L-Il、IL-12、LIF、FGF-β 的造血细胞生长因子的融合蛋 白。HGFs包括修饰的生长因子（如，突变蛋白）和融合蛋白，其可按照本领域已知方法制 备。参见，例如（Sambrook等，《分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。刺激巨噬细胞功能的造血细胞生长 因子，如GM-CSF，是特别优选的。这些可以被用作佐剂。
[0023] "外束放射疗法（external beam radiotherapy) "可以通过输送一束高能量X射 线到患者的肿瘤部位而进行。所述射线束在患者体外产生并靶向肿瘤部位，患者体内没有 置入放射源。该方法可与根据本发明的任何其它治疗步骤结合使用。
[0024] "治疗"用在此处是指给予患有疾病或有发生疾病风险的受治疗者益处的治疗或 预防手段，包括受治疗者状况的改善（如，一种或多种症状），延缓病情的进展，延缓症状的 发生或减慢症状的发展等。就这一点而言，术语"治疗"也包括对受治疗者预防疾病的处理 以防止症状的发生。
[0025] 用在此处，"治疗"和"预防"不意欲表示症状的治愈或完全去除。而是指给予患有 疾病的患者益处的任何类型的治疗，包括患者状况的改善（如，一种或多种症状），延缓疾 病的发展等。
[0026] "治疗有效量"用在此处表示足以对患有癌症，如胶质母细胞瘤的患者产生希望效 果的抗体的量，所述希望的效果包括患者状况的改善（如，一种或多种症状），延缓疾病的 进展等。
[0027] 需要以本文描述的方法治疗的受治疗者包括患有胶质母细胞瘤或星形细胞瘤的 受治疗者，以及患有其它实体肿瘤（solid tumor)或癌症，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、脑瘤、肝 癌、前列腺癌、脾脏肿瘤、肌肉肿瘤、口腔癌、胰腺癌、头部和颈部肿瘤、皮肤癌（包括黑色素 瘤）等的受治疗者。需要治疗的受治疗者特别地包括患有表达EGFRvIII的肿瘤，如脑瘤 的患者。所述肿瘤可以是原发性肿瘤，转移性肿瘤或再发性肿瘤。由本发明所述方法治疗 的受治疗者特别地包括患有表达EGFRvIII的肿瘤，包括神经胶质瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、黑 色素瘤、维尔姆斯瘤（Wilms tumor)、结肠癌、乳腺和肺癌，以及鳞状细胞癌的受治疗者。由 本发明所述方法治疗的受治疗者最特别地包括患有脑瘤或脑癌的受治疗者，如胶质母细胞 瘤，特别是多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme)和囊性星形细胞瘤（cystic astrocytoma)〇
[0028] 本发明主要关于人类受治疗者的治疗，包括男性和女性受治疗者，以及新生儿、婴 幼儿、少年、青年、成人和老年人受治疗者，但是本发明也可以出于兽医目的，以及药物筛选 和药物开发的目的，在动物受治疗者中进行，特别是哺乳动物受治疗者，如小鼠、大鼠、狗、 猫、家畜和马。
[0029] 本发明所述的药物组合物可以根据已知技术进行制备。通常，活性试剂被包含在 药物可接受载体中。各种水性载体可被使用，如水、缓冲的水、〇. 9%的盐水、0. 3%甘氨酸、 透明质酸等。这些组合物可以用常规，公知的灭菌技术灭菌或无菌过滤。生成的水性溶液 可以按原样或冻干包装以待使用，所述冻干制备物在给药前与无菌溶液结合。所述组合物 可按照接近生理条件的要求包含药物可接受辅助物质，如缓冲剂、渗透压调节试剂、润湿剂 等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺 等。
[0030] 本发明所述的组合物及方法可包括给予一种或多种辅佐剂（co-adjuvant)。合适 的辅佐剂包括但不限于：（1)铝盐（明矾），如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂 制剂（含有或不含特定的免疫刺激剂（immunostimulating agent)，如胞壁肽（见下文）或 细菌的细胞壁组分），例如，如（a)含有5%三十碳六烯、0.5% Tween 80和0.5% Span 85配 制成亚微米颗粒的MF59(PCT公开号WO 90/14837)，（b)含有10%三十碳六烯、0. 4% Tween 80、5%聚丙二醇与环氧乙烧的加聚物阻断的（pluronic-blocked)聚合物L121以及微气 化为亚微米乳剂或振荡产生较大颗粒尺寸乳剂的thr-MDP (见下文），和（c) RibiTM佐剂系 统（RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT.)，含有 2%三十碳六稀、0· 2% Tween 80 和一种 或多种细菌的细胞壁组分，所述细菌的细胞壁组分选自包含单磷脂（monophosphorylipid) A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯（trehalose dimycolate) (TDM)和细胞壁骨架（CWS)的类别，优 选地为MPL+CWS (DetoxTM)(此处使用的合适的亚微米水包油乳剂的进一步讨论参见1999 年6月24日公开的PCT公开号WO 99/30739) ; (3)皂草甙佐剂，如StimulonTM(Cambridge Bioscience, Worcester, MA)可被使用，或由此产生的颗粒，如ISCOMs(免疫激励复合物）； ⑷完全弗氏佐剂（CF A)和不完全弗氏佐剂（IF A) ; (5)细胞因子，如白细胞介素（IL-1、 IL-2等），巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，肿瘤坏死因子（TNF)等；(6)细菌ADP-核糖化 毒素，如霍乱毒素（CT)、百日咳毒素（PT)或大肠杆菌不耐热肠毒素（LT)的去毒突变体，特 别是LT-K63 (其中野生型第63位的氨基酸被赖氨酸取代）、LT-R72 (其中野生型第72位 的氨基酸被精氨酸取代）、CT-S109 (其中野生型第109位的氨基酸被丝氨酸取代）、由CpG 家族分子衍生的佐剂、包含CpG基序的CpG二核苷酸和合成的寡核苷酸（见，如Krieg等， Nature，374:546(1995)和 Davis 等，J. Immunol. ,160:870-876 (1998))和 PT-K9/G129(其 中野生型第9位的氨基酸被赖氨酸取代且第129位被甘氨酸取代）（参见，例如PCT公开号 WO 93/13202和WO 92/19265) ; (7)可发挥免疫刺激剂功能以增强组合物效力的其它物质。 参见，例如美国专利号6, 534, 064 ;以及（8)除CpG和RIBI佐剂外，Toll样受体的其它配位 体，如细菌鞭毛蛋白（⑶4+T细胞的有效佐剂；见IJ Immunol. 169:3914-9 (2002年10月））。
[0031] 活性试剂可通过任何医学上合适的程序给药，如常规静脉注射或动脉内给药，注 射进脑脊髓液。在某些情况下，皮内、腔内、鞘内，或向肿瘤或向为肿瘤供养的动脉直接给药 是有利地。在肿瘤或其一部分先前被手术切除的地方，治疗试剂可通过直接注射或通过预 选植入的蓄积处向肿瘤部位（并且特别地向肿瘤部位的封闭腔或"切除腔"）给药。
[0032] 其中，活性试剂的剂量将取决于受治疗者的状况，要治疗的肿瘤的特定类别或类 型，给药途径，使用的治疗试剂的性质，以及该肿瘤对特定治疗试剂的敏感性。
[0033] 一般来说，诸如EGFRvIII肿瘤抗原或疫苗的剂量，包括任何载体蛋白或结合于其 上的肽，为每剂每位受治疗者10、100或500 μ g到2-3mg。药剂可以一次给予，任选地包含 追加或"促进"药剂（如，一、二或三次追加或"促进"剂量以1到3周的间隔给予）。应该 注意，如果需要，药剂可以分开，如在不同的注射部位给药，以降低诸如局部反应的副作用。 在制剂包含连接（或"结合"）有载体蛋白的肿瘤抗原和没有载体蛋白的肿瘤抗原时，计算 的剂量可以包括连接和自由的肿瘤抗原以及载体蛋白。
[0034] 一般来说，诸如GM-CSF的佐剂的剂量也为每位受治疗者10或20 μ g到500 μ g， 或1或2mg，以与肿瘤抗原的药剂相同或不同的时间表给药。当以相同的时间表给药时，佐 剂可以用与肿瘤抗原相同的载体给药。当未在相同的载体中结合时，佐剂的剂量仅需要以 与肿瘤抗原的剂量足够接近的时间给药，以增强它的效力（如，在一或两小时内；在同一天 等）。
[0035] 用于实现本发明的烷化剂包括（但不限于）1，3_双（2-氯乙基）-1_亚硝基脲 (BCNU)和四嗪衍生物，特别是[3H]咪唑并[5, Ι-d] 1，2, 3, 5-四嗪-4-酮衍生物，如替莫唑 胺及其类似物（包括药物上可接受盐及其前体药物（pro drug))。这样的化合物是公知的。 参见，例如美国专利号6, 096, 724 ;6, 844, 434和5, 260, 291。用于实现本发明的烷化剂的 例子包括[3H]咪唑并[5, Ι-d] 1，2, 3, 5-四嗪-4-酮烷化剂，特别是具有以下通式的那些烷 化剂：
[0036]
【主权项】
1. EGFRvIII肽在与引起淋巴细胞减少症的有效量的替莫唑胺或其药物上可接受的盐 组合制备用于治疗受治疗者肿瘤的药物中的应用，其中所述EGFRvIII肽具有序列LEU-GL U-GLU-LYS-LYS-GLY-ASN-TYR-VAL-VAL-THR-ASP-HIS-CYS (SEQ ID NO: 3)，并且其中匙孔血 蓝蛋白（KLH)与CYS残基结合，并且其中GM-CSF作为佐剂与EGFRvIII肽组合应用。
2. 权利要求1所述的应用，其中所述EGFRvIII肽通过异源双功能交联剂与所述KLH结 合。
3. 权利要求2所述的应用，其中所述异源双功能交联剂是6-[3'（2-二硫代吡啶）-丙 酰胺基]己酸磺基瑭J自酰亚胺基醋（sulfosuccinimidyl 6_[3'（2-pyridyldithio)-propi onamido]hexanoate)〇
4. 权利要求1所述的应用，其中所述肿瘤是恶性神经胶质瘤。
5. 权利要求1所述的应用，其中所述EGFRvIII肽在CD8+T细胞开始从诱发的淋巴细胞 减少的最低点恢复后被给予。
6. 权利要求1所述的应用，其中所述EGFRvIII肽在受治疗者的Tkec细胞达到峰值并且 响应于替莫唑胺或其药物上可接受的盐正在减少后被给予。
7. 权利要求1所述的应用，其中所述肽和所述替莫唑胺或其盐在循环中被重复给予。
【专利摘要】由于担心诱发的淋巴细胞减少会抵消免疫疗法的治疗效力，化学疗法和免疫疗法的同时给予被认为是不当的。替莫唑胺已经显示出是一种对患有恶性神经胶质瘤的患者有效的化学疗法，并且为了用免疫疗法治疗，对患有胶质母细胞瘤(GBM)的患者不使用该试剂是有争议的。尽管有常规的教条，我们显示了化学疗法和免疫疗法可以同时输送而不抵消免疫疗法的效果。事实上，替莫唑胺诱发的淋巴细胞减少可能实际上与肽疫苗协同作用。
【IPC分类】A61K39-39, A61K39-00, A61K38-10, A61K31-4188, A61P35-00
【公开号】CN104857500
【申请号】CN201510114080
【发明人】J·H·桑普森, D·D·比格纳, A·亨伯格, D·米切尔
【申请人】杜克大学, 德克萨斯大学系统董事会
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2006年11月2日
【公告号】CA2628282A1, CA2628282C, CN101594877A, CN103463630A, EP1940461A2, EP1940461A4, EP1940461B1, US20090220551, US20150118181, WO2007056061A2, WO2007056061A3