专利名称：用于检测扇贝中过敏原基因的引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用染料法实时荧光聚合酶链式反应技术进行扇贝中过敏原基 因快速筛选与检测的方法，具体是一种快速检测扇贝过敏原基因tropomyosin所用的引物 序列。
背景技术：
贝类是人类最优质的食用蛋白资源之一，也是联合国粮农组织公布的八大类过敏 食物之一，贝类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量，为此开展贝类过敏 原的检测研究十分必要。对过敏人群来说，少量食入甚至接触贝类蛋白就可能导致过敏的 发生，因此可靠的贝类过敏原检测方法将有助于规范水产食品标签，保证消费者的食品安 全。虽然大多情况下贝类过敏的患者可以根据贝类外部特征避开过敏源，但对于一些加工 过产品，如贝柱、海鲜丸子、海鲜火腿、海鲜酱料等情况下，要避开相应的过敏原就变得比较 困难。在没有可辨别的外部形态特征的情况下，很容易在误食了过敏性贝类后出现危险症 状。为提高水产品食品安全性水平，加强水产品中过敏原控制，实际执法中需要针对贝类及 过敏原成分检测方法。如何快速解决贝类成分检测保证海鲜制品的安全性是亟待解决的问 题。
发明内容
本发明的目的是针对扇贝中过敏原基因tropomyosin设计一组特异性引物，建立 一种快速筛选和检测贝类过敏原的方法，以克服基于蛋白的检测方法在贝类加工产品检测 中的局限性，为食品过敏原检测提供有效工具，从而加强水产品的监督监管，确保产品标签 的一致性，保护消费者的知情权和选择权。本发明的主要原理为利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得 到DNA ；设计一组可以特异的识别扇贝过敏原序列的两个引物，以提取的DNA为模板通过实 时荧光PCR。反应在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到IO9 101°拷贝。测定熔解曲 线时，在反应体系中加入荧光染料Syb Green，染料与DNA双链结合并发出荧光，由于反应 中存在少量的非特异聚合体(如引物二聚体等)，能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度 较特异性结合低，当扩增结束后，再缓慢加温，当DNA变性后，染料被释放，荧光减少，而非 特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线 将非特异性讯号和特异性讯号区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的 对数成正比，以此可以确定是否有引物特异性扩增产物，特异性扩增结果可通过荧光染料 结合形成的扩增曲线观察扩增结果。本发明涉及的tropomyosin基因染料法实时荧光PCR扩增检测用的引物，其序列 如下(1)正向引物(F) :5，-GGATTCTGCTAAAAACGTTGCA-3，；(2)反向引物(R) :5，-CTTACGGGCGGCCTCAT-3，；
在应用中，正反向引物体积比为1 1。使用上述引物，检测扇贝产品中过敏原基因成分的方法，依次包括下列步骤 (1)-(3)(1)待检样品DNA的提取 DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用动物组织DNA提取试剂盒。(2) PCR 扩增A.在扩增反应管中加入Real time MIX 10 μ L、10 μ mol/L上游引物0. 5 μ L、 1(^11101/1下游引物0.5“1^、1(^11101/18又匕 green 染料 1. 25 μ L、ddH20 (灭菌双蒸水)补足 至25 μ 1，混勻；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2 μ L (约200ng)，混勻；C.在荧光PCR仪中进行PCR反应35_40个循环程序为940C 3min ； (94°C 15s ；55°C 20s ；68°C 20s) X35-40cycles ；加做熔解曲线程序为。94"C 15s，60°C 15s ；95°C 15s。(3)结果检测使用扇贝过敏原特异性基因引物对样品DNA进行扩增，扩增产物熔解曲线的峰值 在 83 士 0. 5 0C ο
图1用染料法实时荧光PCR检测某待测扇贝样品DNA，样品的熔解曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1按照以下程序进行检测(1)待测贝类样品DNA的提取A.称取IOg样品，液氮研磨成粉末取0. Ig转至1. 5mL离心管中。加入600 μ L预 热的裂解缓冲液和蛋白酶K 20 μ L轻轻混勻后，65°C水浴保温3h ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 μ L，上下颠倒充分混勻，抽提^iiin ；C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液， 混勻，常温放置IOmin后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置aiiin后，用枪头将其充分混勻，于37°C 溶解沉淀，5min后加入300 μ L缓冲液，上下颠倒混勻10次；Ε.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加 入200 μ L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200 μ L 70%乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一 次；
H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；I.将离心柱放置在一个新的1. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 μ L洗脱 缓冲液，37°C放置aiiin后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2) PCR 扩增A.在扩增反应管中加入Real time MIX 10 μ L、10 μ mol/L上游引物0. 5 μ L、 1(^11101/1下游引物0.5“1^、1(^11101/18又匕 green 染料 1. 25 μ L、ddH20 (灭菌双蒸水)补足 至25 μ 1，混勻；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2 μ L (约200ng)，混勻；C.在荧光PCR仪中进行PCR反应35_40个循环程序为940C 3min ； (94°C 15s ；55°C 20s ；68°C 20s) X35-40cycles ；加做熔解曲线程序为94"C 15s ；60°C 15s ；95°C 15s。(3)使用扇贝过敏原特异性基因引物对样品DNA进行扩增，扩增产物熔解曲线的 峰值在83士0. 5°C。内参照基因18s熔解曲线的峰值在87士0. 5°C。
权利要求
1.扇贝中过敏原基因tropomyosin的快速检测用的上游引物和下游引物，其特征在于上游引物序列为5，-GGATTCTGCTAAAAACGTTGCA-3’ ； 下游引物序列为5，-CTTACGGGCGGCCTCAT-3，。
全文摘要
本发明属于扇贝过敏原tropomyosin基因快速筛查与检测技术，具体地是用于检测贝类过敏原基因tropomyosin引物组。本发明针对tropomyosin基因，根据其保守区，设计特异性引物。使用该对引物，采用染料法实时荧光PCR扩增技术，可快速、灵敏、特异地检测扇贝中tropomyosin基因，从而筛选产品中是否含扇贝过敏原成分。该引物也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。
文档编号C12Q1/68GK102146463SQ20111003058
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者刘彩霞, 孙敏, 徐彪, 林超, 梁成珠, 高宏伟 申请人:国家海洋局第一海洋研究所, 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心