导。能够测定具 体疾病等级的临床方法可用于确定应答是否被诱导。例如，可检测受试者是否症状缓解，例 如腹泻、腹痛、腹部绞痛、腹胀缓解以及耐受麸质挑战的能力。可选择地或另外的，可使用血 清标记物、成像技术例如超声、X-射线以及内窥镜检查方法。
[0110] 所述组合物还可与其他治疗方式相结合施用。所述治疗方式将依据具体病症而不 同，但是可包括例如饮食疗法例如不含麸质的饮食。在一些实施方案中，饮食疗法可包括引 入小麦制品，其来自已通过选择育种或重组技术加工可表达毒性T细胞表位数量减少的麦 醇溶蛋白形式的小麦株。在一些实施方案中，饮食疗法可包括施用益生元，即可刺激一种或 多种对宿主健康有利的肠道微生物生长或活性的试剂。示例性益生元包括反式低聚半乳 糖、菊粉、低聚果糖和乳果糖。
[0111] 其他治疗方式包括施用治疗试剂。治疗试剂可以是酶，例如可通过靶向对体内天 然存在的蛋白酶具有抗性并且含有高免疫原性肽的富含脯氨酸的肽来降解麸质的内肽酶 (也称作麸质酶（glutenase))。示例性内肽酶包括脯氨酰内肽酶和ALV003,来自发芽的大 麦种子的半胱氨酸内肽酶和来自荚膜鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas capsulate)的脯氨酰 内肽酶的组合。
[0112] 其他治疗试剂包括乳糜泻典型的肠通透性增强的抑制剂例如AT-1001 (拉雷佐肽 (Iarazotide))，一种八肽的细胞旁通透性抑制剂，其可抑制麦醇溶蛋白诱导的肠上皮细胞 的细胞骨架重排、紧密连接分解以及峰值F-肌动蛋白增加。其他治疗试剂包括tTG抑制剂、 免疫系统调节剂以及使用肽为基础的疫苗（NevvaU)的脱敏疗法。
[0113] 两种或更多种治疗剂的并行施用不需要在相同时间或通过相同途径施用，只要在 制剂发挥它们的疗效期间存在时间的重叠。还涉及同时或相继施用，其是在不同天或不同 周施用。
[0114] Mm
[0115] 本发明的组合物也可以组装在试剂盒中，和使用说明书一起。例如，所述试剂盒可 包含测定量的含有一种或多种由副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物制品组合物。所述使 用说明书可通过任意适合的媒介传达。比如，可将其印刷在纸上插入一种或多种语言或者 可听地或可视地（例如在一个光盘中）提供。包装材料可包括例如瓶、包、箱的包装材料。 在一些实施方案中，所述试剂盒可包含测定量的含有生理上可接受载体中的副干酪乳杆菌 CBA L74的组合物，以及任意形式或上述形式的包装材料和使用说明书。在一些实施方案 中，所述试剂盒可包含测定量的含有副干酪乳杆菌CBA L74的一种或多种代谢产物的组合 物。在一些实施方案中，所述组合物不包含副干酪乳杆菌CBA L74细胞，即代谢产物可与副 干酪乳杆菌CBA L74细胞部分地或充分地分离。所述试剂盒的组分可适合于直接使用。但 是，本发明包括含有可能要在使用前稀释的浓缩成分和/或材料的试剂盒。
[0116] 实施例
[0117] 实施例1:材料和方法
[0118] α -麦醇溶蛋白 P31_P43(SEQ ID NO. :1)和 P57-68(SEQ ID NO. :2)是体外 合成并结合到由意大利那不勒斯Inbios制造的荧光染料丽丝胺。色谱分析表明所述肽是 99%纯度。
[0119] Cac〇2肽讲入测定:将Cac〇2细胞（一种人上皮结肠癌细胞系）的培养物与标记 的肽共孵育15分钟。通过反复洗涤除去所述标记的肽并在共焦显微镜下检查细胞。形态 学分析显示：孵育15分钟后，标记的肽已进入细胞并定位于内吞囊泡形成小色斑。使用评 估多个显微视野荧光强度的专用软件包进行定量分析。
[0120] Caco2细朐培养:CaCo-2细胞生长在达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM) (GIBC0， 圣朱利亚诺米兰（San Giuliano Milanese)，意大利）、10%胎牛血清（FBS) (GIBC0,圣朱利 亚诺米兰，意大利）和ImM谷氨酰胺（GIBC0,圣朱利亚诺米兰，意大利）中，在37°C、5%的 CO2浓度的培养箱中。
[0121] 副干酪乳杆菌CBA L74培养：副干酪乳杆菌CBA L74 (国际保藏登记号LMG P-24778)的分离如WO 2012/177556(其以引用方式全文纳入本文）中所述。将细胞在补充 胎牛血清和谷氨酰胺的50ml DMEM中，在37°C以每分钟160转振荡培养过夜。细菌浓度在 Beckman DU-7分光光度计中600nm波长下通过分光光度法测定。光密度（OD)读数用于按 如下公式计算细菌浓度：0D2 = I. 5X109CFU/ml。用于实验的不同的细菌浓度通过将细菌 培养物在无抗生素的新鲜培养基中稀释获得。对于单独使用上清液的实验，将细菌培养物 在室温以3000rpm离心10分钟。将上清液回收并通过0. 2微米孔径的过滤器过滤。
[0122] 耒醇溶蛋白肽和EGF-Alexa-488:合成妝(Inbios，95%纯度，MALDI-toff测定如 预期）是通过Ultrasart-D20(赛多利斯，哥廷根，德国）过滤得到。P31-43肽具有氨基酸 序列：LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID N0:1)。P57-68 肽具有氨基酸序列：QLQPFPQPQLPY(SEQ ID NO :1)。将肽与丽丝胺偶联，通过HeNel激光（543nm)用610nm长波段发射激发红色荧光。 EGF-Alexa-488来自Molecular Probes公司，圣朱利亚诺米兰，意大利。
[0123] 荧光测定:我们测试了副干酪乳杆菌CBA L74对麦醇溶蛋白肽或EGF-Alexa进入 Caco-2细胞的影响。将Cac〇2细胞于无菌玻璃盖玻片上生长，转移到24孔板中，并使用不 同浓度的副干酪乳杆菌CBA L74处理，其浓度范围从IO4到10 8cfu/ml。对于使用不含细胞 的上清的实验，Cac〇2细胞是使用从浓度达到10 8cfu/ml的副干酪乳杆菌CBA L74培养物收 集的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的。使用新鲜的或者加热后的上清。在一些实验中， 将上清在80°C加热15分钟。在另外的实验中，将上清煮沸5分钟。Cac 〇2细胞使用不同的 细菌制剂在5% CO2气氛中37°C处理30分钟，然后与麦醇溶蛋白肽P31-43-丽丝胺（Iiss) 或 P57-68liss或者 EGF-Alexa-488 共孵育。肽浓度如下：P31-43 liss和 P57-68 liss为 20 μ g/ ml ;未标记的肽使用50 μ g/ml ;EGF-Alexa-488为10 μ g/ml。加入所述肽后，将细胞在5% CO2气氛中37°C孵育30分钟。然后使用PBS I X (Gibco)洗涤3次去除培养基。将盖玻片 使用多聚甲醛3% (Sigma-Aldrich)室温下短暂固定（5分钟），然后包埋并使用共聚焦显 微镜（LSM 510Zeiss)观察。生成图像并考虑用AISZeiss软件分析图像以评价显微视野中 的荧光强度。所有展示的显微照片的放大倍数是相同的（63X物镜）。内吞囊泡中标记的 肽和EGF-Alexa呈现为红色（肽）或绿色（EGF)小点。
[0124] 统计分析:通过GraphPad Prism进行统计分析并产生图表。计算平均值和标准 差。通过学生t检验进行评价。p〈0. 05的结果认为是显著的。
[0125] 实施例2:活的副干酪乳杆菌CBA L74对α -麦醇溶蛋白肽进入的影响
[0126] 活的副干酪乳杆菌CBA L74可减少Ρ31-43和Ρ57-68进入CaC〇2细胞。共聚焦荧 光图像见图1所示。对照细胞（左图）在不存在副干酪乳杆菌CBA L74条件下与丽丝胺标 记的P31-43共孵育，显示出与含P31-43的内吞小泡（白色箭头）对应的清晰的荧光模式。 相反地，在存在副干酪乳杆菌CBA L74条件下与丽丝胺标记的P31-43共孵育的细胞中荧光 减少（右图）。
[0127] 定量分析显示，副干酪乳杆菌CBA L74对P31-43进入的影响是剂量依赖的，并且 是统计学显著的。图2示出了对平行双样的5次独立实验的结果。计算每个样本中30个 随机视野的荧光强度。如图2所示，使用10 4、IO6和10 8副干酪乳杆菌CBA L74处理CaC〇2 细胞，得到统计学显著的剂量依赖的P31-43进入的降低。
[0128] P57-68肽检测到类似的效应。除使用P57-68代替P31-43之外，图3中实验与图2 中实验完全相同地实施。如图3所示，使用IO4UO6和108副干酪乳杆菌CBA L74处理CaCo2 细胞，得到统计学显著的剂量依赖的P57-68进入的降低。
[0129] 实施例3:副干酪乳杆菌CBA L74分离的DNA对α -麦醇溶蛋白肽进入的影响
[0130] 通过标准方法提取并纯化副干酪乳杆菌CBA L74的DNA。如图4所示，存在副干酪 乳杆菌CBA L74DNA的量等价于IO8个细胞时用Ρ31-43处理CaCo2细胞未阻止肽进入。
[0131] 实施例4:副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对α -麦醇溶蛋白肽进入的影响
[0132] 通过离心收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，并将所得培养物上清过滤以除 去活的细菌和细胞碎片。存在Ρ31-43肽时，将等价于IO8个细胞的上清施用于CaC 〇2细胞。 对照CaC〇2细胞用IO8个活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理。图5示出了对平行双样的 4次独立实验的结果。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。
[0133] 如图5a中柱状图所示，用活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理CaC〇2细胞也导致 统计学上显著降低的P31-43肽进入。用副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清处理CaC〇2细 胞导致类似量度的降低。图5b示出了该实验的共聚焦图像。所示图像清晰地显示，副干酪 乳杆菌CBA L74培养物上清可减少P31-43肽进入。
[0134] 使用P57-68代替P31-43的类似实验的结果见图6。使用活的副干酪乳杆菌CBA L74细胞处理CaCo2细胞也导致统计学上显著降低的P57-68肽进入（图6a)。用副干酪乳 杆菌CBA L74培养物上清处理CaC〇2细胞导致类似量度的降低。图6b示出了该实验的共 聚焦图像。所示图像清晰地显示，副干酪乳杆菌CBAL74培养物上清可减少P57-68肽进入。
[0135] 实施例5:热处理的副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对α -麦醇溶蛋白肽进入 的影响
[0136] 依据实施例4的方法收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，然后在37°C或80°C 加热30分钟。然后将加热的上清冷却，并于存在P31-43肽条件下应用于Cac〇2细胞。图7 示出了未用上清处理的对照细胞平行双样的5次独立实验的结果、用未加热（"37°C"）的 上清处理的对照细胞平行双样的5次独立实验的结果和用加热（"80°C"）的上清处理的 细胞平行双样的2次独立实验的结果。计算每个样本中30个随机视野的荧光强度。如图 7所示，加热到80°C的上清保留了未加热上清阻止P31-43肽进入Cac 〇2细胞的能力。该实 验的共聚焦图像见图7中右图所示。所示图像清晰地显示出，经加热处理的副干酪乳杆菌 CBA L74培养物上清与未加热处理的副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清减少P31-43肽进入 的程度相同。总之，所述数据显示副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清的效应并非来自于酶 活性。
[0137] 实施例6:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和燕麦对α -麦醇溶蛋白肽进入的影 响
[0138] 制备了副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻。发酵的稻、稻发酵的上清或者加热处理 的稻发酵的上清于存在Ρ31-43肽的条件下应用至CaC〇2细胞，并依据实施例2的方法检测 肽进入。如图8所示，发酵的稻、稻发酵的上清或者加热处理的稻发酵的上清所有三个处理 相对于未处理的CaC 〇2细胞都减少了肽进入。如图9所示，存在发酵的稻的条件下，P31-43 肽进入的减少是统计学显著的（右侧柱）。存下发酵的燕麦的条件下检测到类似的统计学 显著的效应（左侧柱）。
[0139] 实施例7:副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和麦对葡聚糖-得克萨斯红进入Cac〇2 细胞的影响
[0140] 制备副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻和发酵的燕麦。如图10所示，将Cac〇2细胞 与副干酪乳杆菌CBA L74发酵的稻或副干酪乳杆菌CBA L74发酵的燕麦共孵育，导致与分 别使用未发酵的稻和燕麦处理的细胞相比统计学显著下降的葡聚糖-得克萨斯红细胞进 入。由于葡聚糖通常是由细胞通过巨胞饮摄取的，所以这些数据表明副干酪乳杆菌CBA L74 的代谢产物可阻止巨胞饮途径。
[0141] 实施例8:副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清对表皮生长因子（EGF)进入Cac〇2 细胞的影响
[0142] 依据实施例4的方法收集副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清，并于存在 Alexa Flu〇r?-C〇njugated EGF(Invitrogen)的条件下将其应用于 Caco2 细胞。如图 11 的柱状图所示，使用副干酪乳杆菌CBA L74培养物上清处理Cac〇2细胞，导致统计学显著下 降的EGF细胞进入。该实验的共聚焦图像见图12。由于EGF摄取需要特异性受体的结合例 如结合到EGF受体，所以这些数据表明副干酪乳杆菌CBA L74的代谢产物可阻止网格蛋白 介导的内吞途径。
[0143] 实施例9:副干酪乳杆菌CBA L74对P31-43和P57-68进入Caco2细胞的浓度依 赖性影响
[0144] 将Cac〇2细胞使用浓度逐步增加的副干酪乳杆菌CBA L74处理，然后与麦醇溶蛋 白肽P31-43liss或P57-68 liss共孵育，如实施例1所示。随着细胞内分布，曝光30分钟后含 有标记的P31-43或标记的P57-68的胞吞囊泡显示为红色的点。副干酪乳杆菌CBA L74处 理导致剂量依赖地减少P31-43和P57-68进入Caco-2细胞。如图13b、13c和13d所示，对 于P31-43,使用10 4、IO6和10 8cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的细胞相对于未处理的细 胞中分别出现荧光强度下降（图13a)。白色箭头指示含P31-43liss的囊泡。这些结果定量 地显示于图14中。