本发明属于制药领域，涉及瑞香素的新用途，尤其是瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的新用途。
背景技术：
瑞香素(daphnetin，dap)化学名为7，8-二羟基香豆素(7，8-dithydroxycoumarin)，从瑞香属植物长白瑞香中分离出来的有效成分，是一种天然的香豆素衍生物。文献显示瑞香素具有良好的抗氧化、抗炎、抗凝血、抗病毒等药理活性，临床上主要用于血栓闭塞性脉管炎及其它闭塞性血管疾病和冠心病的辅助治疗。
有文献报道瑞香素可以有效保护叔丁基过氧化氢诱导产生的细胞毒性、细胞凋亡和线粒体功能障碍，主要是通过减少活性氧(ros)生成、减少丙二醛的形成。yuw等人研究发现由脂多糖或β-淀粉样蛋白诱导产生促炎介质包括白介素il-1β和肿瘤坏死因子tnf-α，瑞香素可抑制促炎因子的产生，瑞香素通过调节一系列细胞内信号通路，包括ikk/iκb，mapks和pi3k/akt来抑制小胶质细胞活化和促炎反应。但瑞香素对于非酒精性脂肪肝的研究目前还没有报道。
非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是指由非酒精和其它不明确的损肝因素所导致的综合征，主要临床特征是肝细胞呈弥散性,伴随有大泡状脂肪病变，包含单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)和肝硬化三个阶段。nafld通常与肥胖和高血糖症有关,并伴有高甘油三酯(tg)、高血压和高胆固醇。非酒精性脂肪肝炎(nash)是nafld中一种较为严重的病情，表征与酒精性肝炎相似，其病理表现主要为：大泡状脂肪病变，肝小叶中充斥着混合性炎症细胞，导致肝细胞膨胀和坏死，形成马洛里小体，最后不可逆的成为肝纤维化或肝硬化。
由于nafld的发病机制比较复杂，病因并不明确，目前没有确切的特效药，控制饮食、纠正不良生活作息、加强体育锻炼控制体重是控制nafld最好的方法。药物治疗主要从发病机制的“两次打击”来着手，首要的是缓解肝细胞的脂肪堆积现象，研究表明熊去氧胆酸能减少肝脏脂质含量。现有的保肝药物并不能减少肝脏内脂肪堆积，但是可以通过拮抗脂质过氧化和氧化应激以及抗炎活性抗纤维化活性等，缓解nafld的“二次打击”，减轻nash症状，防止病情的进一步恶化。保肝药物的治疗只能起到辅疗作用，并且主要是针对nash病理类型。还可以使用一些抗氧化剂维生素e、还原型谷胱甘肽缓解第二次打击中产生的氧化损伤。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种瑞香素在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的新用途。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
申请人以hepg2细胞经0.5mm油酸处理作为体外研究细胞模型，hepg2细胞先用油酸处理24h，再用瑞香素(5、20、50μm)处理模型细胞24h。给药后用试剂盒检测细胞内tg含量和ros含量及细胞对葡萄糖的摄取能力，用rt-qpcr法和westernblot法检测细胞中糖脂代谢关键基因(环腺苷酸依赖的蛋白激酶ampk，固醇调节元件结合蛋白srebp-1c，马铃薯糖蛋白样磷酯酶结构域蛋白pnpla3，正过氧化物酶体增殖物激活受体pparα，磷脂酰肌醇激酶pi3k，蛋白激酶akt)和氧化应激相关基因(细胞色素p450cyp4a)的mrna与蛋白表达量。
实验结果表明：(1)与对照组相比，油酸处理组胞内tg含量，srebp-1c和pnpla3mrna及蛋白的表达量明显上调，pparαmrna及蛋白表达量、ampk磷酸化水平明显下调；与油酸处理组相比，油酸和瑞香素联合处理组胞内tg含量，srebp-1c、pnpla3mrna与蛋白表达量明显下调，pparαmrna与蛋白表达量、ampk磷酸化水平明显上调。(2)与对照组比较，油酸处理组细胞对荧光葡萄糖的吸收明显降低，pi3k蛋白表达及pakt/akt下调；油酸和瑞香素联合处理后，细胞的糖摄取能力提高，pi3k蛋白表达及pakt/akt上调。(3)与对照组比较，油酸处理组胞内ros含量及cyp4a表达量明显增多；与油酸处理组比较，油酸和瑞香素联合处理组胞内ros含量及cyp4a表达量明显下调。
实验结论：瑞香素能明显降低油酸诱导的肝细胞脂堆积，缓解胰岛素抵抗与氧化应激损伤，因此对非酒精性脂肪肝病具有一定的预防和治疗作用，其作用机制包括：(1)通过上调糖脂代谢关键因子ampk的磷酸化水平，抑制脂合成关键基因srebp-1c、pnpla3的表达，同时诱导脂氧化关键基因pparα的表达，进而降低了肝细胞的脂堆积。(2)通过上调pi3k的表达及pakt/akt水平，缓解胰岛素抵抗，从而促进肝细胞对葡萄糖的摄取。(3)通过抑制活性氧生成关键基因cyp4a的表达，缓解肝细胞的氧化损伤。
附图说明
图1：瑞香素对nash模型细胞存活率的影响。
图2：瑞香素对nash模型细胞脂堆积的影响。
图3：瑞香素对nash模型细胞脂代谢相关基因mrna的影响。
图4：瑞香素对nash模型细胞脂代谢相关基因蛋白的影响。
图5：瑞香素对nash模型细胞糖摄取的影响。
图6：瑞香素对nash模型细胞胰岛素信号传导相关基因蛋白的影响。
图7：瑞香素对nash模型细胞氧化损伤的影响。
图8：瑞香素对nash模型细胞氧化应激相关基因蛋白的影响。
图9：瑞香素对nash模型细胞ampk磷酸化水平的影响。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。
1.实验方法
1.1细胞诱导给药
1)细胞诱导
将hepg2细胞消化制成均匀的细胞悬液,根据培养时间按比例稀释接种到6孔板中，待细胞贴壁后，于5％co2、37℃恒温培养箱中放置培养24h。吸弃原dmem完全培养基，缓慢加入pbs缓冲液清洗三次，加入含0.2％油酸钠、10％bsa的dmem完全培养基，在培养箱中培养24h。在显微镜下观察细胞形态，若细胞表面出现黑色颗粒即诱导成功。
2)给药处理
先诱导贴壁细胞24h，在给药处理24h。设置空白组、溶剂组、模型组和给药组。
1.2细胞存活率检测(mtt法)
当培养瓶内细胞密度达到85％左右的时候进行传代，将细胞悬液稀释成5x103细胞/孔的密度接于96孔板，待细胞贴壁后，用dmem完全培养基稀释好5、20、50、100μm的瑞香素，每孔给200μl，每组设置5个平行，于5％co2、37℃恒温培养箱中培养24h。细胞培养到相应时间点后，吸弃培养基，每孔小心加入20μlmtt与180μlpbs的混合液，在5％co2、37℃细胞培养箱中孵育4h，缓慢吸弃mtt溶液，然后每孔加入150μl的dmso溶液(dmso可以溶解板子底部的蓝紫色甲鐟物质)。在酶标仪上中度震荡360s，然后测定其在570nm处的吸光值。
1.3胞内甘油三酯含量的检测(tg法)
1)经处理好的细胞，先用pbs缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
2)加入100μl细胞裂解液ripa、蛋白酶抑制剂pmsf、cocktail的混合溶液，将细胞轻轻覆盖，放置于37℃培养箱中反应10min，再用摇匀器摇匀；
3)分组标记两套1.5mlep管，将反应好的细胞收集在ep管中(反应好的细胞会形成一层膜，需将膜也收集起来)；
4)将细胞原液稀释至适宜浓度，用bca试剂盒检测蛋白浓度，剩下的细胞原液于70℃水浴锅中水浴10min；
5)水浴完成后的细胞原液在2000rpm，4℃的条件下离心5min；
6)取上清使用tg试剂盒检测细胞内tg的含量。
1.4细胞葡萄糖摄取能力的检测
1)经处理好的细胞，先用pbs缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
2)加入1ml无糖dmem完全培养基放置于37℃培养箱中饥饿处理3h；
3)加入50um的荧光葡萄糖(2-nbdg)避光处理30min；
4)避光状态下，用pbs缓冲液轻轻吹洗细胞3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
5)用胰酶将细胞消化下来，再加入1mlpbs缓冲液形成细胞悬液，于750rpm、4℃条件下离心1min；
6)弃掉多余的pbs缓冲液，使管中的细胞液约为100μl，混匀后加入黑色的96孔板中；
7)使用多功能荧光酶标仪检测荧光强度，激发光波长为485nm，发射光波长为535nm；
8)检测完荧光强度后回收细胞悬液，加入100μl细胞裂解液ripa、蛋白酶抑制剂pmsf、cocktail的混合溶液，放置在冰上裂解10min，再稀释成适宜浓度摇匀，用bca试剂盒检测蛋白浓度。
1.5胞内ros含量的检测
1)经处理好的细胞，先用pbs缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
2)用无血清dmem培养基将dcfh-da探针溶液稀释为10μm含探针的培养基，每孔加入1ml探针溶液放置于37℃培养箱中处理30min；
3)避光状态下，用pbs缓冲液轻轻吹洗细胞3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
4)用胰酶将细胞消化下来，再加入1mlpbs缓冲液形成细胞悬液，于750rpm、4℃条件下离心1min；
5)弃掉多余的pbs缓冲液，使管中的细胞液约为100μl，混匀后加入黑色的96孔板中；
6)使用多功能荧光酶标仪检测荧光强度，激发光波长为485nm，发射光波长为535nm；
7)检测完荧光强度后回收细胞悬液，加入100μl细胞裂解液ripa、蛋白酶抑制剂pmsf、cocktail的混合溶液，放置在冰上裂解10min，再稀释成适宜浓度摇匀，用bca试剂盒检测蛋白浓度。
1.6相关基因mrna表达的检测
1)经处理好的细胞，吸弃原培养液，用pbs缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留pbs缓冲液；
2)每孔加入1mltrizol，使液体接触所有细胞，反应5min；
3)轻轻吹打细胞，将6孔板中的液体全部转移至1.5mlep管中；
4)加200μl氯仿(氯仿与trizol的比例为1:5)分相，剧烈震荡15s左右后静置15min；
5)12000g、4℃离心15min(上层为无色水相含rna，中间层为酚-氯仿相，底层为浅红酚相含dna、蛋白质)；
6)吸取上层水相至另一ep管中；
7)加500μl异丙醇(异丙醇与trizol的比例为1:2)以沉淀rna，上下颠倒混匀后，静置10min；
8)12000g、4℃离心10min，rna为底层的白色物质；
9)吸弃上清，加入预冷的75％乙醇(现配，用depc水稀释)1ml清洗，并用手轻轻弹管壁沉淀弹起；
10)7500g、4℃离心5min；
11)吸弃上清，倒置敞口干燥2-3min，无明显水滴；
12)加20μldepc水溶解管底部的rna物质，吹吸几次混匀，置于65℃水浴锅中促溶，便于接下来的逆转录；
13)吸取1-2μlrna溶液用核酸测定仪其溶度和纯度，其中a260/280的值表示其纯度，该值应介于1.8至2.0之间，并且越接近2.0表示所提取的rna纯度越高。若a260/280的值低于1.8，表明残留有蛋白，若a260/280的值高于2.0，说明样品中的rna降解了；
14)吸取1-2μlrna充分与1μl上样缓冲液混合，配制1％的琼脂糖凝胶(0.2g琼脂溶解在20ml的tae中)进行电泳，设置电压约为90v，电泳15min。待条带跑至凝胶的三分之一时停止电泳用eb避光染色5min，再使用凝胶成像仪扫描，观察条带，可以分析扫描得到的图像来判断所提取rna的完整性。rna包含28s、18s和5srna(从上到下)，若条带28s的亮度为条带18s亮度的两倍，条带5s较浅时，说明样品rna完整性较好；
15)将rna逆转录为cdna，每20μl的逆转录体系中包含2μgrna、1μlenzymemix、1μlprimermix、4μlrt-buffer，依据前面所测的rna浓度来计算所加rna的体积，剩余的用depc水补齐20μl。将逆转录体系混匀后放至pcr仪上进行逆转，过程为变形、退火、延伸，得到cdna保存于-20℃备用；
16)实时荧光定量pcr检测样品基因mrna的表达量，使用sybrgreenipcr试剂盒，实时荧光定量pcr反应体系为20μl，含有8μlenzymemix，0.5μl正引物和反引物，1μl模板cdna，10μl三次水水。经历预变性95℃、5min，变性95℃、30s，退火58.4℃、30s，延伸72℃、30s，进行39次循环。反应结束后，采用2-δδct法计算各基因mrna的表达。通过查阅文献实验中所用的引物序列如表所示。
表1实时定量pcr引物序列
1.7相关基因蛋白表达的检测
一)准备蛋白样品
1)经处理好的细胞，吸弃原培养液，用pbs缓冲液轻轻吹洗3次，洗完后用移液枪弃净孔内残留的pbs缓冲液；
2)120μl细胞裂解液ripa、蛋白酶抑制剂pmsf、cocktail的混合溶液(若检测磷酸化的蛋白还需要添加磷酸酶抑制剂)，放置在冰上裂解40min，每隔5min摇晃一下6孔板使细胞充分裂解；
3)收集细胞液于1.5mlep管中，12000g、4℃离心10min；
4)尽可能多的吸取上清于另一ep管中，稀释10倍,用bca试剂盒检测蛋白浓度；
5)根据上样量以及测出的蛋白浓度计算出相应的上样体积，用样品蛋白液稀释5×sds上样缓冲液成1×，充分混匀，经沸水浴10min，保存于-80℃备用。
二)电泳
1)清洗玻璃板，用纱布蘸取洗涤剂轻轻擦洗，洗净后先用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在通风橱里晾干；
2)将两玻璃板对齐后放入电泳槽中卡紧，短板在外，夹在放置有橡胶垫的夹子上；
3)配制10ml10％的分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，灌胶时用1ml的移液枪吸取大概6.5ml的凝胶液沿着短板放出，待胶面达到所需高度即可。然后在分离胶上加1ml异丙醇液封，再放置于37℃培养箱40min使胶凝固；
4)待胶凝固后，倒去异丙醇，并用纯水冲洗几遍，并用滤纸将水吸干。配制5ml5％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，灌胶时用1ml的移液枪吸取浓缩胶液沿着短板放出，避免加液过程出现气泡，加至短板高度即可，再插上梳子放置于37℃培养箱40min使胶凝固；
5)将短板朝里放置，把电泳槽放入电泳盒，倒入电泳缓冲液后拔掉梳子，注意电泳槽底部不要有气泡。用微量移液枪将准备好的样品蛋白贴壁加至加样孔中，将电泳仪的电压设置为85v进行电泳，当蛋白marker开始分离出条带的时候把电压改成110v,电泳至所需长度即可停止电泳。
三)电转
1)准备转膜过程中所需要的海绵、相应大小的滤纸和与凝胶相应大小的pvdf膜；
2)在搪瓷盘里加适量的电转缓冲液，使整个转膜过程都在电转缓冲液中进行。将电转夹子放入搪瓷盘里，夹子的黑面朝下打开夹子，在上面垫上一张海绵，用玻璃棒来回擀几遍擀走里面的气泡，在海绵垫上垫7张滤纸，并擀走里面的气泡；
3)轻轻撬开玻璃板，并把凝胶切成所需大小，小心剥离凝胶放置在滤纸上，再将pvdf膜对着凝胶放置，pvdf膜和凝胶之间不能有气泡，气泡擀完后在膜上放置7张滤纸和海绵垫，每步气泡擀走后立即合起夹子；
4)使夹子的黑面对上转移槽的黑面，夹子的白面对上转移槽的红面，放置好电转夹子，以恒定电流300ma电转1h40min，实验过程中电转时间是弹性的，需根据蛋白大小来调整。由于电转过程会大量产热，需要将电转槽放置冰水中，在槽盖上也放置冰袋降温，中途随时观察放热情况加冰水。
四)免疫反应
1)将pvdf膜用tbs缓冲液浸泡置于摇床上摇动清洗8min，洗后做剪角标记，再移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭1-2h；
2)将pvdf膜用tbs缓冲液摇晃动清洗两三次，并将膜转移至配好的一抗溶液中，使蛋白面完全接触一抗液4℃过夜；
3)室温下，用tbst缓冲液在脱色摇床上清洗pvdf膜6次，每次8min；
4)用封闭液稀释二抗，将pvdf膜浸泡在二抗溶液中37℃孵育1h。
5)室温下，用tbst缓冲液在脱色摇床上清洗pvdf膜6次，每次8min。
五)暗室曝光
1)在暗室中，配置好化学发光混合液，剪裁一定大小的保鲜膜，吸取发光混合液加至蛋白面，敷2min后将蛋白面朝下放在保鲜膜上折好，翻转放在暗盒中，用胶带固定；
2)将显影、定影液分别倒在塑料盘中，取出x-光片。打开暗盒放置胶片，关上暗盒后开始计时，选择不同的时间多次压片，压片到相应时间后迅速取出胶片，使胶片充分浸入显影液中，待胶片上带出现明显条带后终止显影；
3)用自来水冲洗胶片上的显影液，冲净后将胶片没入定影液中，待胶片透明后终止定影，再用自来水冲洗去残留的定影液，室温晾干。
1.8数据处理及统计分析
本文中实验数据都用平均数±标准差来表示，所有数据来源于至少三次的独立重复实验。统计学分析方法用student’st检验(p<0.05为有统计学意义)。
2.试验结果
2.1瑞香素对hepg2细胞存活率的影响
为了研究瑞香素对非酒精性脂肪肝的预防和治疗作用，hepg2细胞作为非酒精性脂肪肝炎的体外模型细胞，首先应该检测不同浓度的瑞香素对hepg2细胞的存活率是否有影响。根据查阅文献，将瑞香素的检测浓度定为5μm、20μm、50μm和100μm，处理24h。如图1所示，在浓度范围为5μm-50μm时，瑞香素对hepg2细胞的存活能力没有明显的影响，但100μm的瑞香素对hepg2细胞有轻微的增殖效果。根据该mtt结果，我们将给药浓度确定为5μm、20μm和50μm，即为低、中和高剂量。
2.2瑞香素体外抗nash治疗作用研究
2.2.1瑞香素对模型细胞脂堆积的影响
为了研究瑞香素对nash模型细胞脂堆积是否有影响，我们检测了模型细胞内tg的含量，结果如图2所示，从图中可以看出，给予油酸处理后，细胞内tg含量极显著升高(##p<0.01)，dap处理后，细胞内的tg含量呈浓度依赖性的降低(*p<0.05，**p<0.01)。该结果表示瑞香素可以减少nash模型细胞脂堆积。
图3所示脂代谢相关基因srebp-1c(a)，pnpla3(b)，pparα(c)mrna的表达量。与对照组相比，油酸组srebp-1c的mrna的表达显著上升(#p<0.05)，pnpla3的mrna的表达有所上升，pparα的mrna的表达显著下降(#p<0.05)；与油酸组相比，dap组srebp-1c的mrna的表达呈剂量依赖性的降低，pparα的mrna的表达呈剂量依赖性的升高(*p<0.05，**p<0.01)。但是，dap处理后，基因pnpla3的mrna的表达没有明显的改变，表明瑞香素对pnpla3的调控主要在基因的翻译阶段。
图4显示的是脂代谢相关基因srebp-1c(a)，pnpla3(b)，pparα(c)的蛋白表达量。与对照组相比，oa组srebp-1c和pnpla3的蛋白表达显著上升(#p<0.05)，pparα的mrna的表达下降；与oa组相比，处理瑞香素后srebp-1c和pnpla3的蛋白表达呈剂量依赖性的降低，pparα的蛋白表达在中、高剂量极显著升高(*p<0.05，**p<0.01)。
图3和图4的结果表明，瑞香素可以通过抑制srebp-1c和pnpla3的表达，并且上调pparα的表达来治疗肝细胞的脂堆积。
2.2.2瑞香素对模型细胞胰岛素敏感性的影响
为了研究瑞香素对nash模型细胞葡萄糖的摄取能力是否有影响，我们给细胞处理了用荧光标记的葡萄糖，检测模型细胞内荧光葡萄糖(2-nbdg)的含量，结果如图5所示，图中显示给予oa处理后，细胞内2-nbdg含量显著降低(#p<0.05)，处理dap后，细胞内荧光葡糖糖的含量呈剂量依赖性升高(*p<0.05，**p<0.01)。该结果表示瑞香素可以提升nash模型细胞糖摄取能力，从而增强细胞对胰岛素敏感性。
图6可以看出，oa处理后，细胞中pi3k的蛋白表达显著减少，pakt/akt明显下降(#p<0.05)。dap处理使得蛋白pi3k的表达在低剂量时无明显的影响，中、高剂量时极显著增加；pakt/akt呈剂量依赖性升高，(*p<0.05，**p<0.01)。这一结果与糖摄取能力增强现象一致，表明瑞香素可通过pi3k/akt途径来缓解胰岛素抵抗。
2.2.3瑞香素对模型细胞氧化应激损伤的影响
为了研究瑞香素对nash模型细胞氧化损伤是否有影响，我们检测模型细胞内ros的含量，给细胞处理dcf探针，dcf探针的荧光强度代表了ros的含量。结果如图7所示，图中显示给予oa处理后，细胞内ros含量显著升高(#p<0.05)，处理dap后，细胞内ros的含量呈浓度依赖性的降低(*p<0.05)。该结果表示瑞香素可以缓解nash模型细胞的氧化损伤。
图8所示，与对照组相比，oa组内cyp4a的表达显著上调(#p<0.05)；与oa组相比。dap组内cyp4a的表达量呈剂量依赖性的降低(*p<0.05，**p<0.01)。表明瑞香素可以通过下调cyp4a，缓解氧化应激所形成的肝损伤。
2.2.4瑞香素对模型细胞内ampk磷酸化水平的影响
从图9可以看出，hepg2细胞经处理后，与对照组相比，oa组细胞内ampk的磷酸化水平显著下降(#p<0.05)，经dap处理后pampk的表达量呈剂量依赖性的升高(*p<0.05，**p<0.01)。该结果表明dap可以上调ampk的磷酸化水平。
3.结论
随着现代生活水平的提高，肥胖、代谢综合征的病发率也越来越高。非酒精性脂肪肝病作为代谢综合征的一种，逐年增长的发病率及死亡率和患者年龄的逐渐减小使得人们对nafld越来越关注。nafld的致病因素较多且复杂，对其发病机制的研究比较主流的学说是“二次打击”，首次打击主要是各种原因导致脂肪在肝脏细胞内的过度聚集，肝脂肪堆积一般与胰岛素抵抗相关，即通过胰岛素抵抗引起的血液中胰岛素浓度升高，一方面促进了外周脂肪组织中脂肪的分解，使血液中游离脂肪酸增多，大量的游离脂肪酸流入肝脏组织；另一方面导致游离脂肪酸β氧化障碍，大量的游离脂肪酸蓄积在肝脏酯化生成甘油三酯，形成脂肪堆积。第二次打击主要为氧化应激紊乱和炎症反应，第一次打击的脂质过氧化产生大量的活性氧和炎症因子，从而诱发肝脏细胞内的氧化应激紊乱，激活一系列的炎症反应，从而加剧胰岛素抵抗状态，由此形成恶性循环，致使病情加重由nash发展为不可逆的肝纤维化或肝硬化。由于致病因素的不明确性，目前对于nafld的临床治疗并没有针对性的特效药，一般都采用去除诱因和缓解“二次打击”联合治疗的方法治疗。对于nafld的研究，通常用油酸诱导hepg2细胞作为nash的体外模型，本发明通过该模型首次探讨了瑞香素对非酒精性脂肪肝的预防和治疗作用及其机制。
首先我们使用mtt法检测了瑞香素对hepg2细胞活性的影响，结果表明瑞香素在浓度范围为0-50μm时，对nash模型细胞的存活率没有明显影响，因此确定瑞香素的给药浓度分别为5μm、20μm和50μm。
srebp-1c是调节肝细胞胆固醇稳态的重要转录因子,可以激活几种合成和摄取脂肪酸和甘油三酯的基因的表达。pnpla3是肝脏中tg积累的决定因素，并由srebp-1c所调控，其表达可导致tg积聚增加。pparα是可以调节组织中脂质(氧化)分解代谢的转录因子，参与游离脂肪酸的β-氧化，srebp-1c、pnpla3和pparα对维持肝组织细胞内脂肪酸平衡起着重要的作用，缓解nafld脂堆积病情具有重要意义。实验结果表明，瑞香素处理nash模型细胞24h后，细胞内tg含量降低，srebp-1c与pnpla3的表达下降，pparα的表达上升，表明瑞香素可通过下调srebp-1c与pnpla3，上调pparα的表达，减少肝细胞中甘油三酯的含量，预防和治疗油酸诱导所产生的肝细胞脂堆积。
根据文献报道，各种原因促使nafld患者胰岛素敏感性降低，pi3k/akt途径是胰岛素信号传导中的重要途径，pi3k/akt表达的上调有助于降低细胞对胰岛素的敏感性，缓解胰岛素抵抗，从而增强肝细胞对葡萄糖的摄取能力，阻碍nash病情的恶化。实验结果表明，瑞香素处理nash模型细胞24h后，细胞对荧光葡萄糖的吸收增加，pi3k/akt的表达上调，表明瑞香素可以通过调控pi3k/akt途径，促进肝细胞对葡萄糖的摄取能力，缓解胰岛素抵抗，预防和治疗油酸诱导所产生肝细胞胰岛素抵抗。
肝细胞中脂质过氧化产生大量的活性氧，造成氧化应激的紊乱，并释放出大量的炎症因子，氧化损伤和炎症反应会导致细胞的纤维化及肝硬化。本发明发现经瑞香素处理nash模型细胞24h后，细胞内ros含量降低，cyp4a蛋白表达量下降，表明瑞香素可通过抑制cyp4a蛋白表达，降低细胞内ros含量，减少细胞过氧化反应，从而缓解氧化应激的紊乱，预防和治疗油酸诱导所产生肝细胞氧化损伤。
综上结果表明，瑞香素对油酸诱导hepg2细胞所产生的脂堆积，胰岛素抵抗，氧化应激损伤均具有一定的预防和治疗作用，作用机制与瑞香素对糖脂代谢关键因子(ampk)、肝脂代谢关键基因(pparα，srebp-1c和pnpla3)、胰岛素信号通路pi3k/akt途径及氧化应激关键基因(cyp4a)的调控有关，这为瑞香素抗nafld/nash的研究提供了一定的理论基础。