专利名称：胆汁酸和胆汁酸衍生物的脂肪酸衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物(以下称为“BAFAC”)，还涉及它们在溶解胆汁中的胆固醇胆石、防止胆固醇胆石的发生或复发以及在降低或防止动脉硬化中的应用，本发明还涉及治疗所述疾病的方法。
应注意术语胆汁酸和胆汁盐是相似的并可交换使用。
在大多数工业化国家中，约15％人口中发现有胆石。大多数胆石是胆固醇胆石，即胆固醇是其主要成分。因此，胆固醇胆石代表一主要的健康问题。胆固醇在胆汁中通常是超饱和的，其易于结晶。防止胆汁中胆固醇的结晶将防止胆固醇胆石的形成，或在碎石术、溶解或取石等程序后防止其复发。新分泌的胆汁在胆囊中的停留时间很短，少于12-24小时。在此期间防止胆固醇在胆汁中的结晶可以防止胆石形成。
己证明使用某些胆汁盐如鹅脱氧胆酸或乌索脱氧胆酸，胆固醇胆石可以医学溶解，并可防止其复发。但是，胆汁盐疗法效率很低，且非常耗时，基本上已不使用。因此，需要更有效的疗法。
最近的工作证实磷脂在胆汁中胆固醇溶解方面起主要作用(T.Gilat等，生物化学生物物理杂志1286,(1996),95-115;Y.Ringel等，生物化学生物物理杂志1390,(1998),293-300;J.Hepatology,28,(1998),1008-1014)。磷脂是胆汁中胆固醇溶解脂类聚集物的主要或唯一成分。已证明向胆汁中逐步加入磷脂将明显延长胆汁中胆固醇的成核时间(Z.Halpern等，消化道34(1993)110-115)。
在人或模型胆汁中已证明了某些磷脂分子种类对胆固醇结晶的抑制能力。磷脂之间的区别主要在于存在于立体异构数sn-1和/或sn-2位置的脂肪酸及其头部基团。已经证实通过改变磷脂分子种类而不改变磷脂的绝对或相对量，可以实现成核时间的主要延长和胆固醇晶体生长率的主要降低，以及总胆固醇晶体质量的主要降低。当sn-2脂肪酸是饱和的，当头部基团是丝氨酸而不是胆碱等情形时，胆固醇结晶明显延迟(Y.Ringel等，上述文献)。
也已证明各种磷脂组分本身(非整个磷脂分子)，例如饱和脂肪酸如棕榈酸或硬脂酸；或磷脂酰甘油具有强胆固醇结晶抑制活性。
因此，富集人胆汁中的普通磷脂，或特异的磷脂或其组分，如脂肪酸，可以显著地阻止胆汁中胆固醇结晶并达到希望的结果。
问题是如何体内富集人胆汁中的磷脂或其组分。当将胆汁盐给予人时，它们被非常有效地吸收，被肝吸收并分泌入胆汁。这也适用于合成的胆汁盐类似物。体内存在用于此目的的特异的并非常有效的运输机制。因此，当定期给予乌索脱氧胆酸(其正常情况下以微量存在于人胆汁中)时，其被吸收并分泌入胆汁，最终组成30-50％的胆汁中胆汁酸。但是，如上所述，用于溶解胆固醇胆石的胆汁盐疗法不是令人满意的。磷脂及其组分可被肝脏很好地吸收。但是，磷脂分泌入胆汁被肝脏紧密调控，并且仅有有限量及种类的磷脂与胆汁盐和胆固醇的分泌一起被分泌入胆汁中。目前没有有效的方法来定量或定性调节人胆汁磷脂组成至任何希望的程度。当饮食磷脂达到肝脏时，其可被代谢、分泌入血液中或储存在肝脏中。仅有少量预定种类磷脂分泌入胆汁中，调节的可能性很小。
因此，希望的是发现令人满意的方法来将磷脂或其一种成分运输进胆汁中，以改善胆汁胆固醇的溶解并延迟胆固醇胆石的形成或溶解已有的胆石。
从以色列专利95668和相应的美国专利中已知通式Ⅰ的胆汁酸衍生物W-X-G其中G是胆汁酸基团，W是一种药物的活性化合物部分，X是直接键或所述胆汁酸基团和活性化合物之间的间隔基。在所述专利中，给出了很多取代基，但是其没有特殊指出W代表脂肪酸基团，也没有指出代表饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，即所述专利丝毫没有提及BAFAC。
另外，在所述化合物的目的中，甚至没有暗示任何所述化合物可以用于溶解胆汁胆固醇、防止胆固醇胆石形成、溶解已有胆固醇胆石、降低或防止动脉硬化。
现已发现，直接或经连接键X与脂肪酸(饱和或不饱和脂肪酸)缀合的胆汁酸或胆汁盐(两种可能性均被术语BAFAC覆盖)可作为载体利用非常有效的胆汁酸和胆汁盐的肠－肝循环将脂肪酸运送至胆汁中。也已证明BAFAC从小肠被吸收，被肝脏吸收并分泌入胆汁中。所述BAFAC改善了胆汁中胆固醇的溶解，并显著延迟了其结晶。因此所述BAFAC是防止胆固醇胆石的形成或复发以及溶解胆固醇胆石的有用制剂。
给予BAFAC也对血管树中胆固醇结晶有抑制效应。在生理学情况下，摄入的胆汁酸或胆汁盐被肠道吸收，经门静脉输送至肝脏并经胆汁分泌入肠道。因此，它们在肠—肝循环中再循环，仅有很少量进入系统循环(血管树)。BAFAC的作用很象脂类，其在肠吸收后经淋巴运输至系统循环。已表明BAFAC经淋巴和经门静脉运输。通过这两个途径，它们被肝吸收并分泌入胆汁中。在每个肠－肝循环中，它们分泌入肠道中，并在肝脏吸收之前再次经淋巴被部分重吸收并再循环至血管树中。由于每天有10-12个肠－肝循环，净效应是BAFAC在血管树中再循环。
每天以分开的剂量口服给予BAFAC将增强此效应。BAFAC对胆固醇结晶的抑制效应已被证实。因此，其在降低和/或防止血管树中胆固醇结晶，即动脉硬化中也有价值。
因此，本发明涉及通式Ⅱ的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物
W-X-G其中G和X具有式Ⅰ的相同含义，W代表一或两个脂肪酸基团。
可提及的合适的胆汁酸例如为胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸及其衍生物和类似物等。所用胆汁酸可以是未缀合，或者，如在胆汁中一样与甘氨酸、牛磺酸或合适的氨基酸缀合。这些可能性均在胆汁酸的定义内，因此也在本发明范围内。根据所用的胆汁酸，与脂肪酸基团的缀合大多数在环的3位进行。还可以在不同的位置如第6、7、12和24位进行与脂肪酸基团的缀合。当胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸缀合时，与脂肪酸基团的缀合不能在第24位进行。脂肪酸基团和胆汁酸之间的缀合可以呈α或β构型。
间隔基X有利的是-NH-基团或-O-基团或是一直接键。
优选的脂肪酸是饱和脂肪酸，其合适地具有6-26个碳原子，有利的是具有14-22个碳原子的饱和脂肪酸。优选饱和脂肪酸是山萮酸(behenylic acid)、花生酸(arachidylic acid)、硬脂酸、棕榈酸和肉豆蔻酸(myristylic acid)。
当W代表两个脂肪酸时，它们合适地在第3和7位缀合。
本发明还包括能溶解胆汁中的胆固醇胆石并防止其形成以及能防止和/或降低动脉硬化的药物组合物，包括作为活性成分的通式Ⅱ的胆汁酸脂肪酸衍生物。
这种组合物可以是片剂、胶囊剂、溶液、乳液等。
所述组合物可包括额外的化合物如载体、溶剂、乳化剂、吸收促进剂、胆固醇合成或分泌入胆汁的抑制剂等。所述组合物应有利地包括0.1-1.5g活性成分。
合适地，组合物优选每日在睡前服用一次。
本发明还包括通式Ⅱ的胆汁酸脂肪酸衍生物或包含其的药物组合物在溶解胆汁中的胆固醇胆石和防止其形成中的应用。
本发明还包括通式Ⅱ的胆汁酸脂肪酸衍生物或包含其的药物组合物在防止和/或降低动脉硬化中的应用。
本发明还包括溶解胆汁中的胆固醇胆石和防止其形成的方法，包括给予通式Ⅱ的胆汁酸脂肪酸衍生物或包含其的药物组合物。
本发明还包括防止和/或降低动脉硬化的方法，包括给予通式Ⅱ的胆汁酸脂肪酸衍生物或包含其的药物组合物。
本发明将参照实施例和附图举例描述，所述实施例和附图不是限制性的。
在所述附图中
图1显示了晶体观察时间，模型胆汁溶液，棕榈酰－胆酸酯的作用(PalC)。
A-对照溶液，B,C-用等摩尔量的PalC分别代替10％和20％的牛磺胆酸钠(NaTC),D-用PalC代替20％磷脂，E,F-向溶液中分别添加10mM和20mM PalC。
图2显示了胆固醇晶体质量，模型胆汁溶液，PalC的作用。A,B,C,D,E和F的含义见图1。
图3示出晶体生长速率，模型胆汁溶液，PalC的作用。A,B,C,D,E和F的含义见图1。
图4示出薄层层析。A-在纯溶液(左)和仓鼠胆汁中的PalC标准，B-对照动物(左)的仓鼠胆汁和PalC饲养仓鼠的胆汁。
图5A示出胆酸(在C-3)与山萮酸(C-22)、花生酸(C-20)、硬脂酸(C-18)、棕榈酸(C-16)、肉豆蔻酸(C-14)、月桂酸(C-12)和己酸(C-6)缀合的步骤。
图5B示出合成甘氨酸缀合的硬脂酰胆酸酯的步骤。
图5C示出油酰胆酸酯的缀合。
图5D示出胆酸与两个分子的硬脂酸在胆汁酸环的C-3和C-7位的缀合。
图6示出胆固醇晶体质量，模型胆汁溶液，与胆酸(在C-3)缀合的肉豆蔻酸(C-14)、棕榈酸(C-16)、硬脂酸(C-18)和花生酸(C-20)的作用。测试化合物代替对照溶液中的20％(摩尔)NaTC。
图7示出成核时间，模型胆汁溶液，图6中所用的化合物的作用。
图8示出保温22天后的富集人胆汁的胆固醇晶体质量，与对照胆汁和加入5mM胆酸的胆汁相比，向胆汁中加入5mM棕榈酰(C-16)胆酸酯、硬脂酰(C-18)胆酸酯和花生酰(C-20)胆酸酯的作用。
图9示出成核时间，模型胆汁，与模型胆汁和用胆酸代替20％NaTC相比，用等摩尔量的己酰(C-6)胆酸酯、月桂酰(C-12)胆酸酯、硬脂酰(C-18)胆酸酯、花生酰(C-20)胆酸酯和二硬脂酰乌索脱氧胆酸酯代替20％(摩尔)NaTC的作用。
图10示出在摄入30mg硬脂酰(C-18)胆酸酯1、2和3小时后仓鼠中硬脂酰(C-18)胆酸酯的水平。示出在心脏血液、门脉血液和胆囊胆汁中的浓度。
所有模型制备3份并在实验期间保持在相同条件下。
模型胆汁的组成为
胆固醇15mM,EYL 30mM,Na-TC 150mM。
用1％EYL制备对照溶液。其他所研究的模型胆汁溶液通过加入合成胆汁酸缀合物(PalC)或用其取代(10-20％)EYL或Na-TC而制备。
B．天然人胆囊胆汁天然人胆囊胆汁得自胆囊切除术的胆固醇胆石患者。在用于实验前，来自几个患者的合并胆汁通过与干胆固醇保温或与浓模型胆汁混合而富集胆固醇以促进结晶。2、评价胆固醇晶体形成和生长2.1晶体观察时间(COT)分析如Holan等，Gastroenterology 77,(1979)611-617所述确定COT(也称为“成核时间”)。通过偏光显微镜术每天检查来自每个模型胆汁的等份液体。COT定义为在100倍放大倍数下每个显微镜视野检测到至少3个胆固醇单水合物晶体的起始时间。2.2晶体生长速率(CGR)分析用微板阅读器(SPECTRA-STL,奥地利)经分光光度法监控晶体生长(G.J.Somjen等，脂类研究杂志38,(1977)1048-1052)。等份(50微升)脂类溶液与等体积牛磺脱氧胆酸钠(200mM)在微板孔中混合并剧烈振荡。置于室温60分钟后，再次振荡微板并测定每孔中于405nm的吸收值。每个模型制备3份并取双份进行测量。
用IBM兼容个人计算机收集并分析数据，计算三份制备物平均的光密度(OD)。绘制反映每个溶液的平均OD变化的曲线。用适于至少3次测量的线性回归确定曲线的最陡区域的斜度并定义为CGR。计算每一模型在第0天和第14天之间的CGR和OD差异。2.3晶体质量的测定在实验的最后一天(第14天)，如前所述(G.J.Somjen,文献见上)在每一样品上进行胆固醇的化学分析。从微孔收集样品，在Airfuge(Beckman)中于70000rpm离心5分钟。在总样品上(在离心前)以及在上清溶液上进行分别测定。在沉淀物中的胆固醇的量通过从总样品中的量减去上清溶液中的量来计算。用偏光显微镜证实沉淀的结晶性质。晶体质量也经分光光度法测量为在保温第0天和第14天之间的OD差。3、数据分析每种脂类分散液制备3份，并测量所有样品的双份等份样品。计算OD的平均值和标准差。如上所述从晶体生长曲线的线性回归分析计算晶体生长速率。通过一种方式方差分析进行不同模型溶液之间的比较。
A．模型胆汁a．在20％牛磺胆酸钠被测试化合物(PalC)替换的模型胆汁溶液(组成牛磺胆酸钠150mM，胆固醇15mM，鸡蛋卵磷脂30mM，总脂类10.3gm/dl)中，成核时间延长了167％；胆固醇晶体生长速率降低了67％，在保温14天后总胆固醇晶体质量降低了53％。
b．当测试化合物添加到完全模型胆汁溶液(胆汁盐浓度20％)中时，作用如下成核时间延长了200％；胆固醇晶体生长速率降低了59％，在保温14天后总胆固醇晶体质量降低了51％。
B．天然人胆汁当测试化合物(浓度为10mM)与来自患有胆固醇胆石的患者的合并天然人胆囊胆汁保温时，结果如下在胆固醇晶体已通过先期超离心2小时而除去的天然人胆汁中，从保温第2天(37℃)观察到新胆固醇晶体。晶体数持续增加，在第14天达到峰值每显微镜视野超过150个晶体。在与10mM测试化合物保温的相同胆汁中，在保温的21天期间没有见到胆固醇晶体。
实施例Ⅻ和ⅩⅢ的实验结果总结在图1-3中(在图1-3中，“A”代表没有PalC的对照模型胆汁)图1示出晶体观察时间=成核时间。结果以三份平均值给出。在C中晶体观察时间延长了167％，在F中延长了200％。
图2示出胆固醇晶体质量。在第14天，B中胆固醇质量降低17％，C中胆固醇质量降低53％，F中胆固醇质量降低51％。
图3示出晶体生长速率。在B中晶体生长速率降低70％，在F中降低59％。
这些实验数据证实，胆汁盐和脂肪酸的缀合物防止或延迟了模型胆汁和人胆汁中胆固醇的结晶。
用一特殊针管经口给予测试仓鼠溶于1毫升盐水中的10-15mgPalC/动物/天。对照动物给予等体积的盐水。在处理过程中两组动物行为均正常。在第2天，将盐水中的PalC给予各个动物4小时后，通过过量氯仿蒸汽处死动物。打开腹腔，系上胆管，切下胆囊并在盐水中洗两次。然后将其置于锥形塑料管上部并切开。胆汁收集在管底部。
检查了2个系列的动物Ⅰ．5个对照动物和5个测试动物，每个接受10毫克PalC/天；Ⅱ．3个对照动物和9个测试动物，每个接受15毫克PalC/天。
B．生化程序在2000rpm离心(Eppendorf离心机)胆汁样品5分钟，弃去碎片，根据Folch程序(氯仿∶甲醇2∶1)提取上清。用水分离后，在二氧化硅凝胶60薄层板(Merck)经薄层层析分析脂相。洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇∶乙酸(100∶5∶l,v∶v∶v)。将样品与真标准比较，该标准在用I2蒸汽展开后比移值(Rf)约0.2。
C．结果在系列Ⅰ，获得了140微升对照和100微升测试胆汁。在系列Ⅱ，获得了95微升对照和240微升测试胆汁。每个系列的对照胆汁和测试胆汁分别合并。提取的脂类的TLC分析(如图4所示)证实在测试动物的胆汁中存在PalC。这表明摄入的PalC被吸收并分泌至胆汁中。
图4示出实施例ⅩⅣ中进行的实验的TLC对比A示出PalC标准在纯溶液(左)中，和在胆汁(右)中；B示出仓鼠胆汁来自对照仓鼠(左)；和来自用PalC喂养的仓鼠(右)。在这一栏中可见PalC带。
图5A、5B、5C和5D分别示出实施例Ⅰ-Ⅹ所述的化合物的化学式。
图6示出在保温对照和测试溶液14天后这些缀合物对胆固醇晶体质量的作用。与对照溶液相比，所有上述缀合物均降低了最终的晶体质量。C18缀合物使之降低至对照的14％；C20缀合物使之降低至对照的38％。
在一不同实验中测试的C22缀合物显示与C20相似的活性。
图7示出与对照溶液相比的各种测试溶液的成核时间(晶体观察时间)。用特异的缀合物C16，C18和C20缀合物替换20％的胆汁盐(NaTC)导致成核时间延长，C14不延长成核时间。C20缀合物延长成核时间超过360％。
所有样品在37℃以与实施例Ⅺ所述相同方式保温，经定期光学显微镜观察确定成核时间。结果示于图9。结果证实1)与对照模型胆汁和等摩尔量的胆酸相比，所有测试的缀合物(BAFAC)均延迟了胆固醇结晶。2)具有较长脂肪酸链的BAFAC比具有较短脂肪酸链的BAFAC更有效。3)具有2个脂肪酸的缀合物(二硬脂酰乌索脱氧胆酸酯)特别有效。
结果示于图10。
在组A中1、2和3小时后的心脏血液水平分别是99,7,2μM,而门脉血液水平分别是68,99和133μM。在2和3小时胆囊胆汁中的水平分别是540和270μM。组B中的结果类似。
数据显示1)C-18(硬脂酰)胆酸酯被从肠吸收。2)其被运输至系统循环(经淋巴)和门静脉。3)其被积极地分泌进胆汁中并在其中浓缩。实施例ⅩⅨ以实施例Ⅺ所述相同方式制备模型胆汁溶液。其具有相同的脂类组成并用作对照。
在测试溶液中以20mM浓度加入胆酸，硬脂酰(C-18∶0)胆酸酯或油酰(C-18∶1)胆酸酯。
所有样品均在37℃保温100小时。在100小时和0小时之间的光密度差(如实施例Ⅺ所述)用于测量在100小时时的总晶体质量。与对照溶液相比(100％)，具有胆酸的溶液的晶体质量为114％，具有硬脂酰胆酸酯的溶液的晶体质量为62％，具有油酰胆酸酯的溶液的晶体质量为55％。
这些结果证实与对照胆汁和具有等摩尔量的胆酸相比，具有饱和和不饱和(油)酸的BAFAC均降低了胆固醇结晶。
权利要求
1.通式Ⅱ的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物W-X-G其中G为胆汁酸或胆汁盐基团，W代表一或两个饱和脂肪酸基团，X为直接键或所述胆汁酸或胆汁盐与所述脂肪酸之间的间隔基。
2.权利要求1的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述胆汁酸选自胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸及其衍生物和类似物。
3.权利要求1或2的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述胆汁酸与甘氨酸、牛磺酸或合适的氨基酸缀合。
4.权利要求1-3任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中与脂肪酸基团的缀合在胆汁酸环的第3位进行。
5.权利要求1-3任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中与脂肪酸基团的缀合在胆汁酸环的选自第6、7、12和24位的一个位置上进行。
6.权利要求1-5任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中脂肪酸基团与胆汁酸的缀合选自α构型或β构型。
7.权利要求1-6任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述间隔基选自-NH-，-O-或直接键。
8.权利要求1-8任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述脂肪酸是具有6-26个碳原子的饱和脂肪酸。
9.权利要求8的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述饱和脂肪酸具有14-22个碳原子。
10.权利要求8或9的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中所述饱和脂肪酸选自山萮酸、花生酸、硬脂酸、棕榈酸和肉豆蔻酸。
11.3β-山萮酰氨基-7α,12α-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。
12.3β-花生酰氨基-7α,12α-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。
13.3β-硬脂酰氨基-7α,12α-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。
14.3β-棕榈酰氨基-7α,12α-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。
15.3β-肉豆蔻酰氨基-7α,12α-二羟基-5-胆甾烷-24-酸。
16.N-(羧甲基)-3β-硬脂酰氨基-7α,12α-二羟基-5β-胆甾烷-24-酰胺。
17.权利要求1-4和6-10任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物，其中W代表在胆汁酸环的第3和7位缀合的两个脂肪酸。
18.能溶解胆汁中胆固醇胆石及防止其形成并能防止和/或降低动脉硬化的药物组合物，包括作为活性成分的权利要求1-17任一项的通式Ⅱ的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸衍生物。
19.权利要求18的药物组合物，其形式选自片剂、胶囊剂、溶液和乳液。
20.权利要求18或19的药物组合物，还包括选自载体、溶剂、乳化剂、吸收促进剂和胆固醇合成或分泌入胆汁的抑制剂的附加化合物。
21.权利要求18-20任一项的药物组合物，包括0.1-1.5克活性成分。
22.权利要求1-17任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物或权利要求18-21任一项的药物组合物在溶解胆汁中的胆固醇胆石和防止其形成中的应用。
23.权利要求1-17任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物或权利要求18-21任一项的药物组合物在防止和/或降低动脉硬化中的应用。
24.溶解胆汁中的胆固醇胆石和防止其形成的方法，包括给予权利要求1-17任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物或权利要求18-21任一项的药物组合物。
25.防止和/或降低动脉硬化的方法，包括给予权利要求1-17任一项的胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物或权利要求18-21任一项的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及胆汁酸或胆汁盐脂肪酸缀合物(以下称为“BAFAC”),还涉及它们在溶解胆汁中的胆固醇胆石、防止胆固醇胆石的发生或复发以及在降低或防止动脉硬化中的应用,本发明还涉及治疗所述疾病的方法。所述缀合物的通式为W－X－G,其中G为胆汁酸或胆汁盐基团,W代表一或两个饱和脂肪酸基团,X为直接键或所述胆汁酸或胆汁盐与所述脂肪酸之间的间隔基。缀合有利的是在胆汁酸或胆汁盐环的选自第3、6、7、12和24位的一个位置上进行。脂肪酸优选地是具有(14—22)个碳原子的饱和脂肪酸。
文档编号A61K31/575GK1296492SQ99804903
公开日2001年5月23日 申请日期1999年3月25日 优先权日1998年4月8日
发明者图维亚·吉拉特 申请人:盖尔梅德国际有限公司