、阳离子型淀粉、聚乙烯基哌啶和聚硫 代二乙基氨基甲基乙烯。
[0164] 可以任何合适的方式配制组合物。小细胞组合物可均一地（均质地）或不均一地 (异质地）分散于载体中。合适的制剂包括干燥和液体制剂。干燥制剂包括冷冻干燥的和 冻干的粉末，其特别适合于气溶胶递送至鼻窦或肺，或在给药前的长期储存然后在合适的 稀释剂中重构。其他优选的干燥制剂包括其中本文公开的组合物被压缩成适合经口给药或 化合至缓释制剂中的片剂或丸剂形式的那些。当期望通过经口给药将组合物递送至肠上皮 时，优选以肠溶衣包封所述制剂，以保护所述制剂并防止过早释放其中包含的小细胞组合 物。如本领域技术人员所理解的，可将本文公开的组合物置于任何合适的剂型中。丸剂和 片剂代表了这些剂型中的一些形式。也可将组合物包封在任何合适的胶囊或其他包封材料 中，例如通过压缩、浸渍、锅包衣、喷雾干燥等。合适的胶囊包括从明胶和淀粉制备的那些。 进而，可用例如一种或多种另外的材料和肠溶衣（如果需要）包被这样的胶囊。脂质制剂 包括水性制剂、凝胶和乳剂。
[0165] -些实施方案提供了包含生物粘附性的，优选粘膜粘附性的包衣的组合物。"生物 粘附性的包衣"为这样的包衣，相比没有包衣存在时发生的粘附，其允许物质（如小细胞组 合物）更好地粘附至生物表面或物质。"粘膜附着包衣"优选为，相比没有包衣存在时发生 的粘附，允许物质如组合物更好地粘附粘膜的生物粘附性包衣。例如，可用粘膜附着剂包被 小细胞。然后可将经包被的颗粒组装为适合递送至生物体的剂型。优选地，并且取决于待 靶向的细胞表面运输部分表达的位置，然后将剂量形式包覆上另一包衣以保护所述制剂直 到其到达期望的位置，其中所述粘膜附着剂使得在所述组合物与靶细胞表面运输部分相互 作用的同时所述制剂能够被保留。
[0166] 本文公开的组合物可被给予至任何生物体，例如动物，优选哺乳动物、鸟、鱼、昆虫 或蛛形纲动物。优选的哺乳动物包括牛、犬、马、猫、绵羊和猪科动物以及非人的灵长类。人 是特别优选的。本领域存在给予或递送化合物的多种技术，包括但不限于经口、经直肠（例 如，灌肠或栓剂）气溶胶（例如，用于经鼻或经肺递送）、肠胃外和局部给药。优选地，递送 足够量的生物活性肽以实现所需的效应。待递送的组合物的具体量取决于许多因素，包括 待实现的效应、组合物递送至的生物体类型、递送途径、给药方案和生物体的年龄、健康状 况和性别。因此，掺入至给定制剂中的组合物具体剂量留给技术人员自由裁定。
[0167] 本领域技术人员应理解，当作为试剂给予本文共开的组合物以实现所需的特定生 物结果（其可包含治疗、诊断或保护效应（包括疫苗））时，可能可以将小细胞组合物与合 适的药物载体组合。选择药物载体和制备小细胞作为治疗或保护剂，取决于预期的应用和 给药模式。给予治疗剂的合适的制剂和方法包括用于经口、经肺、经鼻、经颊、经眼、经皮、经 直肠、静脉内或经阴道递送的那些。
[0168] 根据采用的递送方式，依赖于内容物的功能实体可以各种药学上可接受的形式递 送。例如，依赖于内容物的功能实体可掺入丸剂、胶囊、片剂、栓剂、气溶胶、液滴或喷雾剂中 以固体、溶液、乳剂、分散剂等形式递送。丸剂、片剂、栓剂、气溶胶、粉剂、液滴和喷雾剂可具 有复杂的多层结构，并且具有大范围的尺寸。气溶胶、粉剂、液滴和喷雾剂范围可为小（1微 米）至大（200微米）的尺寸。
[0169] 本文公开的药物组合物可以固体、冻干粉、溶液、乳剂、分散剂等形式使用，其中产 生的组合物包含本文公开的一种或多种化合物作为活性成分，并且混合有适合肠内或肠胃 外应用的有机或无机载体或赋形剂。可将活性成分与例如通常无毒、药学上可接受的载体 化合，用于片剂、小球、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬浮剂和任何其他适合使用的形式。可以使 用的载体包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉 米淀粉、角蛋白、硅胶、马铃薯淀粉、尿素、中等链长三酸甘油酯、右旋糖酐和其他适合用于 制备制剂的固体、半固体或液体形式的载体。另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂和 香料。稳定干燥剂的实例包括丙酮糖（triulose)，优选浓度为0. 1%或更大（参见，例如美 国专利第5, 314, 695号）。活性化合物以足以对疾病过程或状况产生所需的效应的量包含 在药物组合物中。
[0170] 6.治疗话应证
[0171] 本公开涉及小细胞介导的针对包括但不限于实体瘤、转移瘤和液体瘤的癌症的免 疫治疗。实体和转移瘤包括上皮、成纤维细胞、肌肉和骨来源的那些，并且包括但不限于：乳 腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门 癌、直肠癌、结肠癌、食管癌、膀胱癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴茎癌和肾癌。其他 可以本文公开的免疫调节性小细胞治疗的实体癌症类型包括但不限于：腺癌、肉瘤、纤维肉 瘤和眼癌、脑癌和骨癌。可通过本文公开的免疫调节性小细胞治疗的液体瘤包括但不限于： 非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、 急性髓性白血病、慢性髓性白血病以及其他白血病。
[0172] VAX-P、VAX-IP和VAX-Iro小细胞的体内免疫调节活性示出在图3-6中，并且在实 施例2-4中有进一步描述。免疫调节效应有助于包含产气荚膜梭菌溶素 O的小细胞制剂如 VAX-P、VAX-IP和VAX-Iro小细胞的抗肿瘤特性的第一个体内证据是出人意料的。在进行 VAX-IP的发展和体内定征的对照实验中，出人意料地发现，靶向部分侵袭素的去除对体内 功效具有很少影响或没有影响（参见图3)。然而，产气荚膜梭菌溶素 O组分的去除对小细 胞阻止肿瘤生长的能力具有显著的影响。还出人意料地发现，小细胞能够对已定植在雌性 小鼠卵巢的肿瘤具有巨大的抗肿瘤效应，即使卵巢中的小细胞为检测不到的（即，未定植） (参见图4&5)。在那些相同的小鼠中，已定植肺的肿瘤也被显著阻止生长，并显示大量的小 细胞共定位。总之，这些不同的结果表明，肿瘤定位可能对抗肿瘤效应不是至关重要的，并 且可能存在另一总体因素，可能是发挥作用的免疫系统的一些方面。另外，证明包含产气荚 膜梭菌溶素 O的小细胞对在严重免疫缺陷型的NIH-III小鼠（缺少除T-细胞功能外的NK 细胞功能）中生长的肿瘤没有影响（参见图6)。
[0173] 由于按本文所述配制的小细胞的免疫调节效应，本发明的免疫调节性小细胞的一 个非限制性但优选的治疗应用为膀胱内给药和治疗非肌肉侵入性膀胱癌。如图7中所示和 实施例5中所述，免疫调节性小细胞已在非肌肉侵入性膀胱癌的小鼠模型中显示功效。
[0174] 7.小细朐制剂
[0175] -些实施方案涉及产生来自但不限于细菌肠杆菌科的优化菌株及制备免疫调节 性小细胞。
[0176] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO5个小细 胞。在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO 6个小细胞。
[0177] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO7个小细 胞。
[0178] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO8个小细 胞。
[0179] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO9个小细 胞。
[0180] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/101°个小细 胞。
[0181] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/1011个小细 胞。
[0182] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO12个小细 胞。
[0183] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO13个小细 胞。
[0184] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO14个小细 胞。
[0185] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO15个小细 胞。
[0186] 在一些实施方案中，产小细胞的活的亲本细胞污染物的水平小于1个/IO16个小细 胞。
[0187] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解 的相同含义。尽管参照实施方案和实例描述了本申请，应理解，可进行不同的修改而不脱离 本发明的精神。本文引用的所有参考文献均通过引用明确地整体并入本文中。
[0188] 在以下实施例中更详细地公开了本申请的实施方案，其不以任何方式试图限制本 申请的范围。 实施例
[0189] 实施例1
[0190] 产气荚膜梭菌溶素 O当通过VAX-IP小细胞靶向和递送时在体外具有细胞毒性， 如表1和图2中所示。通过在包含10%的胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640中以 25, 000个鼠转移细胞癌细胞系MB49接种96孔板，来进行体外实验。第二天，以每只接种的 哺乳动物添加1，〇〇〇: 1比率的VAX-IP与VAX-I小细胞（MOI)，将VAX-IP、VAX-I (不包含产 气荚膜梭菌溶素0)或重组产气荚膜梭菌溶素0(BTX-100,购自ATCC)添加至细胞。添加的 BTX-100浓度等于通过VAX-IP递送的产气荚膜梭菌溶素0的量。最初，将乳酸脱氢酶（LDH) 活性测定用作细胞毒性的替代读取，主要是因为LDH活性是哺乳动物细胞膜泄露的公知指 示剂，其为报导的产气荚膜梭菌溶素〇作用的机制。如同所预期的并且如图1中所示，在暴 露至BTX-100后几乎立即从MB49细胞释放鼠乳酸脱氢酶（LDH)。用VAX-IP以1，000:1的 MOI处理的MB49细胞也显示LDH活性，尽管释放的起始较慢，可能是由于需要VAX-IP小细 胞内化、内体降解启动和通过产气荚膜梭菌溶素〇介导的内体膜破坏的方式将产气荚膜梭 菌溶素〇最终释放至靶细胞。用作对照的VAX-I小细胞未显示明显的LDH释放。令人吃惊 地，随后发现以BTX-100处理的细胞到24hr时间点时回复，并且具有完全的活力和粘附性。 另一方面，以VAX-IP小细胞处理的那些MB49细胞从板上脱离并且看起来像死了。为了证 实这一结果，重复了相同的实验以针对一系列浓度的BTX-100与一系列VAX-IP小细胞进行 比较，但在该情况下于24hr时间点时进行了标准的MTT细胞活力测定。这些实验的结果示 出在实施例2中，其清楚地证明当通过小细胞递送时，经细胞内递送正常无毒浓度的产气 荚膜梭菌溶素0可能相当有效。
[0191] 表 1
【主权项】
1. 细菌小细胞，其包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，其中所述小细胞不显示抗体或包 含抗体的Fc区的其他分子。
2. 如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯特菌 溶素〇、李斯特菌溶素〇 L461T、李斯特菌溶素 O E247M、李斯特菌溶素 O D320K、李斯特菌溶 素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素0 c、 链球菌溶素0 e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素0、韦 氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素 0、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素（lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假 肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、 阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
3. 如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌 溶素0。
4. 如权利要求1所述的小细胞，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
5. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含侵袭素。
6. 如权利要求1-4中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不包含侵袭素。
7. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含Thl细胞因子。
8. 如权利要求7所述的小细胞，其中所述Thl细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、 IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
9. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含Th2细胞因子。
10. 如权利要求9所述的小细胞，其中所述Th2细胞因子选自：IL-I a、IL-I β、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13。
11. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含磷脂酶。
12. 如权利要求11所述的小细胞，其中所述磷脂酶选自PC-PLC和PI-PLC。
13. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其还包含选自以下的蛋白毒素：白喉毒 素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆 菌溶素 B、肉毒杆菌溶素 E3、肉毒杆菌溶素 C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素 A、B和a、 蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳SI毒素、假单胞菌外毒素 A、大肠 杆菌热不稳定毒素（LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、 细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
14. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不包含任何其他的治疗 活性部分。
15. 如权利要求14所述的小细胞，其中所述小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的 治疗性蛋白或治疗性核酸。
16. 如前述权利要求中任一项所述的小细胞，其中所述小细胞不显示蛋白G或蛋白A的 Fc结合部分。
17. 产小细胞的细菌，其包含： 编码产小细胞的基因产物的可表达的基因，所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染 色体分离中的一种或多种；以及 重组表达盒，其能够功能性表达胆固醇依赖性细胞溶素蛋白，其中所述细菌不显示抗 体或包含抗体的Fc区的其他分子，并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
18. 如权利要求17所述的产小细胞的细菌，其还包含： 编码异源核酸内切酶的可表达的"遗传自杀"基因，其中所述产小细胞的细菌的染色体 包含所述核酸内切酶的一个或多个识别位点； 确定的营养缺陷型；和 ΙρχΜ/msbB基因的缺失或突变。
19. 如权利要求18所述的产小细胞的细菌，其中所述核酸内切酶选自：I-CeuI、 PI-SceI、I-Chul、I-Cpal、I-SceIII、I-Crel、I-Msol、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-Dmol、 I-PorI、PI-TliI、PI-TliII 和 PI-ScpL·
20. 如权利要求18或19所述的产小细胞的细菌，其中所述营养缺陷型是由于必要代谢 基因中的缺失或失活突变。
21. 如权利要求17-20中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述编码产小细胞的基 因产物的可表达的基因选自：ftsZ、sulA、ccdB和sfiC。
22. 如前述权利要求中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞溶 素蛋白选自：李斯特菌溶素〇、李斯特菌溶素〇 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶 素0 D320K、李斯特菌溶素0 E247M、李斯菌特溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌 溶素〇、链球菌溶素〇 c、链球菌溶素0 e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、 苏云金芽孢杆菌溶素0、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽 孢梭菌溶素、破伤风溶素0、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素（lectinolysin)、肺炎球菌 溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶 素、斯氏李斯特菌溶素〇、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
23. 如权利要求17-21中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞 溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素0。
24. 如权利要求17-21中任一项所述的产小细胞的细菌，其中所述胆固醇依赖性细胞 溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1。
25. 如权利要求17-24中任一项所述的产小细胞的细菌，其还包含能够功能性表达侵 袭素的重组表达盒。
26. 治疗癌症的方法，包括向有需要的患者给予包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的细 菌小细胞，其中所述给药诱导非免疫原性的抗肿瘤免疫调节效应。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他 分子。
28. 如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自：李斯 特菌溶素0、李斯特菌溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特 菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素 0 c、链球菌溶素0 e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素 〇、韦氏芽孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风 溶素〇、诺维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素（Iectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶 素、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶 素0、阴道加德纳菌溶素和化脓隐秘杆菌溶素。
29. 如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜 梭菌溶素0。
30. 如权利要求26或27所述的方法，其中所述胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1〇
31. 如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含侵袭素。
32. 如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述小细胞不包含侵袭素。
33. 如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含Thl细胞因子。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述Thl细胞因子选自：IL-2、GMCSF、IL-12p40、 IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
35. 如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含Th2细胞因子。
36. 如权利要求35所述的方法，其中所述Th2细胞因子选自；IL-I a、IL-I β、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13。
37. 如权利要求26-36中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含磷脂酶。
38. 如权利要求37所述的方法，其中所述磷脂酶选自PC-PLC和PI-PLC。
39. 如权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述小细胞还包含选自以下的蛋白 毒素：白喉毒素的片段A/B、白喉毒素的片段A、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树 毒素、肉毒杆菌溶素 B、肉毒杆菌溶素 E3、肉毒杆菌溶素 C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒 素 A、B和a、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳Sl毒素、假单胞菌 外毒素 A、大肠杆菌热不稳定毒素（LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞 因子、趋化因子、细胞穿膜肽，以及以上物质的组合。
40. 如权利要求26-39中任一项所述的方法，其中所述小细胞不包含任何其他的治疗 活性部分。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治 疗性蛋白或治疗性核酸。
42. 如权利要求26-41中任一项所述的方法，其中所述小细胞不显示蛋白G或蛋白A的 Fc结合部分。
43. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤、转移瘤或液体 瘤。
44. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症为上皮、成纤维细胞、肌肉 或骨起源的。
45. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、胰腺 癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠 癌、食管癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴莖癌和肾癌。
46. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症为膀胱癌。
47. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：腺癌、肉瘤、纤维肉瘤 以及眼癌、脑癌和骨癌。
48. 如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：非霍奇金氏淋巴瘤、 骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和 慢性髓性白血病。
49. 如权利要求26-48中任一项所述的方法，其中所述给药产生Thl优势免疫反应。
50. 如权利要求26-48中任一项所述的方法，其中所述给药产生Th2优势免疫反应。
【专利摘要】本公开涉及包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的免疫调节性细菌小细胞和使用所述小细胞的方法。
【IPC分类】A61P35-00, A61K38-16, A61K48-00
【公开号】CN104837506
【申请号】CN201380061686
【发明人】马修·J·贾卡洛内
【申请人】瓦克星治疗有限责任公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年10月2日
【公告号】CA2886883A1, EP2903653A1, US20140093954, WO2014055682A1