专利名称：治疗后期过敏反应和炎性疾病的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和逆转后期过敏反应和炎性疾病的症状及表现的方法和组合物。
可以认为慢性哮喘主要是与支气管痉挛有关的炎性疾病。对刺激原反应的反应程度和支气管的变窄，在哮喘病人中比在正常个体中更大。持续的炎症引起支气管反应过度或呼吸道反应过度(AHR)。可能存在粘膜水肿、粘液堵塞和过度分泌；肺软组织正常。呼吸道狭窄可自动或由于治疗而逆转。1型(即发)过敏反应可能在儿童及很多成人哮喘的进程中起重要作用；但是，当成人中该疾病发作时，过敏因素难于确定。接触冷的干燥空气、锻炼及其它加重因素可诱发哮喘。
对哮喘地药物治疗的总目标是预防支气管痉挛并对支气管反应过度进行长期控制。由于对于患者或医生来说预见何时可能发生通常是不可能的，故患有几乎全部是间断性的和/或完全季节性的发作的患者可能需要连续的治疗。
β激动剂用作支气管扩张剂；它们刺激β2-肾上腺素能受体、增加细胞内cAMP并可抑制肥大细胞介质的释放。其它可利用的药物包括茶碱和有关黄嘌呤药物，它们通过未知的机理造成支气管扩张；双色甘酸物，色甘酸阻止介质物质的释放并阻断呼吸系统神经原反射；而皮质类固醇主要降低炎症和水肿。抗胆碱药物可以通过在受体水平阻断副交感神经胆碱能刺激来减缓支气管痉挛。抗组胺药物偶尔会防止或中止过敏性哮喘发作，特别是在儿童中，但是它们对哮喘只能部分有效，因为组胺只是很多介质中的一种。
目前用于治疗过敏性哮喘的药物的药征有若干缺点。总的来说，常规试剂作用的时间较短，且当抗原激发发生后，其可能部分或全部无效。此外，由于与这些试剂如β2-肾上腺素能激动剂和皮质类固醇使用有关的严重副作用，这些试剂的治疗安全阈值较小，故使用它们的患者必须小心控制。
支气管反应过度(或AHR)是哮喘的证明并与发生的呼吸道炎症紧密相关。哮喘及炎症的恶化与支气管反应过度的增加有关，其抗原由抗原性或非抗原性刺激诱发。β2-肾上腺素能激动剂是治疗支气管痉挛的强效制剂，但是对呼吸道炎症或支气管反应过度无作用。事实上，β2-肾上腺素能试剂单独的慢性使用，通过引起β2-受体的下调，可能加重支气管反应过度。目前，只有皮质类固醇是有效的制剂，它们消除支气管反应过度。虽然对哮喘的成人患者来说吸入皮质类固醇相对来说是安全的，但是这些试剂对儿童具有极端的毒性，包括肾上腺抑制和骨密度和生长的降低。因此，寻找更为安全有效的降低支气管反应过度的试剂仍在继续进行。
患有过敏性哮喘的病人，在特定抗原吸入激发后，显示出至少两种不同类型的支气管反应。大多数人只发生急性支气管收缩反应，在1-3小时内可自动好转；这些人被称为“急性反应者”。但是，少数人发生早期和后期的反应。这些人被称为“双重反应者”。在双重反应者中，急性反应自动好转后4-12小时接着发生呼吸道阻力的第二次增加(“后期反应”)。后期反应及双重反应者具有重要的临床意义，这是由于它们与延长的呼吸道反应过度或过度反应(AHR)的关系，症状的恶化及临床哮喘的总体恶化形式，需要主动治疗。
对过敏性动物的药理学研究表明不仅支气管收缩反应，还有炎症细胞返流及介质释放形式在双重反应者中与急性反应者有很大差别。其中在急性期中组胺似乎是支气管收缩剂介质，脂氧合酶途径(即白三烯)的活化产物可能是参与后期反应的主要介质。但是，肥大细胞在Ig-E介导的过敏性呼吸道反应中具有决定作用，而色甘酸钠(肥大细胞膜稳定剂)理论上在“急性”和“双重”反应者中可防止支气管收缩反应。肥大细胞亚型的多相性可在散开反应中扮演重要角色，且其可能依靠信号传导(第二信使系统)中的不同。
在过去几年中已发现支气管内使用的肝素可以是支气管痉挛和支气管收缩的有效抑制剂，并且在预防哮喘中有应用价值(见，例如，Ahmed等，New Eng.J.Med.，32990-95，1993；Ahmed，Resp.DrugDeliv.，IV55-63，1994)。还进一步发现低分子量肝素，例如平均分子量为4000-5000D的肝素有效地防止抗原诱发的支气管收缩；这些低分子量肝素比商购的肝素还表现出相当小的抗凝活性，并且当这些试剂用于治疗哮喘时表现出理想的性质(见Ashkin等，Am.Rev.Resp.Dis.，1993 Intl.Conf.Abstracts，p.A660)。但是当在患者已接触抗原后给药时，商购的和低分子量的肝素在抑制AHR方面效果都是不够理想的。
在原案申请系列号No.08/516,786中，我们公开了平均分子量小于约3000D的超低分子量肝素(ULMWH)，即使当患者被抗原激发后给药，它们在抑制急性哮喘反应者的AHR中也是有效的。但是，试验和临床研究表明虽然吸入的商购肝素也可减轻急性反应者的早期抗原诱发的支气管收缩(虽然不是在抗原激发后)，但是在治疗双重反应者时却是无效的。因此，在我们对ULMWH早期研究后，仍存在疑问，即这些物质在治疗双重或后期反应者中是否象在急性反应者中一样有效。
对作为双重反应者的哮喘患者的常规治疗方案一般是更主动且时间更长的如上所述对急性反应者的临床治疗。但是，这些治疗方法在抑制如上所述AHR中没有实际效果，并导致它们作用时间较短，不能防止后期反应和在双重反应者中观察到的AHR。
然而，应指出呼吸道只是被后期反应(LPR′s)影响的器官或组织的原形。医学文献中已确定在双重反应者哮喘患者中观察到的后期支气管收缩和AHR不是限于哮喘或甚至于肺病症的独立的现象。除了肺病症外，还有LPR′s的皮肤、鼻、眼和系统症状。这些过敏性LPR现象与免疫学机理密切相关。见Lemanske和Kaliner，“后期过敏性反应(Late phase Allergic Reactions)”，Allergies，Principles andPractice(Mosby Yearbook，Inc.，4th ed.1997)。按照对LPR机理的最新解释，似乎这些确诊的临床疾病(不论是皮肤、肺、鼻、眼或其它器官)的过敏机理为组织学炎性组分参与，其在抗原激发后发生的即发过敏或超敏反应之后。反应的结果似乎与肥大细胞介质有关，并被其它靶器官中的常驻细胞传播或被募集进入肥大细胞位点或嗜碱性脱粒的细胞传播。在处理多种过敏性疾病和哮喘中被证明有价值的皮质类固醇可能是有利的，因为它们能减轻此炎症过程。
此外，有肺部以外的疾病，其中炎症反应扮演主要角色，例如，炎性肠道疾病、风湿性关节炎、肾小球性肾炎和炎性皮肤疾病。这些病症也常用抗炎剂治疗，它们作用期短，或象类固醇和非甾类抗炎药，可经常引起不利的系统或胃肠道反应。
需要对于后期过敏反应和炎性疾病的改善的药物治疗。
本发明的目的之一是提供治疗后期过敏性反应或炎症反应为特征的病症的更有效、更安全的方法和组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗抗原引起的后期哮喘和支气管反应过度的方法和组合物，其没有现有技术的缺点。
本发明的另一个目的是提供治疗哮喘性双重反应者的方法和组合物，其在预防和逆转后期哮喘的症状中是有效的。
本发明的另一个目的是提供上述方法和组合物，其在减小特异性和非特异性支气管反应过度方面高度有效，并即使是在抗原激发患者后给药也是如此。
为了完成这些目的以及下文中显而易见的其它目的，本发明本发明包括治疗哺乳动物患者的方法，它们患有以后期过敏反应为特征的病症，例如，包括肺、鼻、皮肤、眼和系统LPR′s，或以炎症反应为特征的疾病，该方法包括给患者支气管内、口服、局部、非肠道、鼻内或眼内使用药物组合物，该药物组合物在每剂量中含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重的超低分子量肝素(ULMWH)。这些肝素的给药可以针对急性症状如在抗原激发后，或慢性症状以抑制抑制反应如哮喘患者中的支气管反应过度。
在本发明方法中有效的ULMWH平均分子量为约1000至约3000D，并可以表现出低水平的抗凝活性或根本没有抗凝活性。还提供了新的药物组合物，例如，包括液体形式的吸入剂(支气管内)组合物，或粉末喷雾剂或气雾剂组合物，其中含有适当浓度的ULMWH。
附图简述
图1显示了对两组过敏绵羊的抗原激发作用，一组由急性反应者组成而另一组为双重反应者。每组数据表示为在SRL(特异性肺阻力)中抗原诱发平均值±SE％变化，显示了以前(基础值)、接触抗原后即刻(P.A.)和至8小时。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
*＝与双重反应者有显著性差异(P＜.05)
图2A和2B包括两个图，显示了在两组过敏绵羊中针对抗原诱发的支气管收缩吸入的商购肝素的不同作用，一组由急性反应者(n＝8)组成而另一组由双重反应者(n＝3)组成。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图3显示了用吸入的FrangminTM(平均分子量5030D)以5.0mg/kg预处理在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中数据以平均SRL(cm H2O/L/sec)，这些动物先不用药物，用Fragmin预处理若干天后重复。
图4是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以5.0mg/kg吸入的FrangminTM预处理的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SEPD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用Fragmin预处理若干天后再重复。
PE400＝卡巴胆碱的累积刺激量，将SRL增加至基础值的400％
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图5显示了用吸入的CY-216(平均分子量4270D)以1.25mg/kg预处理在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示，这些动物先不用药物，用CY-216预处理若干天后重复。
图6是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以1.25mg/kg吸入的CY-216预处理的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用CY-216预处理若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图7显示了用吸入的ULMWH CY-222(平均分子量2355D)以1.0mg/kg预处理在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示，这些动物先不用药物，用CY-222预处理若干天后重复。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图8是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以1.0mg/kg吸入的CY-222预处理的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用CY-222预处理若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图9显示了用吸入的CY-222以1.0mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用CY-222时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图10是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以1.0mg/kg吸入的CY-222处理抗原激发后(图9中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用CY-222处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图11显示了用吸入的ULMWH FRU-70(平均分子量2500D)以1.0mg/kg预处理在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示，这些动物先不用药物，用FRU-70预处理若干天后重复。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图12是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以1.0mg/kg吸入的FRU-70预处理的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用FRU-70预处理若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图13显示了吸入的FRU-70以0.5mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用FRU-70时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图14是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.5mg/kg吸入的FRU-70处理抗原激发后(图13中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用FRU-70处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图15显示了吸入六糖混合物(平均分子量1930D)以0.5mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用六糖混合物时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图16是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.5mg/kg吸入的六糖混合物处理抗原激发后(图15中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用六糖混合物处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图17显示了吸入纯化六糖(平均分子量1998D)以0.062mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用六糖时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图18是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.062mg/kg吸入的纯化六糖处理抗原激发后(图17中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用六糖处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图19显示了吸入纯化四糖(平均分子量1290D)以0.062mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用四糖时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图20是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.062mg/kg吸入的纯化四糖处理抗原激发后(图19中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用四糖处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图21显示了吸入八糖(平均分子量2480D)以0.25mg/kg处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在抗原激发后立即使用八糖时若干天后检测SRL(箭头)。
*＝与对照组有显著性差异(P＜.05)
图22是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.25mg/kg吸入的八糖处理抗原激发后(图21中的箭头)的作用。在接触抗原的动物组中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，当抗原激发后立即用八糖处理后若干天后再重复。
+＝与基础值有显著性差异(P＜.05)
图23显示了吸入双糖(平均分子量660D)以1.0mg/kg预处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的动物组中在接触抗原后即刻(时间为0)和至8小时就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示(如上所述)，这些动物先不用药物，及在用双糖预处理后若干天后重复。
图24显示了口服纯化六糖(平均分子量1998D)以2.0mg/kg预处理抗原激发在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的一只绵羊中就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示，这些动物先不用药物，及在用六糖预处理后若干天后重复。
图25是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以2.0mg/kg口服的纯化六糖预处理后的作用。在接触抗原的一只绵羊中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用六糖预处理后若干天后再重复。
图26显示了静脉使用纯化六糖(平均分子量1998D)以0.25mg/kg预处理在双重反应者过敏性绵羊中对抗原诱发支气管收缩的作用。在接触抗原的一只绵羊中就SRL而言数据以抗原诱发的平均值±SE％变化表示，这些动物先不用药物，及在用六糖预处理后若干天后重复。
图27是方框图，显示了在过敏性绵羊中对AHR以0.25mg/kg静脉使用纯化六糖预处理后的作用。在接触抗原的一只绵羊中基础值及抗原激发24小时后数据以平均值±SE PD400呼吸单位表示，先不用药物处理，用六糖预处理后若干天后再重复。
图28是方框图，显示了分别吸入的、口服及腹膜内使用纯化的六糖在三组小鼠的支气管肺泡洗出液体中，预防嗜酸性细胞流入的活性比较。
本发明总的来说涉及哺乳动物患有的或倾向患有的以后期过敏反应和/或炎症反应为特征的疾病的方法，以及含有适于实施该方法使用的超低分子量肝素的新的药物组合物。
肝素是硫酸化的粘多糖，在肥大细胞中以蛋白多糖的形式合成，并特别富集于多种动物的肺中。肝素不是固定分子量的特定化合物，而实际上是不同硫酸化多糖链的多相混合物，该链由重复单元D-葡糖胺和L-艾杜糖醛酸或D-葡萄糖醛酸组成。由动物组织中分离的肝素的平均分子量为约6000至约30000D。
在药物学上，肝素主要是已知的抗凝剂。此活性来自肝素结合抗凝血酶III(AT-III)的一些残基的能力，加速了AT-III中和活化的凝集因子并防止凝血酶原转变为凝血酶。较大量的肝素可以灭活凝血酶和早期的凝集因子，防止纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
肝素的出血活性与其多糖片断的分子量有关；低分子量组分或片断(例如，分子量小于6000D的片断)具有中度至低度的抗凝血酶和出血作用。同样，由动物组织中分离的低分子量肝素一般比商购肝素具有较低的出血性，但是可能仍具有显著的抗凝剂活性。
商购肝素一般得自牛肺或猪肠粘膜，其平均分子量为约15000至17500D。
已表明肝素是IP3受体的特异性阻断剂并抑制IP3介导的钙离子释放。我们已建议肝素可能在肥大细胞中阻断IP3受体并因此通过信号传导的干扰可调节肥大细胞脱粒和介质释放。体内和体外研究支持了此观点，并表明吸入肝素可减轻绵羊的过敏性支气管收缩，预防锻炼引起的哮喘，并抑制抗IgE引起的肥大细胞组胺释放。已发现以高达1000单位/千克吸入肝素对部分促凝血酶原激酶时间(PTT)没有作用，因此表明“无抗凝剂”作用。
还报道了低分子量肝素(平均分子量约4500D)，其具有降低的APTT活性，在动物研究中在预防抗原引起的支气管收缩反应(ABR)和支气管反应过度，也称为呼吸道反应过度(AHR)方面有效。但是，如上所述及下面的更详细的阐述中，商购肝素和中或低分子量肝素，即使是具有非常低的抗凝剂活性的那些，在动物试验中都不能有效地改善抗原激发后AHR。这些肝素显然只提供了预防、防止作用，但是在治疗抗原诱发的哮喘发作中没有价值。
在母案申请系列号No.08/516786中我们发现并报告了超低分子量肝素(ULMWH)片断不仅是有效的呼吸道麻痹抑制剂，而且在即使当抗原激发后给药时在降低AHR方面具有高效。慢性、有规律地使用ULMWH也可降低AHR，因此ULMWH可以用于哮喘的慢性治疗，该哮喘不论是特异性(即抗原)还是非特异性因素引起的。
我们先前的申请只涉及并公开了试验数据，其表明了ULMWH在治疗急性反应者早期哮喘的效果，而不是在治疗“双重反应者”中，它们表现出早期和后期支气管收缩和延长的AHR。如上所述，不论是抗原激发前或后给药，在我们的早期研究基础上不能预见ULMWH在抑制双重反应者的支气管收缩(早期和后期)及AHR方面是有效的。此预见性的缺乏可以由下面的事实得到证实当抗原激发前给药时，商购肝素和中等或低分子量肝素(分子量＞3000D)抑制急性反应者的AHR，但是在抑制在双重反应者中观察到的后期反应和AHR方面没有显著的效果。
进一步用ULMWH进行控制试验后，我们惊奇地发现，当双重反应者在抗原激发前甚至在抗原激发后吸入给药时，平均分子量为约1000至约3000的肝素片断，在抑制早期和后期的支气管收缩和AHR方面是有效的。
更令人惊奇的是，我们发现在抗原激发前口服和静脉内(或其它非肠道)使用ULMWH，有效地抑制了双重反应者的支气管收缩和AHR。
因此，本发明一方面包括治疗作为双重反应者的哺乳动物并患有抗原引起的后期哮喘的患者的方法，该方法包括在抗原激发前或后给此患者支气管内使用药物组合物，该组合物患有约0.005至约1.0mg每千克患者体重的一种或多种有效的ULMWH片断(馏分)，所述组合物的每个给药剂量，并优选约0.075至约0.75mg/kg每剂量。为了此申请的目的，“优选的ULMWH”抗原定义为具有平均分子量约1000-3000D的肝素片断。当在本发明的方法中使用时，平均分子量为约1000-2500D的ULMWH是特别有效的。每个ULMWH片断可以含有四糖、戊糖、六糖、七糖、八糖和十糖以及更大链长的分子。
本发明中使用的ULMWH片断是硫酸化糖单元的低聚体，例如，其可以具有如下结构
尽管N-脱硫酸化肝素在其它生物系统中具有已知活性，例如作为细胞生长的抑制剂，但是现发现本发明中有效的ULMWH片断中的糖单元为N-硫酸化的；N-脱硫酸化的片断无效。
虽然本发明的方法和组合物中使用的硫酸化多糖在本文中一般指超低分子量肝素，即得自天然肝素的超低分子量片断(或这些ULMWH的合成形式)，但是本发明也包括了衍生自硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸软骨素、戊聚糖多硫酸酯和/或其它糖胺聚糖和粘多糖的硫酸化多糖的用途。但是，目标硫酸化多糖片断的分子量必须为约1000-3000D。也可以使用有效的ULMWH或任何上述其它硫酸化多糖的药用盐，例如钠盐、钙盐或钾盐。
按照本发明的第一个方面，作为双重反应者的人或其它哺乳动物患者，其已吸入、咽下或以其它方式接触抗原(即已被抗原“激发”)，该抗原是已知引起患者哮喘发作的类型，或将来接触抗原激发的患者，通过吸入使用至少一个剂量的含有一种或多种有效ULMWH的药物组合物，其中ULMWH在上述浓度范围内。需要的话，在抗原激发后可以随后使用附加的剂量直到患者康复或保持正常的空气流动耐受水平。
本发明还在第二个方面包括给双重反应者哮喘患者慢性使用有效的ULMWH以降低并抑制早期或后期AHR。“慢性给药”在本文中指每天至少一次使用含有效的ULMWH的药物组合物，至少连续使用10天。含约0.005-1.0mg/kg每剂量，优选约0.0075-0.75mg/kg每剂量的组合物的慢性给药，至少与皮质类固醇相比可以无限持续以提供AHR-抑制治疗，而基本没有副作用。
本发明中用于治疗后期哮喘和其它肺部病症的吸入剂(支气管内)ULMWH组合物，可以含有液体或粉末组合物，其中含有有效的ULMWH片断，并适于喷雾或支气管内使用，或通过气雾以可分开的计量药量使用的气雾剂组合物。
适宜的液体组合物，例如，含有含水的有效ULMWH、药用吸入剂溶剂，例如，等渗盐水或抑制细菌的水。该溶液可以通过泵或压缩准确的喷雾分配器，或通过任何其它常用方式使所需剂量的液体组合物吸入哺乳动物患者的肺部。
适宜的粉末组合物，例如，包括肝素与乳糖或其它支气管给药可接受的惰性粉末彻底混合的粉末状制剂。这些粉末组合物可以通过气雾分配器给药，或包于可打破的胶囊中，由哺乳动物患者将其插入能将此胶囊刺入并以适于吸入的稳定气流吹出粉末的装置。
在本发明方法中使用的气雾剂一般包括氟代烷抛射剂、表面活性剂和助溶剂，并充入到铝制或其它常规气雾剂容器中，该容器再被适当的计量阀密闭并压入抛射剂，制备出计量药量的吸入器(MDI)。
在适用于加压气雾剂分配器如MDI中的任何抛射剂载体中的有效的ULMWH的总浓度，必须足够高以便每个剂量提供约0.005-0.1mg(5-100μg)每千克患者体重的有效的ULMWH。因此，例如，如果MDI每次启动施用约85μl的含药物抛射剂载体，对于重75千克的哺乳动物患者来说在载体中有效的ULMWH的浓度约为0.0045-0.088mg/μl(4.5-88μg/μl)，每次启动施用0.375至7.5mg(375-7500μg)的ULMWH，如果需要一次启动施用全部剂量的话。如果需要两次启动给药，相应的浓度范围为约0.0022-0.044mg/μl(2.2-44μg/μl)，每次启动施用0.188至3.75mg(188-3750μg)的ULMWH。
在任何液体喷雾器溶液中有效的ULMWH的总浓度必须足够高以便每个剂量提供约0.05-1.0mg(50-100μg)每千克患者体重的有效的ULMWH。因此，例如，如果每次启动用喷雾器施用5ml溶液，对于重75千克的哺乳动物患者来说有效的ULMWH的浓度约为0.75-15.0mg/ml。
在本发明的另一个方面，给患有抗原引起的后期哮喘的患者，即双重反应者，在患者接触抗原激发前，通过口服或非肠道(例如，IV或IM)使用含有效的ULMWH的组合物。该口服或非肠道使用的组合物每个剂量含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重的有效的ULMWH。在抗原激发前最多8小时(但是优选不超过4小时)进行口服或非肠道组合物的给药，并在降低早期和后期支气管收缩和在抑制AHR方面是有效的。
药物领域的技术人员不难理解，很多常规方法和仪器可用来准确地施用支气管内药物的计量剂量并按照患者的体重和患者病症的严重性调整所需剂量。此外，很多本领域已知的液体、粉末和气雾剂载体适于本发明的支气管给药ULMWH组合物，并且很多药用口服和非肠道给药载体可以用于口服和非肠道给药的含ULMWH组合物。本发明不限于任何特定的惰性载体、溶剂、赋形剂或剂型，并且不限于支气管给药的任何特定方法或仪器。
这些药物组合物还可以是有效的ULMWH作为活性组分含于任何药用口服、注射或IV药物载体，或局部或眼内给药载体中的剂型。每种剂型含有约0.005-1.0mg/kg平均患者体重的有效的ULMWH(一种或多种ULMWH)和药用惰性载体组分，例如，常规赋形剂、载体、填充剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、助溶剂、甜味剂、着色剂和可常规包括在口服给药的药物剂型中任何其它无活性组分。适宜的口服剂型包括片剂、胶囊、小胶囊、凝胶胶囊、丸剂、液体溶液剂、混悬剂或酏剂、散剂、锭剂、微粒和渗透性给药系统。注射和IV剂型包括等渗盐水溶液剂或含适宜的缓冲剂的右旋糖溶液剂及防腐剂。很多适宜的剂型和载体，及列于上述的无活性组分，是本领域已知的并在标准教科书中给出，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，17版(1985)。
即使是在抗原激发发生后，本文中描述的ULMWH组合物为早期和后期抗原引起的哮喘以及后期过敏反应为特征的其它疾病提供了高效的治疗。
为了表明与较高分子量肝素相比，有效的ULMWH在治疗哮喘性双重反应者中的意料之外的优越性，对双重反应者过敏绵羊，在抗原激发前和后，进行试验比较不同肝素类型的作用。这些试验的详细说明和所得结果见下列实施例和附图的图示。
下列实施例，举例说明了本发明的方法和组合物并表明其效果，不是旨在给出特定的组合物、物质、方法或给药方案，为了实施本发明必须排他地使用。
实施例1
给双重反应者过敏性绵羊使用吸入的ULMWH
方法
肺气流阻力
将先前描述的对猪蛔虫抗原双重支气管收缩反应的过敏性绵羊用于所有的研究中。用带胶头的鼻气管插管给绵羊插管，并提供食管球导管技术检测非气流阻力(RI)，同时用身体体积描记法检测胸部气体体积。数据以特异性RL(SRL，定义为RL计时胸部气体体积(Vtg))。
呼吸道反应
为了评价呼吸道反应，在吸入缓冲盐水前和后并在每次进行10次呼吸的增加浓度的卡巴胆碱(0.25，0.5，1.0，2.0和4.0％wt/vol溶液)的给药后，通过检测SRL进行吸入卡巴胆碱的累积剂量-反应曲线。通过确定卡巴胆碱(呼吸单位)的累积激发剂量(PD400)检测呼吸道反应，其增加SRL至基础值的400％。一个呼吸单位定义为吸入一次1％的卡巴胆碱溶液。
肝素片断
在此处报告的这些研究中，给双重反应者过敏性绵羊在抗原激发前和/或后使用不同的肝素物质。这些肝素中的一些是平均分子量为1000至3000D的ULMWH，一些为平均分子量较高的，一种为较低分子量的。被测的肝素片断见下表1。
表1
肝素片断和其分子量
1抗凝剂八糖混合物。
2非抗凝剂八糖混合物。
3由商购猪肝素中得到的低聚糖，主要含有四糖、六糖、八糖和十糖片断。
4由六糖混合物通过凝胶柱色谱得到的，含有约70％的八糖和30％的十糖片断。
5由六糖混合物通过凝胶柱色谱得到。
6由六糖混合物通过凝胶柱色谱得到。
7双糖被三硫酸化，但是其分子量很低，可以认为是具有肝素样性质的ULMWH片断。
试验方案
呼吸道研究
确定每个动物的基础值呼吸道反应(PD400)，任何在不同的试验天数用猪蛔虫对绵羊进行呼吸道激发。在激发前、激发后立即及后8小时每小时检测SRL。抗原激发后当AHR发生时24小时检测激发后PD400。此方案在至少14天后重复，但是给每个动物使用一个剂量的被测肝素片断之一，使用时间在抗原激发前约30分钟或在激发后SRL检测后即刻。
数据分析
数据表示为
(a)SRL(％变化)＝(激发后SRL-基础值SRL)×100/基础值SRL
(b)PD400(呼吸单位)
结果
图1显示了两组过敏性绵羊对抗原激发的不同反应，一组由急性反应者组成而另一组由双重反应者组成。在抗原激发后约3小时后急性反应者的SRL回到基础值并保持在此。但在双重反应者中，在约6小时有SRL的后期峰，在研究结束的第8小时其水平显著高于基础值。正是此第二、后期峰是双重反应者的特征。
图2A和2B描述了在急性反应者(图2A)和双重反应者(图2B)中用商购肝素在激发前处理对SRL的作用。虽然急性反应者的SRL即使在抗原激发后保持在接近基础值的水平，但在双重反应者中早期和后期的SRL不被肝素预处理减弱，即使给双重反应者使用高达2000单位每千克。
图3-6表明了当在抗原激发前给药时，低分子量肝素片断，Fragmin和CY-216在改善双重反应者的支气管收缩和AHR缺乏效果。
图7-10表明用吸入ULMWH CY-222(平均分子量2355D，在本发明的有效的ULMWH范围内)预处理及在抗原激发后处理，在改善双重反应者的早期和后期抗原诱发的支气管收缩和AHR方面有效。
图11-14表明了在阻力早期和后期哮喘中，用ULMWH FRU-70(平均分子量2500D)预处理及在抗原激发后处理的效果。
图15-22显示了即使是当抗原激发后给药时，不同的有效ULMWH片断在显著降低双重反应者的支气管收缩和AHR方面的效果。
图23表明了双糖片断，其平均分子量仅为约660D(基本低于有效的ULMWH片断要求的分子量范围)，在改善双重反应者过敏性绵羊中的抗原诱发的支气管收缩方面无效。
在图7-14和17-22反映了其数据的这些试验中，对每个ULMWH片断来说，给过敏性绵羊使用的有效的ULMWH的剂量是最小有效量(通过剂量-范围试验确定)。可以观察到在双重反应者的治疗中，不同的ULMWH具有变化的最小有效剂量水平。在抗原激发前使用的CY-222和FRU-70的最小剂量为约1.0mg/kg，但是在抗原激发后FRU-70和吸入的六糖混合物的为约0.5mg/kg。纯化的四糖，其在被测的有效的ULMWH中具有最低的平均分子量，当在抗原激发后使用0.062mg/kg时具有最小的有效量，这与纯化的六糖相同。最小数据表明至少在治疗双重反应者中平均分子量接近最低限值约1000D的纯化片断可能是最有效的ULMWH。就观察到的抗过敏和/或抗炎活性而言，最佳的结构域和/或序列似乎是四糖。
实施例2
给双重反应者过敏性绵羊使用口服ULMWH
在本试验中，试验动物和评价方法同实施例1的方法。
在用猪蛔虫抗原激发前90分钟，给一只双重反应者过敏性绵羊口服2mg/kg纯化的六糖(平均分子量1998D)。用六糖预处理对SRL从基础值(使用六糖的时间)至抗原激发后8小时的作用见图24。为了比较，图24还给出了在同一双重反应者绵羊中的SRL变化百分率(在若干天前进行的试验中)，该绵羊接受抗原刺激但是不用ULMWH预处理。
图25显示的是代表性的PD400值，当该绵羊接受抗原刺激并用六糖预处理及不预处理(对照)时，在基线和抗原激发处检测该值。
实施例3
给双重反应者过敏性绵羊静脉使用ULMWH
按照实施例2的方法，用另一只双重反应者过敏性绵羊进行试验，不同的是在一个试验中在抗原激发前1小时静脉使用0.25mg/kg的纯化的六糖，而在第二个试验(对照)中接受抗原刺激但不预处理。预处理和对照试验的SRL变化百分率见图26，而这些试验在基线和抗原激发后的PD400值见图27。
实施例4
在小鼠中预防抗原诱发的嗜酸性细胞返流
在四组敏化的实验室小鼠(每组n＝3)中，于抗原激发后24小时进行支气管肺泡灌洗以确定每组中嗜酸性细胞返流值。用气雾盐水(安慰剂)或纯化的六糖处理，通过以下途径并按照以下剂量给药，分别是吸入气雾剂8，口服(100μg)和腹膜内(40μg)。通过比较在使用六糖后和盐水组的支气管肺泡灌洗液中检测的此返流水平，确定每个治疗组中嗜酸性细胞返流的抑制百分率。
小鼠的三个治疗组的平均抑制百分率见图28。接受吸入和口服六糖的小鼠显示了嗜酸性细胞返流40-50％的降低，而接受腹膜内六糖的小鼠显示了约20％的降低。
8小鼠(n＝3)被置于含于9ml灭菌注射水中的10mg六糖的室中，该水被气雾化。让小鼠吸入此气雾剂约30分钟。
在急性和双重反应者中观察到的商购肝素的不同作用(见图2A和2B)可以表明在呼吸道过敏性反应中不同信号途径的参与。这表明在呼吸道中的免疫介导的肥大细胞反应中，IP3在“急性反应者”中是主要的活性途径，而非IP3途径(例如，二酰基-甘油/蛋白激酶C或其它途径)可能是“双重反应者”中的有效途径。
后期反应和AHR与显著的呼吸道炎症有关。在此反应中，对呼吸道粘膜和支气管肺泡灌洗液(BAL)的病理学研究已显示了嗜酸性细胞、嗜中性白细胞和活化的T-淋巴细胞的返流。已在后期反应中观察到了源自嗜酸性细胞的炎性介质在血浆和BAL中的升高的水平，包括嗜酸性阳离子蛋白和主要的基本蛋白。在后期反应中也观察到了TH2型细胞因子(IL4和IL5)在过敏原激发后的上调。因此，细胞炎症反应，结合释放的前炎症介质(例如，白三烯，PAF，嗜酸性蛋白等)和在支气管粘膜局部产生的细胞因子，在后期过敏性炎症和支气管收缩中扮演了核心角色。
通过用“抗过敏剂”(如色甘酸钠)防止肥大细胞介质释放或通过“抗炎”剂如糖皮质激素作用，AHR及呼吸道炎症可以得到改善。此“抗过敏剂”只是有效的预防剂并可预防介质释放和AHR。由于这些试剂不具有抗炎活性，当在接触抗原后给药时，它们一般是无效的。相反，“抗炎剂”可减轻抗原激发后AHR和呼吸道炎症，不论是在接触抗原前或后给药。我们的数据表明ULMWH的作用类似于糖皮质激素的抗炎作用。
由于即使当抗原激发后给药，有效的ULMWH也能改善AHR，因此它们可以用于治疗与AHR有关的非哮喘性病症，例如，慢性支气管炎、肺气肿和肺泡纤维变性。
此外，基于我们的发现，考虑到在抑制哮喘性LPR中某些ULMWH的效果，类似于皮质类固醇的抗炎作用，有效的ULMWH可用于治疗下列病症并通过以下途径给药
1.在肺外部位的后期反应和炎症反应
(a)过敏性鼻炎
(b)过敏性皮炎
(c)过敏性结膜炎
2.炎症反应扮演主要角色的肺外部位疾病
(i)炎性胃肠疾病
(ii)风湿性关节炎及其它胶原血管性疾病
(iii)肾小球性肾炎
(iv)炎性皮肤病
(v)肉样瘤病
3.给药途径
(i)支气管内
(ii)鼻内
(iii)局部
(iv)口服
(v)非肠道(IM或IV)
然而，应该强调本发明不以任何方式受限于任何理论或实际的生理或生化机理或途径，虽然这些实际的作用机理有所参与，但是包括治疗后期过敏性反应为特征的病症，或治疗双重反应者哺乳动物患者的方法，以及用于上述方法中的组合物。
因此，本发明提供了达到本发明多种目的并适合实际应用条件要求的方法和组合物。
由于对上述发明抗炎作出多种可能的实施方案，并正如对上述实施方案可作出多种变化，应理解此处描述的所有内容是为了解释说明而不是为了限制。
在下面的权利要求中给出了要求保护了新的及需要用专利证书保护的内容。
权利要求
1.治疗患有或倾向患有以后期过敏反应、呼吸道反应过度或炎症反应为特征的病症的哺乳动物患者的方法，所述方法包括给该患者使用药物组合物，该药物组合物含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重每个剂量的超低分子量肝素(ULMWH)，所述ULMWH的平均分子量为约1000至约3000D。
2.权利要求1的方法，其中所述ULMWH的平均分子量为约1000至约2500D。
3.权利要求1的方法，其中所述ULMWH包括选自如下的肝素片断四糖、五糖、六糖、七糖、八糖和十糖及其药用盐。
4.权利要求1的方法，其中所述ULMWH是N-硫酸化的。
5.权利要求1的方法，其中所述组合物含有约0.075至约0.75mg的所述ULMWH每千克每个剂量。
6.权利要求1的方法，其中所述ULMWH基本上不具有抗凝剂活性。
7.权利要求1的方法，其中所述组合物通过口服、非肠道、局部、支气管内、鼻内或眼内途径给药。
8.权利要求7的方法，其中所述非肠道给药是静脉或肌肉内给药。
9.权利要求1的方法，其中所述病症以后期过敏反应为特征，选自肺后期反应、鼻后期反应、皮肤后期反应、眼后期反应及系统的后期反应。
10.权利要求9的方法，其中所述后期反应为肺后期反应。
11.权利要求10的方法，其中所述病症是后期哮喘。
12.权利要求1的方法，其中所述病症是以呼吸道反应过度为特征的非哮喘性病症。
13.权利要求12的方法，其中所述病症选自慢性支气管炎、肺气肿和肺泡纤维变性。
14.权利要求1的方法，其中所述病症的特征是炎症反应。
15.权利要求1的方法，其中病症选自过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、炎性胃肠疾病、风湿性关节炎、胶原血管性疾病、肾小球性肾炎、炎性皮肤疾病和肉样瘤病。
16.权利要求1的方法，其中所述组合物包括所述ULMWH在水、药用液体吸入剂载体中的溶液剂或混悬剂。
17.权利要求16的方法，其中所述载体是等渗盐水或抑制细菌水。
18.权利要求16的方法，其中所述组合物通过泵或压缩准确的喷雾器给药。
19.权利要求16的方法，其中给患者使用足够量的所述组合物，以提供剂量为约0.05-1.0mg/kg的所述ULMWH。
20.权利要求16的方法，其中所述组合物含有约0.75-15.0mg/ml的所述ULMWH。
21.权利要求1的方法，其中所述组合物为含有气雾抛射剂的气雾剂组合物。
22.权利要求21的方法，其中所述组合物通过计量剂量的吸入器分配。
23.权利要求21的方法，其中给患者使用足够量的所述组合物，以提供剂量为约0.005-0.1mg/kg的ULMWH。
24.权利要求21的方法，其中所述组合物含有约2.2-88μg/μl的ULMWH。
25.权利要求1的方法，其中所述组合物含有所述ULMWH与支气管给药可接受的惰性粉末混合的粉末状制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述惰性粉末是乳糖。
27.权利要求25的方法，其中组合物通过气雾剂分配器给药。
28.权利要求25的方法，其中所述组合物通过可破碎的胶囊给药。
29.权利要求1的方法，其中所述组合物在诱发过敏性反应的抗原激发前给患者使用。
30.权利要求1的方法，其中所述组合物在诱发过敏反应的抗原激发后给患者使用。
31.治疗患有或倾向患有以后期过敏反应、呼吸道反应过度或炎症反应为特征的病症的哺乳动物患者的组合物，所述组合物在药用吸入剂、口服、非肠道、疾病、鼻内或眼内给药载体中含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重每个剂量的超低分子量肝素(ULMWH)，所述ULMWH的平均分子量为约1000至约3000D。
32.权利要求31的组合物，其中所述ULMWH的平均分子量为约1000至约2500D。
33.权利要求31的组合物，其中所述ULMWH包括选自如下的肝素片断四糖、五糖、六糖、七糖、八糖和十糖及其药用盐。
34.权利要求31的组合物，其中所述ULMWH是N-硫酸化的。
35.权利要求31的组合物，其中所述组合物含有约0.075至约0.75mg的所述ULMWH每千克每个剂量。
36.权利要求31的液体或流体组合物，其中每毫升组合物含有约1.0至约20.0mg的所述ULMWH。
37.权利要求31的组合物，其中所述ULMWH基本上不具有抗凝剂活性。
38.权利要求31的组合物，其中含有所述ULMWH在水、药用吸入剂载体中的溶液。
39.权利要求38的组合物，其中所述载体是等渗盐水或抑制细菌水。
40.权利要求38的组合物，其中所述组合物通过泵或压缩准确的喷雾器给药。
41.权利要求38的组合物，其中还含有气雾抛射剂并适于通过计量气雾剂量的吸入器给药。
42.权利要求31的组合物，其中含有所述ULMWH与支气管给药可接受的惰性粉末混合的粉末状制剂。
43.权利要求42的组合物，其中所述惰性粉末是乳糖。
44.权利要求42的组合物，其通过气雾剂分配器给药。
45.权利要求42的组合物，其通过可破碎的胶囊给药。
46.权利要求31的组合物，其中含有药用口服载体。
47.权利要求46的组合物，其口服剂型选自片剂、胶囊、小胶囊、凝胶胶囊、丸剂、液体溶液剂，混悬剂或酏剂、散剂、锭剂、微粒及渗透给药系统。
48.权利要求47的组合物，其中还含有赋形剂、载体、填充剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、助溶剂、甜味剂或着色剂。
49.权利要求31的组合物，其中含有药用非肠道给药用载体。
50.权利要求49的组合物，其中所述载体包括等渗盐水溶液或右旋糖溶液。
51.权利要求49的组合物，其适于静脉给药。
52.权利要求49的组合物，其适于肌肉内给药。
53.权利要求31的组合物，其中含有药用局部给药用载体。
54.权利要求31的组合物，其中含有药用鼻内给药用载体。
55.权利要求31的组合物，其中含有药用眼内给药用载体。
56.治疗患有或倾向患有以后期过敏反应、呼吸道反应过度或炎症反应为特征的病症的哺乳动物患者的方法，所述方法包括给该患者使用药物组合物，该药物组合物含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重每个剂量的硫酸化多糖，所述硫酸化多糖的平均分子量为约1000至约3000D。
57.权利要求56的方法，其中所述硫酸化多糖得自糖胺聚糖或粘多糖。
58.权利要求57的方法，其中所述硫酸化多糖得自肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素B、硫酸软骨素或戊聚糖多硫酸酯。
59.权利要求56的方法其中所述硫酸化多糖包括四糖、五糖、六糖、七糖、八糖和十糖及其药用盐。
60.权利要求59的方法，其中所述硫酸化多糖包括四糖。
全文摘要
治疗患有或倾向患有特征如下的疾病的哺乳动物患者的方法,所述疾病特征为后期过敏反应、呼吸道反应过度或炎症反应,例如,哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、过敏性结膜炎、炎性胃肠疾病或风湿性关节炎,所述方法包括给该患者使用口服、非肠道、支气管内、局部、鼻内或眼内用药物组合物,该药物组合物每个剂量含有约0.005至约1.0mg每千克患者体重的超低分子量肝素(ULMWH)或其它硫酸化多糖,它们的平均分子量为约1000至约3000D。还公开了用于此新的治疗方法中的适宜的吸入剂及其它药物组合物。
文档编号A61K9/00GK1269715SQ98808919
公开日2000年10月11日 申请日期1998年8月4日 优先权日1997年8月4日
发明者T·阿迈德 申请人:巴克·诺顿药物有限公司