专利名称：用尼美舒利治疗神经变性疾病的制作方法
1.引言本发明涉及尼美舒利(nimesulide)及结构相关的化合物在预防和/或治疗神经变性疾病如早老性痴呆(Alzheimer病)上的应用。这至少部分基于尼美舒利在有效浓度时能抑制细胞死亡的发现。
2.发明的背景2.1.早老性痴呆散发的早老性痴呆是与衰老有关的主要神经变性疾病，在65-85岁之间，发生此病的危险呈指数增长，每5岁增一倍。组织学上，早老性痴呆的标志是淀粉样蛋白沉积在老年斑和脑血管壁上；神经纤维出现缠绕，及神经变性。但是，早老性痴呆的病因学尚不清楚。有人提出遗传因素起作用，包括三体性21淀粉样蛋白β-蛋白前体(“APP”)基因、早老素1(presenilin-1，PS1)和早老素2(presenilin-2，PS2)基因中的突变，及载脂蛋白E 4型等位基因的存在(Younkin，1995，Ann.Neurol.37287-288；Lendon et al.，1997，JAM A 277825)。一些研究表明，β-淀粉样蛋白诱导了培养的神经原细胞调亡(Loo et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.907951-7955；Li et al.，1996，Brain Res.738196-204)。这种调亡的诱导可能涉及立即早期基因蛋白c-jun和fos(Anderson et al.，1995，J.Neurochemistry651487-1498；Anderson et al.，1994，Experimental Neurology 125286-295；Anderson et al.，1996，J.Neurosci.161710-1719)。
有人提出，调亡可能涉及早老性痴呆的发病机理(Smale et al.，1995，Exp.Neurol.133225-230；Anderson et al.，1996，J.Neurosci.161710-1719；Anderson etal.，1994，Exp.Neurol.125286-295)，炎症机制也可能牵连其中(Pasinetti，1996，Neurobiol.Ageing 17707-716)，支持这一机制的是如下观察早老性痴呆患者的血清中急性期蛋白质升高并沉积于淀粉样蛋白斑中；激活的小胶质细胞有定位于老年斑附近的倾向，补体成分定位于营养障碍的神经轴突和神经纤维缠绕物周围(Aisen & Davis，1994，Am.J.Psychiatry 1511105-1113)。抗炎剂被推荐为潜在的治疗剂(Aisen et al.，1996，Dementia 7201-206；McGeer et al.，1996，Neurology47425-432)。环氧合酶-2的选择性抑制剂因其不良副作用少现已被开发成这种炎症的治疗剂(International Publication No.WO 94/13635 by Merck Frosst CanadaInc.)。但是，在本发明之前，无人相信这些药物可用于在早老性痴呆病程中抑制神经变性的非炎症性过程。
2.2.环氧合酶-2环氧合酶(“COXs”)是催化花生四烯酸(AA)生成前列腺素(“PG”)-H2的酶。PG-H2被进一步代谢为有生理活性的PG(如PG-D2、PG-E2和PG-F2α)、前列环素(PG-I2)和血栓烷。具体的PG对不同的组织具有各种效应，常常是拮抗效应。例如，PG-I2和PG-E2是强血管扩张剂，可引起炎症反应，而PG-F2α是血管收缩剂。
已知有两种COX同功酶COX-1和COX-2，它们在生理学上虽然不同，但氨基酸序列和酶促功能相似。COX-1在不同细胞类型中基本上以不同的水平表达。但COX-2基本上不表达，在正常外周组织中一般不能检出(Kujubu et al.，1991，J.Biol.Chem.26612866-12872；O′Banion et al.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894888-4892)。COX-2的表达是可诱导的(如用促细胞分裂剂)，COX-2mRNA水平观察到对炎症刺激剂如白介素1β和脂多糖反应中快速升高，而对糖皮质激素反应中降低。受到这些因素作用时，COX-1 mRNA水平基本上保持不变，表明COX-2是介导炎症的同功酶(Cao et al.，1995，Brain Res.697187-196；O′Banion et al.1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.894888-4892)。
最近的证据表明，COX-2可能在外周细胞的细胞存活和细胞粘附机制上起作用(Lu et al.1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.927961-7965；Tsujii et al.，1995，Cell 83493-501)。Tsujii等报告经基因工程改造表达升高水平COX-2的上皮细胞，对丁酸引起的细胞调亡有耐受性，显示BCL2蛋白表达升高，转化生长因子β2受体水平降低(Tsujii et al.，1995，Cell 83493-501)。Lu等指出，非甾类抗炎药物可诱导涉及COX系统的细胞调亡机制。
COX-1、COX-2和PG合成在正常脑中和在早老性痴呆的病程中的作用至今尚未被完全描绘。PG在脑生理上的重要性可能不依赖炎症机制。在脑中，PG受体见于下丘脑、丘脑和边缘系统(Watanabe et al.，1989，Brain Res.478143-148)。PG涉及下丘脑-垂体激素分泌(Kinoshita et al.，1982，Endocrinol.1102207-2209)、温度调节和睡眠-清醒周期(Hayaishi，1988，J.Biol.Chem.26314593-14596)。最近有证据表明通过突触活性和糖皮质激素在大鼠脑中表达和调节了COX-2 mRNA(Adams et al.，1996，J.Neurochem.666-13；Kaufmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.932317-2321；Yamagata et al.，1993，Neuron 11371-386)。这些研究表明COX-2在脑中作为立即早期基因受调节，并提示PG在跨突触信号传递和长时间增强上可能是重要的。Chang et al.(1996，Neurobiol.Of Aging17801-808)报告，早老性痴呆症COX-2 mRNA表达减少。
3.发明概述本发明涉及尼美舒利及结构相关的化合物在预防和/或治疗神经变性疾病上的应用。这至少部分基于如下发现(i)在神经变性模型中COX-2的表达在神经原中而非胶质细胞中增加(符合非炎症性机制)，和(ii)尼美舒利对β-淀粉样蛋白引起的神经细胞死亡显示神经保护效应。由于COX抑制剂能增加非神经细胞的调亡，这后一个发现是特别意想不到的。似乎尼美舒利抑制神经变性的非炎症性机制，而这不受任何特定理论的束缚。
4.
图1.对照组未受损雄性大鼠脑中COX-2 mRNA的区域表达用原位杂交评估和用X-射线放射自显影显示COX-2 mRNA表达。缩写DG，齿状回；海马结构的神经原锥体层的CA1、CA2和CA3亚区；PAC，顶部皮层(parietal cortex)；PYC，梨状区皮层；AC，杏仁样复合体(amygdaloid)；THAL，丘脑腹后侧核。改编自Paxinos & Watson图版24，1986(The Rat Brain inSteriotaxic，Coordinates，Academic Press，NY)。
图2.大鼠脑中COX-2 mRNA表达的成熟调节从放射自显影图象进行光密度定量。缩写如上及如下所述PYC/AC，梨状区和杏仁样复合体作为单个脑区作COX-2 mRNA表达的定量。N＝5-8/时间点。
图3.对KA引起的惊厥产生反应时对COX-2 mRNA表达的成熟影响从放射自显影图象制备的显微摄影。变化的解剖分布参见图1。对照组，注射赋形剂的未受损大鼠；处死前8小时用KA 8H，KA处理的大鼠；出生后天数，P-7、P-14和P-21。
图4A-D.对KA处理产生反应时大鼠脑中COX-2 mRNA变化的时间过程变化的成熟影响和区域分布从放射自显影图象进行光密度定量。数据表示为平均值±SEM，N＝4-6/组。p＜0.01(与0H组(注射盐水组)相比)；4小时、8小时、16小时、30小时、120小时，KA引起的惊厥发作后时间，以小时计。
图5A-D.对大鼠海马中COX-2 mRNA表达和诱导的分布的成熟影响通过在位杂交试验评估和采用暗视野照明的乳液放射自显影显示P21(A，B)和成鼠(C，D)海马结构中的COX-2 mRNA。A和C，在对照组大鼠(注射赋形剂)中的COX-2 mRNA表达；B和D，KA引起的惊厥发作8小时后的COX-2mRNA。箭头指向DG(粒层)的浅表层。标尺＝200μm。
图6.用凝集印迹杂交试验评价对KA引起的惊厥产生反应时，海马COX-2而非COX-1 mRNA的选择性诱导CTL，注射盐水的对照组大鼠；KA，KA处理的大鼠，毁损12小时后。
图7A-I.在成年大鼠脑中KA引起的COX-2和细胞调亡(A，B)，分别在对照组和KA处理大鼠的CA3海马锥体神经原中COX-2mRNA的表达；(C)，显示有凋亡特征(箭头)神经原的KA毁损大鼠海马结构的CA3亚区。(D，E)，分别为对照组和KA处理大鼠的梨状区皮层的COX-2mRNA表达。(F)，箭头指向KA毁损大鼠的梨状区皮层凋亡细胞。(G「H)，分别为对照组和KA处理大鼠的杏仁样复合体细胞中的COX-2mRNA表达。(I)，箭头指向KA毁损大鼠的杏仁样复合体调亡细胞。通过原位杂交试验评估和采用暗视野照明的乳液放射自显影测定COX-2 mRNA。用原位3′端标记评价KA处理后的细胞调亡特征。标尺在A、B、D、E、G和H中＝200μm；在C、F和I中＝40μm。
图8A-D.体外试验中对谷氨酸盐产生反应的神经原COX-2表达/调节的免疫细胞化学证据接触谷氨酸盐后(12小时)(A)对照组和(B)大鼠原代海马神经原的单型培养物中的COX-2样免疫反应性。(C，D)，分别为对照和谷氨酸盐处理的培养物与免疫吸附COX-2抗体的免疫反应。标尺＝50μm。
图9A-C.尼美舒利对神经胶质中内毒素介导的细胞因子和亚硝酸盐合成/分泌的作用在BV2小鼠无限增殖化的小神经胶质细胞中评估10-9M尼美舒利对(A)TNF、(B)NO中间产物(Griess reaction)和(C)PGE2的合成/分泌的作用。平均值±SEM，n＝8-10/组。脂多糖(″LPS″)＝5μg/ml。LPS和尼美舒利联合加入培养物中；培养时间为24小时。统计采用ANOVA，p＜0.05。
图10A-E.对导致细胞调亡的情况产生反应时，在P19细胞中COX-2 mRNA变化的时间过程
(A)，P19细胞中COX-2诱导的定量分析，n＝4-6/组，p＜0.05(与t＝0相比)；(B)，用化学发光检测对变化进行Western分析评价；(C，D)除去血清(用N2培养基取代)24小时后用Hoechst H33258评价P19细胞中调亡细胞核的形态外观；(E)，除去血清14小时后评估显示DNA阶梯状降解的DNA电泳图谱(第1泳道，t＝0时的对照细胞；第2泳道，去除血清14小时后的DNA阶梯；第3泳道，DNA标志)。这些研究中所用的COX-2多克隆抗体在第6部分有描述。COX-2特异性抗体识别小鼠、大鼠和人脑的总匀浆中估计分子量约为70和65kDa的两个主要区带。
图11A-E.在SH-SY5Y神经细胞中对Aβ1-40介导的氧化应激反应时COX-2的调节(A)显示相对于对照组(CTL)的COX-2免疫反应量的条形图，免疫反应性的衡量来自(B)中显示的数据；(B)从对照组SH-SY5Y细胞或接触Aβ肽48或72小时的细胞制备的蛋白与COX-2抗血清反应的蛋白质印迹；(C)对照组或Aβ处理SH-SY5Y细胞的MTT试验结果；(D)剥脱的(stripped)和与肌动蛋白抗血清免疫反应的(B)中显示的免疫印迹；(E)检查SH-SY5Y培养物的调机制。
图12.用SH-SY5Y神经细胞通过MTT试验评估尼美舒利对Aβ1-40介导的神经毒性的保护作用。
缩写CTL对照；NIM尼美舒利；AB-β-淀粉样蛋白(1-40)。*p＜0.01(与CTL相比)；**p＜0.05(与CTL相比)。
图13.AD和年龄配对的神经学对照组的颞部皮层中COX-2免疫反应性诱导的显微摄影此显微摄影显示在富含神经原的灰质(″gm″)中而非富含胶质细胞的白质(″wm″)区域中COX-2免疫染色的选择性诱导。
图14A-D.AD脑额部皮层神经原的COX-2免疫染色及COX-2免疫染色与AD脑额部皮层AD斑的共定位(A，B)，显示AD神经原的COX-2免疫染色(A，低功率；B，高功率放大)；(C)，扩散斑的免疫染色；(D)用毗邻组织切片Aβ免疫染色评估神经原斑中的COX-2。
图15A-D.AD脑额部皮层的COX-2表达(A)AD额部皮层相对于对照组的COX-2和COX-1mRNA的Northern印迹，数据的定量分析在(B)；(C)AD额部皮层和对照组COX-2蛋白的Western印迹，数据的定量分析在(D)。
图16.ALS脊髓的前角和后角及神经学对照组的神经原中的COX-2mRNA调节。
用X线底片显示放射自显影图象。指向前角的箭头显示ALS病例COX-2mRNA信号的强诱导。
图17A-D.用原位杂交试验评估人皮层癫痫灶活组织检查中COX-2mRNA的升高用X线底片显示放射自显影图象。指向皮层的箭头显示癫痫脑(A)相对于对照组(B)中的COX-2mRNA强信号；(C)和(D)部分显示关于COX-2和COX-1mRNA水平汇编数据的分析。
图18.聚集的Aβ肽对环氧合酶和过氧化物酶活性的增强图19A-B.神经细胞中COX-2的短暂表达增强Aβ介导的氧化还原活性的损害将SH-SY5Y神经细胞转染人COX-2(A)或COX-1(B)基因，并用Aβ25-35处理，然后用MTT试验评估氧化还原活性。
图20A-B.表达COX-2转基因小鼠的产生(A)原位杂交证明COX-2mRNA在TgNHC32小鼠而不在野生型小鼠(一月龄小鼠)中表达；(B)hCOX-2mRNA在NHC32和NHC5上相对于野生型上的区域表达，用Bioquant图象分析进行定量。
图21.在原代小鼠神经原培养物中hCOX-2超量表达增强了Aβ介导的氧化损害。
图22.尼美舒利保护B12神经原细胞抗御谷氨酸介导的氧化应激。
图23.图22的对照研究用LDH试验测定与谷氨酸介导的氧化损害有关的剂量(A)和时间过程(B)。(C)表明尼美舒利对B12培养物无毒性。
5.发明的详细描述本发明涉及环氧合酶-2(″COX-2″)选择性抑制剂尼美舒利及结构相关的化合物在预防和/或治疗神经变性疾病中的应用。这至少部分基于以下发现，即COX-2表达的增加与红藻氨酸产生的神经原损害增加以及与体外系统中建立的神经细胞调亡诱导的增加相平行(见下面的第6和8节)。现有技术报告说COX-2在炎症中起主要作用，并可能涉及神经变性(例如在早老性痴呆的病程中)的炎症成分，但与此相反，进一步发现在人脑中COX-2的表达似乎限于神经原而非胶质细胞(而如果炎症机制起作用的话则预料会在到胶质细胞中表达，见下面的第9节)。已观察到COX-2表达和早老性痴呆、淀粉样蛋白斑所伴有的特征性病理变化之间的相关性(见第9节)。而且，证明在神经原培养物中尼美舒利发挥了抵御β-淀粉样蛋白引起细胞死亡的神经保护效应。鉴于这些发现，按照本发明，尼美舒利及相关的化合物可用来干预早老性痴呆和其它神经变性疾病所伴有的神经细胞调亡过程。尼美舒利及相关化合物的作用(不受任何特定理论的束缚)可能通过降低氧化应激的调亡效应而起作用。
本文所用的术语“尼美舒利”指具有如下式I所述结构的化合物4-硝基-2-苯氧基-N-甲磺酰苯胺。
被认为结构上相关的化合物是具有类似双环结构和选择性、用作COX-2的化合物。例如，尼美舒利的取代化合物、类似物和对映体被认为是结构上相关的化合物。作为另一个例子，如结晶体图所测定，结构上相关的化合物可与尼美舒利竞争结合COX-2，或可结合COX-2的基本上同一部位。此外，按本文定义与其它化合物交联的尼美舒利也被认为是结构上相关的化合物。
可给予患者尼美舒利或结构上相关的化合物在受治疗者的神经系统提供有效浓度。本文中，有效浓度定义为至少能抑制20％神经细胞死亡的浓度。在本发明的非限制性实施方案中，在需要治疗的神经细胞部位，尼美舒利的浓度至少为1纳摩尔，较佳为至少1微摩尔。理想的是，在神经细胞部位的浓度低于10-3摩尔以避免毒性。在一个这样的实施例中，其中待治疗的神经变性疾病是早老性痴呆，受治疗者海马结构中尼美舒利的浓度至少为1皮摩尔，较佳为至少1纳摩尔，更佳为至少1微摩尔。相应的血清浓度可能是至少10皮摩尔，较佳为至少10纳摩尔，更佳为至少10微摩尔。也可使用相等量的结构相关化合物(因强度差异调整到补偿量)。
尼美舒利或结构相关化合物可以达到所需有效浓度的方式给药。例如，合适的给药途径包括口服、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给药和鞘内注射。
尼美舒利或结构相关化合物可包含在合适的药物载体中。此类制剂可供缓释用。
例如(但不是限制)，尼美舒利可以2-800mg/天的剂量口服给药，较佳为50-400mg/天，最佳为200mg/天。
可按照本发明进行治疗的神经变性疾病包括(但不限于)早老性痴呆、帕金森氏病、伴有惊厥的神经变性、肌萎缩性侧索硬化、脊髓损伤以及病情常规上不认为是炎症介导的或自身免疫性的其它疾病。
6.实施例大鼠脑中COX-2的成熟调节和区域诱导6.1.材料和方法动物和兴奋毒性损伤将不同年龄的雄性成年Sprague/Dawley大鼠维持在控制光和温度的环境中，自由摄食、摄水。成年大鼠(250-300g)通过皮下注射红藻氨酸(″KA″，10mg/kg，Sigma)引起海马兴奋毒性损伤。由于KA的摄取年轻大鼠高于成年大鼠(Berger et al.，1986，in Schwartz and Ben-Ari，Advances in ExperimentalMedicine and Biology，Plenum，NY，pp.199-209)，因此调节KA剂量以产生最大兴奋毒性而不达到致死剂量(出生后第7天2mg/kg至出生后第25天6mg/kg)。注射盐水的大鼠作为对照组(0小时时间点)。
COX-1和COX-2cDNA探针通过ClaI消化将含有大鼠COX-1 cDNA全长(2.7kb)的Bluescript质粒(stratagene公司产品)线性化；通过pfMI消化将含有大鼠COX-2编码序列的PCRII质粒(Invitrogen公司产品)线性化(Feng et al.，1993，Arch.Biochem.Biophys.307361-368)。在琼脂糖凝胶电泳后，用Elu-Quick(Schleicher &Schuell)纯化线性化的质粒。
原位杂交在KA引起的惊厥发作后不同间隔时间，将大鼠处死，迅速取脑，在冷的磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH7.4)中淋洗，并在-25℃的甲基丁烷中浸三分钟。将脑切成10微米的切片，冷冻，将所得的冷冻切片安放在涂覆了聚赖氨酸的载玻片上，储存于-70℃。为了进行免疫细胞化学(″ICC″)或原位杂交(″ISH″)，将冷冻切片在含4％多聚甲醛的PBS中作后固定(室温30分钟)，然后用PBS淋洗。为了进行ISH，将组织切片用0.1M三乙醇胺(″TEA″)(pH8.0)淋洗，在乙酸酐中培育(″AAH″，0.25％v/v TEA溶液，10分钟)，以TEA和PBS淋洗。在AAH处理后，组织切片用从COX-2线性化的cDNA转录载体制得的〔35S〕-cRNA探针(0.3μg/ml，2×109dpmμg-1)进行杂交(Feng et al.，1993，Arch.Biochem.Biophys.307361-368)。用有义链杂交作为对照，得出阴性结果。在50℃杂交3小时后，严格洗涤(0.1×SSC，60℃)和脱水，将载玻片暴光X线底片七天，用于定量。然后将载玻片暴露于NTB-2乳剂(Kodak，Rochester，NY)，作COX-2mRNA分布的显微镜分析。显影后，用甲酚紫对组织切片复染。用装有Drexel大学软件的图象分析系统定量分析放射自显影胶片(Tocco et al.，1992，Eur.J.Neurosci.41093-1103)。用ANOVA进行统计学计算，再作posthoc分析。
原位末端标记在平行研究中，将多聚甲醛固定的脑组织切片脱水、空气干燥，用dATP、dCTP、dGTP(0.2mM)、dTTP(13μM)、毛地黄毒苷-11-dUTP和DNA聚合酶I(Boehringer Mannheim)10单位/100μl，于37℃培育2小时。加入20mM EDTA(pH8.0)终止反应。将切片与碱性磷酸酶交联的毛地黄毒苷抗体(Genius System，BoehringerMannheim)室温培育过夜，所述毛地黄毒苷抗体以150mM Nacl、100mM TRIS-HCl(pH7.5)液(含5％绵羊血清)稀释成1∶200。按制造商的方案，用Genius系统以氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐进行比色测定(Sakhi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.917525-7529)。
Northern印迹杂交试验RNA提取按如下进行。大鼠处死后、取脑，储存于-75℃直至试验。从合并的海马组织提取总的RNA(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400)。简言之，将组织在4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠(pH7.5)、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1M β-巯基乙醇(终体积0.5ml)中制成匀浆。用酸性苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀后，将RNA沉淀用70％和100％乙醇相继淋洗。然后将纯化的RNA溶于0.5％十二烷基硫酸钠(″SDS″)中，储存于-75℃。在UV分光光度计中对总RNA进行定量。将从组织中得到的总RNA(5μg)在变性(0.2M甲醛)琼脂糖凝胶上进行电泳。并以2×SSC转到尼龙膜(Nylon 66+；Hoeffer，Sanfrancisco CA)上。用以50％甲酰胺、1.5×SSPE、1％SDS、0.5％奶粉、100μg/ml酵母总RNA和500mg/ml鲑精子RNA配制的106cpm/ml反义COX-1或COX-2〔32P〕-cRNA探针，53℃进行印迹杂交15小时。将印迹于72℃冲洗到0.2×SSC、0.2％SDS的最终严谨度。于-70℃用增感屏将印迹曝光于柯达X线底片(XAR-5)上。
细胞培养从大鼠胚胎鼠脑中得到海马神经原培养物。将E16-E18胚胎在Hank′s平衡盐溶液中分割和培养(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400；Peterson et al.，1989，Dev.Brain Res.48187-195)。每3天更换培养基。对于谷氨酸神经毒性研究，用谷氨酸(250μM，Sigma)在2.4mM钙离子和0.8mM镁离子存在下处理8日龄的培养物。接触谷氨酸6小时后，将培养基换成新鲜的培养基；12小时后，在神经原中评估COX-2样免疫反应性。
在原代大鼠神经原的单型培养物中进行COX-2的免疫细胞化学测定将对照组和谷氨酸处理的培养物在含4％多聚甲醛的PBS中作后固定(30分钟，室温)，以PBS漂洗，用正常血清处理并与第一抗体4℃培养过夜。产生了针对包含小鼠COX-2 C-末端区域的合成肽(CNASASHSRLDDINPT；SEQ ID NO1)的COX-2抗血清(家兔IgG)。经Western印迹分析评估，该抗血清与人和大鼠COX-2起反应而不与COX-1反应。在后面的步骤中使用Vectastain ABC药盒(Vector，Burlingame，CA)完成二氨基苯染色(Pasinetti et al.，1994，J.Comp.Neurol.339387-400)。用合成COX-2肽免疫吸附COX-2抗血清，以控制特异性；用合成COX-2肽30μg/ml于4℃吸附过夜。
6.2.结果成年大鼠脑中的COX-2表达图1用ISH显示，COX-2 mRNA的区域分布以边缘结构中最显著，但新皮层中也存在(与Kaufmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.932317-2321和Yamagata et al.，1993，Neuron 11371-386所报告的相符)。在海马结构中，COX-2 mRNA选择性地表达在颗粒层和锥体神经原层的细胞中。COX-2 mRNA表达也见于顶部皮层的外层、梨状区皮层和杏仁样复合体细胞。
海马COX-2 mRNA的成熟调节表达ISH结果表明，在成熟过程中，海马结构神经原层的细胞亚组中，COX-2 mRNA的表达调节有差别(图2，图3顶部)。出生后P7-P14天，齿状回的颗粒细胞层和锥体细胞层的CA3亚区中COX-2 mRNA增加2倍以上(p＜0.001，图2)。虽然在所检查的其它脑区中COX-2 mRNA的表达较低，但成熟表达的方式是相似的(图2)。出生后P21天，COX-2 mRNA表达在所检查的所有亚区都接近成年水平(图2，图3顶部)。
对KA引起的惊厥的反应为了进一步揭示脑中COX-2的成熟调节，出生后检查了在对KA引起的惊厥产生反应时COX-2 mRNA的表达。尽管KA处理后有强惊厥活动，但在P7天所检查的所有脑区中均未发现可检出的COX-2 mRNA改变(图3，图4A)。P7组KA处理后120小时COX-2 mRNA表达的变化表明发育成熟而非对KA毒性的应答(图4A)。与P7组相反，P14和P21天时，在KA引起的惊厥发作后4-8小时内所检查的所有海马亚区中COX-2 mRNA均增加(图4B和4C)。处理后120小时内P14、P21和成年大鼠脑中COX-2 mRNA表达水平回复到对照水平。
在齿状回内，P14和P21天大鼠对照组COX-2的表达是不对称的、选择性地定位于粒层的较浅层神经原而不是齿状回叶片的较深层颗粒细胞(图5A)。对KA处理的应答中，COX-2 mRNA诱导显示类似的表达不对称性(图5B)。相反，在对照组动物和成年组KA诱导后，齿状回内的不对称性不太显著(图5C和5D)。
在平行试验中，成年大鼠KA引起惊厥后12小时，从海马得到的总RNA的Northern印迹杂交确证了COX-2 mRNA的诱导(图6)。在同一大鼠脑中未检出COX-1 mRNA的诱导。
成年大鼠KA诱导的COX-2和程序性细胞死亡KA诱导的惊厥发作后8小时，成年大鼠脑的海马结构CA3区(图7B)、梨状区皮层(图7E)和杏仁样复合体(图7H)的细胞中，COX-2 mRNA的诱导短时平行于并在解剖学上覆盖于同一脑区中发生的细胞调亡(用原位末端标记评估)(图7C，海马的CA3区；图7F，梨状区皮层；图7I，杏仁样复合体)。通过乳液放射自显影用ISH试验鉴定成年鼠、对照鼠(图7A、7D和7G)和KA处理(图7B、7E和7H)大鼠的细胞内COX-2 mRNA表达。
体外对谷氨酸应答的神经原COX-2表达/调节的免疫细胞化学证据在体外试验中，将大鼠海马神经原的原代培养物接触谷氨酸。用免疫细胞化学证实组成性COX-2表达在基线上(图8B)。接触谷氨酸12小时后，观察到COX-2免疫反应性的增加，这与神经原数目的显著减少正好相符(图8D)。
人癫痫中COX-2的表达人脑活检中在癫痫病灶经ISH检出COX-2 mRNA表达增加(图17A-D)。发现在癫痫患者皮层中COX-2 mRNA而非COX-1 mRNA明显升高。P＜0-05。
7.实施例尼美舒利抑制小神经胶质细胞培养物中细胞因子和亚硝酸盐的产生在体外进行的试验中，发现低浓度尼美舒利(1纳摩尔)有效地抑制脑衍生的无限增殖小胶质细胞(BV-2)和星形细胞中内毒素介导肿瘤坏死因子(″TNF″)产生的诱导(图9A)。与此相似，尼美舒利在阻断亚硝酸盐的产生上也同样有效(Griess反应；图9B)。后一观察特别相关，因为证据表明阻断神经原一氧化氮(″NO″)合成酶能抗御谷氨酸的神经毒性。还发现尼美舒利有效地阻断了脑衍生小胶质细胞中内毒素介导的前列腺素PGE2的诱导(图9C)。
8.实施例程序性细胞死亡细胞中COX-2的表达用已确立的细胞凋亡体外模型研究了COX-2表达的调节。具体地讲，研究了在P19胚胎性癌细胞对血清除去反应中的COX-2调节。在这样的条件下，P19细胞经历了程序性细胞死亡，显示特征性DNA片段和核形态变化。如图10所示，用此系统，观察到调亡和COX-2表达同时发生。
将这些研究延伸到人神经原细胞系SH-SY5Y。现已证明，β-淀粉样蛋白在诱导SH-SY5Y细胞的神经原变性上起作用(Oda et al.，Alzheimers Res.129-34)。用合成的凝集Aβ1-40肽以20μM浓度处理SH-SY5Y细胞不同时间。用COX-2抗血清或肌动蛋白抗血清作对照，进行细胞提取物的Western印迹分析(分别见图11B和D)。在图11A中，从图11B显示的免疫印迹定量分析对照或Aβ处理的SH-SY5Y的COX-2蛋白(在72小时时间点；仅对70kDa mw的种类作定量)。通过用纯化的人重组COX-2(″hrCOX-2″)肽免疫吸附COX-2抗血清取消了COX-2信号。图11显示，如平行培养物MTT试验所评估的那样，用凝集的Aβ1-40(20μm)处理72小时后观察到细胞氧化还原活性减弱。条形图表示平均值±SEM，n＝4-5/组，p＜0.05(t检验)。用Bioquant图象分析(Biometric，Nashville，TN)从数字化图象中分析COX-2集成光密度。还发现，出现了与DNA梯级相同的COX-2表达(图11E)，这是调亡的标志。图12显示，用MTT试验评估尼美舒利在10-6和10-9摩尔时能阻断Aβ1-40的毒性。
有趣的是，凝集的合成Aβ1-40肽(150μm)与纯化的hr-holoCOX-2(COX-2+血红素辅因子，50nM)在37℃、1×PBS中共同培育16小时，测定环氧合酶和过氧化物酶活性(Murphy et al.，1989，Neuron 21547-1558)，环氧合酶和过氧化物酶活性增加(相对于无Aβ时的酶活性水平；图18)。在无血红素时环氧合酶和过氧化物酶水平得到阴性结果。
9.实施例早老性痴呆疾病中COX-2的表达对正常人脑和早老性痴呆(″AD″)患者脑中COX-2的表达进行了研究。免疫细胞化学数据表明，COX-2表达主要定位于人脑中有神经原形态的细胞；在所有受检查脑区均发现有胶质细胞形态的细胞中COX-2免疫染色定位最少。这些结果倾向于提示COX-2的作用是在非炎症功能上。在神经学对照病例的颞部皮层中，COX-2免疫细胞化学信号仅在检出界限上，但AD脑中COX-2显示升高(图13A、13B)。灰质中这种COX-2免疫活性的选择性诱导与下述发现，即大鼠脑中对导致神经原死亡的损伤产生反应时显示有COX-2的神经原诱导，相一致(见第6节)。
同时检查了AD脑中COX-2的细胞免疫分布。观察到神经原COX-2不仅分布于核周体(perikarya)(图14A)而且也见于神经原突起(图14B)。此外，对海马结构毗邻组织切片进行Aβ免疫染色鉴定的扩散斑(图14C)和AD神经炎斑中，也发现稠密的免疫染色。这些发现提示在神经原死亡或存活机制中COX-2的作用。
进行了研究，以对AD和年龄匹配对照者脑中COX-2的表达进行定量。使用定量斑点印迹分析和化学发光检测。用Western分析作定量评估。发现在AD脑的海马匀浆中COX-2含量的升高大于神经学年龄匹配对照组的2倍。
由于免疫细胞化学证据表明COX-2免疫反应性在AD斑，因此比较了AD病例中的COX-2水平和总Aβ，发现直接相关。
在AD脑额叶皮层中发现COX-2 mRNA和蛋白质增加。图15A显示杂交于〔32P〕COX-2 mRNA和COX-1 mRNA的神经学对照(C)和AD额叶皮层总RNA的Northern印迹。用COX-2 cRNA和COX-1 cRNA探针检出的这些mRNA种类代表了在外周组织中发现的同样大小的RNA。图15B显示Northern研究的定量结果。具体地说，AD额叶皮层中相对于对照组而言COX-2 mRNA的优势(prevalence)增加，而通过在杂交膜上归一化为28S rRNA确证了两泳道中存在等量的RNA，在凝胶后转移中无28S rRNA和18S rRNA，证明了RNA完全转移到膜上。用Biquant图象分析从数字化图象分析集成光密度。条形图表示n＝9/组，结果经t检验，表明有显著意义(p＜0.05)。
同样，进行AD额叶皮层与对照组的Western印迹分析，发现COX-2蛋白的量增加。图15C显示该Western印迹的结果。第1泳道和第2泳道表示用于Nortern分析的同样组织的COX-2蛋白含量。第3-4泳道表示用hrCOX-2肽对COX-2抗血清作免疫吸附时，无COX-2结合，证明了此信号的特异性。
用hrCOX-2肽预先吸附抗血清时，也无预期的70kDa hrCOX-2新种类出现(第5泳道)。图15D对这些结果作了定量(关于70kDa种类)。剥下免疫斑点，与肌动蛋白抗血清进行免疫反应来证实变化的特异性(肌动蛋白值对照组100±8；AD对照条形图的94±7％；n＝9/组；t检验值为p＜0.05)。图15D的插图显示COX-2含量和斑点数/mm2的相关性，n＝8，r＝0.72，p＜0.03。用Biquant图象分析从数字化图象，分析了COX-2和肌动蛋白集成光密度。
10.实施例在肌萎缩侧索硬化症中的COX-2表达原位杂交证明在罹患肌萎缩侧索硬化症(″ACS″)患者的脊髓前角细胞中COX-2 mRNA增加(图16)。
11.实施例神经原细胞中COX-2的瞬时表达增强A β介导的氧化还原活性损伤在培养的人SH-SY5Y神经原细胞中研究了COX-2在神经原死亡和/或存活中的作用。用含全长人(h)COX-2 cDNA(pRc/CMV/hCOX-2)或细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因(pRc/CMV2/CAT)的哺乳动物表达载体(pRc/CMV/hCOX，Invitrogen)瞬时转染细胞。用Aβ25-35处理后，用溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)试验评估氧化还原活性的损伤(图19)。用前面描述的抗COX-2抗体在相同的组织培养槽载玻片上进行免疫细胞化学分析，证实了用pRc/CMV/hCOX-2转染的SH-SY5Y细胞中有hCOX-2的过量表达。在用pRc/CMV2/CAT转染的对照细胞中，同样的抗COX抗体引起最小的免疫细胞化学信号。我们发现，与用对照载体转染的SH-SY5Y培养物相比，SH-SY5Y神经原细胞中hCOX-2的瞬时过量表达增强了Aβ25-35(25μM，48小时处理)介导的氧化还原活性的损伤(与Aβ/对照载体相比，±±p＜0.01；与CTL相比，*p＜0.001)。这些数据与显示SH-SY5Y神经细胞中氧化还原活性损伤与COX-2mRNA诱导并存的证据相符(图11)。
12.实施例用COX-2转基因小鼠进行试验基于神经原细胞中COX-2的过量表达可增强Aβ介导的氧化还原损伤这一证据，及AD脑中和试验性神经变性中，神经原COX-2升高的事实，我们生产了一种具有人(h)COX-2神经原过量表达的转基因小鼠模型。为了获得神经原中COX-2的过量表达，制备了一种杂交基因，其中含全部hCOX-2编码区的cDNA序列的表达由大鼠神经原特异性烯醇化酶(NSE)启动子调节。
我们获得了具有hCOX-2 mRNA高度表达的4个种系小鼠。在其中之一(NHC32)，用原位杂交分析评估了COX-2 mRNA(图20A)。我们发现在NHC32小鼠系的海马结构、大脑皮层和其它神经原层有高水平的hCOX-2 mRNA(图20B)。在同样的组织切片上作原位杂交使用针对NSE和hCOX-2的联合免疫细胞化学分析，未发现白质hCOX-2 mRNA水平，从而确认了hCOX-2转基因表达对神经原细胞的选择性。
用转基因小鼠的神经原培养物，还进一步显示hCOX-2过量表达增强了Aβ介导的反应。如图21所示，研究表明，与经同样处理的野生型/同窝对照小鼠(n＝4)的神经原培养物相比，具有神经原COX-2过量表达的转基因小鼠(NHC32，n＝3)的原代神经原培养物，对凝集的Aβ25-35肽介导的氧化还原活性损伤(MTT试验，Aβ25-35μM，48小时)最敏感。此外，作形态学检查时，与野生型对照Aβ25-35处理的神经原培养物(A，插图)相比，转基因hCOX-2小鼠的Aβ25-35处理的神经原显示神经原突起的加剧退化(B，插图)。
13.实施例尼美舒利保护B12神经原细胞抗御谷氨酸毒性我们测试了尼美舒利、吲哚美辛和NS398(另一个优选的COX-2抑制剂)对谷氨酸介导的毒性的作用。在这一试验中，我们使用B12神经原细胞，用处理后条件培养基中乳酸脱氢酶LDH水平的增加量来评估毒性。LDH是细胞毒性的一个指标，其升高一般认为是神经毒性的标志。如图22-23所示，我们发现，尼美舒利以10-6、10-9和10-12M量预处理(24小时前)和共处理(与谷氨酸共处理24小时)，具有抗御谷氨酸毒性的保护作用。吲哚美辛在10-6M有保护作用，而在10-9和10-12M时失去其保护效应。吲哚美辛在10-9M(预处理24小时)时观察到对谷氨酸介导的毒性有临界保护作用。NS398预处理未见保护作用。在预处理的情况下，当谷氨酸处理时，药物保留在介质中。
本文引用了各种出版物，其内容全部收编于此。
序列表(1) 一般信息(i)申请人Pasinetti，Giulio M.和Aisen，Paul S.(ii)发明名称用尼美舒利治疗神经变性疾病(iii)序列数1(iv)通讯地址(A) 收信人Baker & Botts，L.L.P.
(B)街30 Rockefeler Plaza(C)城市New York(D)州NY(E)国家USA(F)ZIP10112-0228(v)计算机可读形式(A)媒介类型磁盘(B)计算机IBM兼容型(C)操作系统DOS(D)软件Fast SEQ第1.5版本(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号08/831,402(B)申请日1997年4月1日(viii)代理人信息(A)姓名Clark，Richard S.
(B)登记号26，154(C)参照/申请号(ix)电信信息(A)电话212-705-5000(B)传真212-765-2519(C)电传(2)SEQ ID NO1信息(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假拟NO(iv)反义NO(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Asn Ala Ser Ala Ser His Ser Arg Leu Asp Asp Ile Asn Phe Thr 165 10 1权利要求
1.一种组合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保护罹患神经变性疾病的患者预防非炎症性神经原细胞死亡的方法中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中神经变性疾病为早老性痴呆。
3.一种组合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保护罹患肌萎缩侧索硬化症的患者预防神经原细胞死亡的方法中。
4.一种组合物，它包含有效量的尼美舒利，用于保护罹患慢性癫痫所致神经变性的患者预防神经原细胞死亡的方法中。
5.如权利要求1所述的组合物，其中神经变性疾病受累神经原接触于至少1微摩尔浓度的尼美舒利。
6.如权利要求2所述的组合物，其中神经变性疾病受累神经原接触于至少1微摩尔浓度的尼美舒利。
7.如权利要求3所述的组合物，其中神经变性疾病受累神经原接触于至少1微摩尔浓度的尼美舒利。
8.如权利要求4所述的组合物，其中神经变性疾病受累神经原接触于至少1微摩尔浓度的尼美舒利。
9.携带编码人环氧合酶-2基因的转基因动物。
10.从权利要求9的转基因动物制得的神经原细胞培养物。
全文摘要
本发明涉及尼美舒利及结构相关的化合物在预防和/或治疗神经变性疾病上的应用。这至少部分基于尼美舒利对β－淀粉样蛋白引起的细胞死亡显示出神经保护作用的发现。不受任何特定理论的束缚,尼美舒利看来抑制神经变性的非炎症性机制。
文档编号A61K31/18GK1241941SQ97180988
公开日2000年1月19日 申请日期1997年11月19日 优先权日1997年11月19日
发明者G·M·帕西内特, P·S·艾森 申请人:纽约市大学西奈山医学院