一种用于构建小鼠顺铂内耳损伤模型的联合制剂及其构建的模型的制作方法

本发明涉及医学领域，更具体地说，涉及一种用于构建小鼠顺铂内耳损伤模型的联合制剂及其构建的模型。

背景技术：

顺铂是临床常用的抗肿瘤药物之一，对常见的多种肿瘤，如膀胱癌、睾丸癌、子宫颈癌、肺癌和头颈癌等都具有较好的抗肿瘤效果。但在临床用药过程中，有较高比例的患者出现了耳鸣、听力下降和头晕等不良反应。顺铂的耳毒性和肾毒性、神经毒性一起，已经成为限制其临床应用的主要原因之一。

为了了解顺铂引起的内耳损伤机制，寻找有效防治顺铂耳毒性的药物或治疗方法，人们利用动物构建模型来寻找答案；而小鼠为应用最广泛的实验动物之一。如果能够建立一种稳定的小鼠顺铂内耳损伤模型，就可以利用已知的小鼠基因库知识，从分子水平研究顺铂所导致的内耳细胞死亡(凋亡)的机制，并可能寻找到主导的凋亡调控基因，为下一步的基因防治铂类的内耳损伤提供重要依据。

为此，国内外研究者做了许多尝试，试图建立一个可靠的小鼠顺铂耳毒性模型。但是，由于小鼠体积小、体重轻等原因，小鼠对大剂量顺铂的耐受性很差，当采用大剂量顺铂单次注射或中等剂量顺铂多次注射法时，多数小鼠在注射顺铂后因为严重的肾毒性和神经毒性反应而死亡。正因如此，小鼠顺铂内耳损伤模型的建立多年来一直是国内、外学者们试图攻克的难题之一。

技术实现要素：

针对现有技术无法建立稳定、可靠小鼠顺铂内耳损伤的模型，本发明提供一种用于构建稳定、可靠的小鼠顺铂内耳损伤模型的联合制剂，同时本发明还提供利用该联合制剂构建小鼠顺铂内耳损伤模型的方法。

一种用于构建小鼠顺铂内耳损伤模型的联合制剂，所述联合制剂包括顺铂注射液和速尿注射液，所述顺铂注射液中的顺铂与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比为0.4-1mg/kg，所述速尿注射液中的速尿与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比为200-400mg/kg。

一种利用上述联合制剂构建小鼠顺铂内耳损伤模型的方法，包括如下步骤：给实验小鼠腹腔注射速尿注射液，注射速尿的剂量为200-400mg/kg体重；0.5-1小时后，再腹腔注射顺铂注射液，注射顺铂的剂量为0.4-1mg/kg体重；注射顺铂注射液的当天至注射后的3-7天内，每天注射1-2次0.8-1ml的质量百分数为0.9％的氯化钠注射液，并每天2-5次用四环素眼膏涂抹实验小鼠的眼睑；得到模型；所述实验小鼠为听力正常的成年鼠。

本发明的联合制剂，通过顺铂和速尿的联用以及确定二者合适的剂量，避免因顺铂的肾毒性和神经毒性而导致的小鼠死亡，从而能够成功的构建稳定、可靠的小鼠顺铂内耳损伤模型；次外，利用该联合制剂构建小鼠顺铂内耳损伤模型的方法具有简单、操作方便的优点。

附图说明

图1是实施例1的各组小鼠听觉脑干电反应测听各频率平均听阈值曲线图；

图2是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(4khz)的数据曲线图；

图3是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(8khz)的数据曲线图；

图4是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(12khz)的数据曲线图；

图5是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(16khz)的数据曲线图；

图6是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(20khz)的数据曲线图；

图7是实施例1的实施例1的各组小鼠dpoae检测(24khz)的数据曲线图；

图8是实施例1的b组小鼠平均耳蜗数据图；

图9是实施例1的a组小鼠平均耳蜗数据图；

图10是实施例1的各组小鼠耳蜗毛数据对比图(耳蜗顶回)；

图11是实施例1的各组小鼠耳蜗毛数据对比图(耳蜗底回上)；

图12是实施例1的各组小鼠耳蜗毛数据对比图(耳蜗底回下)；

图13是实施例1的各组小鼠全耳蜗基底膜铺片图。

具体实施方式

一种用于构建小鼠顺铂内耳损伤模型的联合制剂，所述联合制剂包括顺铂注射液和速尿注射液，所述顺铂注射液中的顺铂与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比为0.4-1mg/kg，所述速尿注射液中的速尿与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比为200-400mg/kg。本文中的mg/kg的值，是指注射的药物中顺铂和速尿与小鼠体重的比例，如顺铂注射液中的顺铂与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比5mg/kg，可以做如下理解：将小鼠重量用kg计量，然后对应1kg重量的老鼠注射5mg的顺铂，对应的结合所注射的顺便注射液的质量百分数去换算注射液的体积。

顺铂，又名顺二氯二氨基铂、顺双氯双氨络铂、顺-二氯二氨合等，分子式为：cl2h4n2pt，cas号为：15663-27-1，临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。

速尿，又名呋喃苯胺酸、呋塞米、腹安酸、利尿磺胺、利尿灵、速尿灵；子式c12h11cln2o5s，cas号：54-31-9，临床上用于治疗心脏、肾性水肿，肝硬变腹水、降压症状。

本发明中，进一步的方案为，所述顺铂注射液中的顺铂与用于建立内耳损伤模型实验小鼠重量比为1mg/kg，所述速尿注射液中的速尿与用于建立内耳损伤模型的实验小鼠重量比为200mg/kg。

一种利用上述联合制剂构建小鼠顺铂内耳损伤模型的方法，给实验小鼠腹腔注射速尿注射液，注射速尿的剂量为200-400mg/kg体重(该处的理解可参照具体实施方式第1段的对应内容)；0.5-1小时后，再腹腔注射顺铂注射液，注射顺铂的剂量为0.4-1mg/kg体重；注射顺铂注射液的当天至注射后的3-7天内，每天注射1-2次0.8-1ml的质量百分数为0.9％的氯化钠注射液，并每天2-5次用四环素眼膏涂抹实验小鼠的眼睑；得到模型；所述实验小鼠为听力正常的成年鼠。

本发明中，进一步的方案为，注射速尿的剂量为200mg/kg体重，注射顺铂的剂量为1mg/kg体重，注射顺铂注射液的当天至注射后的3天内，每天注射1次1ml的质量百分数为0.9％的氯化钠注射液，并每天2次用四环素眼膏涂抹实验小鼠的眼睑。

为了观察小鼠是否受顺铂的损伤过重而可能导致死亡的情况，可以在注射氯化钠注射液和涂抹四环素眼膏结束后，继续饲养小鼠10天，在这期间进行观察，得到模型。

对于实验小鼠的选择，并无特殊的限制，可选用实验室常用的小鼠；如采用年龄为8-12周、体重为25-33g的小鼠。

本发明中，为了更好的验证模型的效果和对比，可采用正常小鼠做对照组。

为了避免小鼠在注射过程中挣扎而引起不必要的损伤，在给实验小鼠注射速尿注射液前将小鼠全身麻醉，在注射速尿注射液和顺铂注射液的过程中保持小鼠处于麻醉状态，在注射顺铂注射液后继续将小鼠麻醉3-4小时。为了保证小鼠的健康，在小鼠处于麻醉状态中保持小鼠处于正常体温的状态。对小鼠进行麻醉，对麻醉剂的选择并无特别的限制，可以选用常用的麻醉剂，如异氟醚。

为了更好的说明本发明，下面通过实施例来进一步说明和论证本发明的进步性。

实施例1

1.1实验动物

选用26只听力正常的成年健康cba/caja雄性大鼠(jacksonlab，u.s.a.)，年龄8-12周，体重25-33g。

1.2动物分组和实验方案

20只小鼠按照随机数字法平分为2组，每组10只；

(1)a组小鼠气体吸入异氟醚全身麻醉(4％异氟醚诱导，1.0-1.5％异氟醚维持)后，先行200mg/kg速尿(phoenixpharmaceuticalinc.stjoseph,mousa)腹腔注射，1h后再腹腔注射1.0mg/kg的顺铂(sigmap-4394)。

(2)b组小鼠气体吸入异氟醚全身麻醉后，先行200mg/kg速尿腹腔注射，1h后再腹腔注射0.5mg/kg的顺铂。

所有小鼠在腹腔注射顺铂后仍继续吸入1.5％的异氟醚维持麻醉3h，整个过程注意保持小鼠正常体温；在治疗当天至治疗后3天，每只小鼠每天皮下注射0.9％氯化钠1ml，每天一次，并用四环素眼膏局部涂双侧眼睑，每天2次，两组小鼠均连续观察10天，在治疗前、治疗后第10天时，采用气体吸入异氟醚全身麻醉后进行abr和dpoae检查，完成最后一次客观听力检测后动物立即断头处死，取其双侧耳蜗组织，福尔马林溶液立即固定，一侧耳蜗行全耳蜗基底膜铺片，从蜗底到蜗尖计数全部内外毛细胞，并绘制平均耳蜗图；另一侧耳蜗行环氧树脂包埋半薄切片，染色后观察毛细胞、血管纹和螺旋神经节的病变情况。

6只小鼠作为正常对照(对照组)，实验开始前和开始后均全麻下进行abr和dpoae检测，之后取双侧耳蜗组织，分别行全耳蜗基底膜铺片和半薄切片。

1.3客观听功能检查

1.3.1听觉脑干电反应测听

所有小鼠在实验开始前1周和治疗结束后均全麻下进行听性脑干电反应测听(auditorybrainstemresponse,abr)检测，abr的整个检测过程在均隔音室中进行，动物先吸入4％的异氟醚诱导麻醉约3-5分钟，之后持续吸入1.0-1.5％的异氟醚维持麻醉，记录电极插入颅顶双侧外耳道连线的中点处皮下，参考电极插入检测耳的乳突皮下，接地电极插入对侧耳乳突皮下。采用tucker-davistechnologies(tdtsystem,siggen,fl,usa)的声脉冲，经交流、直流转换后通过高频扬声器分别输出4，8，12，16，20和32khz的刺激声(0.5ms上升/下降期，无平台期，21/s)，刺激声按照5db的强度级别逐渐递减，输入信号被放大50，000倍并叠加500次后再输入电脑，并由tdtbiosig软件控制记录所获得波形。扬声器与检测耳的骨性外耳道口的距离为9cm，测试时对侧耳外耳道内塞入硅胶模来避免或减轻对侧耳感音后的电生理反应。所有小鼠每次均记录双耳各频率的听阈以及各个频率纯音强度的ⅲ波的振幅值(具体的数据参见附图图1)。

1.3.2畸变产物耳声发射检查

同样，所有小鼠在实验开始前1周和治疗结束后均全麻下进行畸变产物耳声发射检查(distortionproductotoacousticemission,dpoae)，dpoae检测在隔音室中进行，动物先吸入4％的异氟醚诱导麻醉约3-5分钟后，再持续吸入1-1.5％的异氟醚维持麻醉。带有麦克风和两个传导声音的管子被塞入外耳道，2个his-3738高频转换头(f1,f2)通过软管置于外耳道内，f1/f2＝1.2，麦克风的输出口接smartdpoae的输入端口，测试软件为smartoae系统的畸变产物耳声发射软件4.53(intelligenthearingsystem,miami,fl,usa)，测试纯音频率为分别为4,8,12,16,20和32khz，f1的刺激强度从80db开始，每5db递减，最低35dbspl，f2的刺激强度比相应的f1小10db，噪音区域是采用24hz的2f-f2；具体测试结果参见附图图2-图7。

1.4组织病理学检查

1.4.1全耳蜗基底膜铺片、耳蜗毛细胞计数及平均耳蜗图

小鼠在治疗后第10天全身麻醉完成abr和dpoae检查后。立即采用颈部牵引的方法处死，断头，打开双侧听泡，取出颞骨组织放入10％福尔马林溶液中固定，约24小时后再将颞骨浸入5％氯化氢溶液脱钙8-12小时。左耳耳蜗行全耳蜗基底膜铺片，在放大20倍的解剖显微镜下分离取出全耳蜗基底膜、球囊斑、椭圆囊斑和3个壶腹嵴。常规施行苏木素染色并制备内耳各终器铺片，显微镜下观察和计数从蜗底到蜗尖的全部内外毛细胞，绘制平均耳蜗图，在放大400倍的光学显微镜下，以目镜中0.24mm的显微测微尺为测量尺度，逐个视野从蜗尖向蜗底进行内、外毛细胞计数，具体参见附图图8-9。计数结果输入到计算机并与软件中预先设置的正常cba小鼠耳蜗毛细胞参考数据相对比，耳蜗图按照从顶回到底回每10％距离中内外毛细胞损失的百分比被依次确立，具体参见附图图10-12。右耳耳蜗用环氧树脂包埋，玻璃刀切片机行半薄切片，染色后观察毛细胞、血管纹和螺旋神经节的病变情况，具体结果参见附图图13。

1.4.2耳蜗半薄切片

耳蜗组织用10％福尔马林溶液固定10-12小时后，用decal(baxterscientificproducts)脱钙24小时，70％、80％、95％、100％、100％酒精和丙酮梯度脱水，用配制好的环氧树脂胶epon812包埋，60℃恒温箱干燥12小时，reichertsupernovamicrotome玻璃刀2um半薄切片，0.5％甲苯胺蓝染色50秒，zeissaxioskop显微镜下观察观察血管纹上皮细胞的病理改变，40倍照相(olympuspm-10ads)，结果显示各组均正常(试验显示无阳性结果，在此处便不提供相应的试验图片)。

结果显示：2组小鼠治疗后各频率abr平均听阈都提高，dpoae值都降低，其中a组的abr平均听阈显著提高，各频率振幅明显降低，高频区dpoae消失；b组的abr平均听阈稍提高，高频(16、20、32khz)振幅轻度降低，低频(4、8、12khz)振幅无变化，高频dpoae稍下降，低频dpoae无变化。全耳蜗基底膜铺片结果a组蜗底外毛细胞全部破坏，蜗尖大部分外毛细胞破坏；b组仅蜗底外毛细胞大部分被破坏，蜗尖外毛细胞形态和数目接近正常，两组内毛细胞均无明显减少。半薄切片结果显示a、b两组小鼠的耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞的形态和数目都接近正常。

发明人经过试验发现，顺铂的注射剂量低于0.4mg/kg体重，小鼠耳蜗毛细胞基本无破坏，不能达到构建模型的目的；而当顺铂剂量在1mg/kg体重后，耳蜗细胞基本上已经全部破坏，即能够实现构建模型的目的，此外，当顺铂的注射剂量高于1mg/kg体重，将会给小鼠的生命造成一定的影响；速尿的注射剂量在200-400mg/kg体重的区间内，能够选择性暂时破坏蜗管外壁的血-迷路屏障使耳毒性药物经此“短路”迅速在内耳液中达到有效的破坏浓度，与顺铂联合应用可以有效建立药物性耳蜗损害的理想动物实验模型；顺铂与速尿进行联用，能够降低小鼠因为顺铂肾毒性和神经毒性造成的死亡风险。

发明人还通过了其他实施例进行试验，得出在本发明的保护范围内的多组试验数据均呈现与上文a组、b组接近的效果，可见本发明构建的小鼠模型稳定、可靠。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。