牙鲆miR-363-3p的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种牙鲆mir-363-3p在抑制细菌感染中的应用。

背景技术：

mirna(microrna)是长度为21～25核苷酸的非编码小rna，具有调控基因表达的作用。mirna广泛存在于动物、植物以及微生物。在动物中，mirna基因首先转录成primarymirna，随后加工成precursormirna，最后成为成熟的mirna。通常mirna特异性地结合到靶基因的3’-untranslatedregion(utr)，从而降解靶基因的mrna或通过转录后方式抑制靶基因编码蛋白质的合成。mirna参与各种生理及病理活动，包括代谢、细胞增值、分化、凋亡、免疫以及癌症等。已有研究表明，mirna在许多微生物病原的感染过程中起重要作用，是抗感染免疫的重要研究靶点。在鱼类中，大量免疫相关mirna已被发现，但是它们的具体调控功能绝大多数未知。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种牙鲆mir-363-3p在抗细菌中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种牙鲆mir-363-3p序列的应用，牙鲆mir-363-3p序列在制备抑制泛素特异性蛋白酶ubiquitin-specificprotease32(usp32)的表达制剂中的应用。

一种牙鲆mir-363-3p序列的应用，牙鲆mir-363-3p序列在制备抑制细菌感染的制剂中的应用。

所述细菌为海豚链球菌(streptococcusiniae)。

所述牙鲆mir-363-3p序列为seqidno:1所示的碱基序列。

所述序列为seqidno:1所示同源性90％以上的碱基序列。

本发明具有如下优点：

本发明的mir-363-3p注射牙鲆后能够显著抑制usp32基因的表达和抑制海豚链球菌的感染。该发明是首次发现鱼类小rna通过调控usp32基因的表达而抑制细菌感染。

附图说明

图1为本发明实施例提供的mir-363-3p抑制海豚链球菌感染脾脏的结果图(*p<0.05)。

图2为本发明实施例提供的mir-363-3p抑制海豚链球菌感染肾脏的结果图(*p<0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

mir-363-3p抑制免疫相关基因usp32的表达

步骤1)mir-363-3p稀释液和nc稀释液制备本发明的mir-363-3p的序列为:5’-aauugcacaguauccaucugc-3’；其是由上海genepharma公司合成。mir-363-3p的对照分子(命名为nc)序列为:5’-gaccaccgcuauccguaucuau-3。

将mir-363-3p和nc分别经depc水(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)稀释至200μg/μl，即分别为mir-363-3p稀释液和nc稀释液。

seqidno:1

aauugcacaguauccaucugc

(a)序列特征：

●长度：21

●类型：核苷酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：rna

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：牙鲆

步骤2)注射鱼类

将15条牙鲆(每条重约10g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为a、b和c。将a组的每条鱼分别肌肉注射100μl步骤1)的mir-363-3p稀释液，将b组的每条鱼分别肌肉注射100ul步骤1)的nc稀释液，将c组的每条鱼分别肌肉注射100uldepc水(对照组)。

步骤3)基因表达检测

对上述步骤2)的各组注射后第10h，取鱼脾脏和肾脏组织。利用eznatotalrna试剂盒(购于omegabio-tek,doraville,美国)提取总rna，用于cdna制备和荧光定量pcr(qrt-pcr)检测usp32基因的表达。具体参见文献zhengwj,sunl.evaluationofhousekeepinggenesasreferencesforquantitativerealtimert-pcranalysisofgeneexpressioninjapaneseflounder(paralichthysolivaceus).fishshellfishimmunol.2011；30:638–45。结果表明，与对照组(c组)相比，a组鱼脾脏和肾脏的usp32基因表达水平分别降低2倍和2.3倍，显著(p<0.05)低于对照组，而b组鱼的usp32表达水平与对照组无显著差别。这些结果表明，mir-363-3p能显著抑制免疫相关基因usp32的表达。

实施例2

mir-363-3p抗海豚链球菌作用

步骤1)mir-363-3p稀释液和nc稀释液的制备：

同上述实施例1步骤1。

步骤2)mir-363-3p-细菌注射液和nc-细菌注射液的制备

在lb培养基中培养海豚链球菌至od600为0.8,然后离心(5000g，40c，10min)，收集菌体，将其悬浮于上述步骤1)制备的mir-363-3p稀释液和nc稀释液中至终浓度为10⁷cfu/ml，分别命名为mir-363-3p-细菌注射液和nc-细菌注射液。

所述海豚链球菌保存于中国科学院微生物研究所cgmcc，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080，保藏编号为：cgmccno.1984，保藏日期2007.3.22，分类命名为海豚链球菌(streptococcusiniae)。

所述lb组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。

步骤3)注射鱼类

将15条牙鲆(每条重约10g)随机分为3组，每组5条。将这3组分别命名为a、b和c。将a组的每条鱼分别肌肉注射100μl上述步骤1)的mir-363-3p-细菌注射液，将b组的每条鱼分别肌肉注射100ul上述步骤1)的nc-细菌注射液，将c组的每条鱼分别肌肉注射100uldepc水(对照组)。

步骤4)细菌感染检测

对上述步骤3的各组注射后第10h，取鱼脾脏和肾脏组织，在1mlpbs中匀浆，将匀浆液涂布于lb平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明，a组鱼脾脏的细菌数显著(p<0.05)低于b组和c组鱼(图1)；同样，a组鱼肾脏的细菌数显著(p<0.05)低于b组和c组鱼(图2)。

这些结果表明，mir-363-3p能够显著抑制海豚链球菌的侵染。

序列表

<110>中国科学院海洋研究所

<120>牙鲆mir-363-3p的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aauugcacaguauccaucugc21