：

通过类反微乳液法制备过氧化物纳米片具有简单且可大量制备的优点；过氧化物纳米片通过静电吸附与铁源结合，操作简单且高效；而且本发明合成工艺简单易行，制备成本低，效率高，制备得到的负载铁源的过氧化物纳米片材料分散性良好，具有非常好的微酸响应性以及生物相容性，智能响应肿瘤微环境产生大量过氧化氢和羟自由基，同时在正常组织和肿瘤组织中均可降解；

本发明的纳米材料基于肿瘤特异性的微酸及过氧化氢酶低表达的环境，可以在肿瘤部位原位产生大量过氧化氢和羟自由基来消灭肿瘤，同时在正常环境下可缓慢降解为无毒的离子和水及氧气，实现对肿瘤的高效无毒治疗。这种在肿瘤内部微环境刺激下的新型自由基高效产生且可降解的纳米材料具有重要的医学临床应用前景。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1：

步骤1，将1.5g氯化镁溶解在6ml水中，加入35g环己烷和1.5g聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚形成反微乳液体系，搅拌一小时；

步骤2，快速加入微量氨水，提供碱性环境(pH值为10-12)，搅拌半小时；

步骤3，利用注射泵缓慢滴入6ml 30wt.％的过氧化氢，反应两个小时；

步骤4，反应结束后利用无水乙醇破乳，并用无水乙醇离心清洗，分散在无水乙醇中；

步骤5，将过氧化镁从无水乙醇中转移到水中，总质量7wt％的转铁蛋白通过静电吸附负载在过氧化镁纳米片上，然后用水离心清洗最终分散在水中。分别将转铁蛋白，过氧化镁和负载转铁蛋白的过氧化镁放置在石英比色皿中进行Zeta电位的测试。并且对以上单独过氧化镁纳米片，转铁蛋白及负载转铁蛋白的过氧化镁纳米片的粉末进行质谱的测试，进一步确定转铁蛋白的负载成功。

图1所示的为本实例过氧化镁纳米片的XRD图谱，与(PDF卡片97-004-1732)XRD卡片的标准峰中给出的通过单晶模拟出来的衍射图谱相对应，而且主峰的位置一致；图2、3所示的为负载转铁蛋白前后的纳米材料的TEM照片，分散性良好，尺寸在100-200nm之间。从图4(a)和图4(b)图中也得知，转铁蛋白成功负载在过氧化镁表面，证明复合材料合成成功。

实施例2：利用ICP确定Fe和Mg的浓度，配制不同pH(7.4,6.5和5.4)的缓冲液，将纳米复合材料和50-100μl DMPO混合在一起，然后加入1-2ml的不同pH(7.4,6.5和5.4)缓冲液中，用毛细管吸不同pH条件下的样品50-70μl，用电子顺磁共振来检测其信号。由图5可知，纳米复合材料在pH 6.5及5.4环境下有很强的羟自由基信号，而单独的过氧化镁在pH 6.5及5.4下无明显羟自由基信号，同时在pH 7.4条件下，负载转铁蛋白前后的纳米材料均无明显羟自由基信号，证明了纳米复合材料的特异性响应微酸环境。

实施例3：配制不同pH(7.4,6.5和5.4)的缓冲液，在透析袋中加入相同质量1-2mg的MgO2纳米片，将透析袋放在300-400ml缓冲液中，在不同时间点取2-3ml溶液用ICP来确定Mg的浓度，得出离子的释放曲线。由图6可知，MgO2纳米片有很强的酸响应性，同时在酸条件下释放速度较快，可以极佳的应用于肿瘤微环境响应的高效自由基的释放。

实施例4：通过物理吸附使MgO2上有FITC燃料，然后用DMEM培养基配成MgO2中Mg质量浓度为10μg/mL的纳米复合材料，与4T1癌细胞共孵育6h，再通过共聚焦显微镜来观察其吞噬情况；用DMEM培养基配成MgO2中Mg质量浓度最高为50μg/mL的纳米复合材料，在不同pH条件下孵育4T1癌细胞24h，再通过MTT比色法检测癌细胞的存活率。由图7(a)和图7(b)可知，对于癌细胞而言，由于微环境中的微酸性及过氧化氢酶的低活性，与细胞共孵育24h后，复合材料在低pH环境下均对肿瘤细胞有较好的杀伤作用，为接下来向临床的转化提供了坚实的基础。

实施例5：

步骤1，将1.7g氯化镁溶解在7ml水中，加入38g环己烷和2g聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚形成反微乳液体系，搅拌一小时；

步骤2，快速加入微量氨水，提供碱性环境(pH值为10-12)，搅拌半小时；

步骤3，利用注射泵缓慢滴入7ml 30wt.％的过氧化氢，反应两个小时；

步骤4，反应结束后利用无水乙醇破乳，并用无水乙醇离心清洗，分散在无水乙醇中；

步骤5，将过氧化镁从无水乙醇中转移到水中，总质量8wt％的转铁蛋白通过静电吸附负载在过氧化镁纳米片上，然后用水离心清洗最终分散在水中。

实施例6：

步骤1，将2g氯化镁溶解在9ml水中，加入40g环己烷和2g聚氧代乙烯(5)壬基苯基醚形成反微乳液体系，搅拌一小时；

步骤2，快速加入微量氨水，提供碱性环境(pH值为10-12)，搅拌半小时；

步骤3，利用注射泵缓慢滴入10ml 30wt.％的过氧化氢，反应两个小时；

步骤4，反应结束后利用无水乙醇破乳，并用无水乙醇离心清洗，分散在无水乙醇中；

步骤5，将过氧化镁从无水乙醇中转移到水中，总质量9wt％的转铁蛋白通过静电吸附负载在过氧化镁纳米片上，然后用水离心清洗最终分散在水中。