一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米药物，具体涉及一种对纳米钻石表面修饰后，通过酯键将阿霉素共价偶联到修饰的纳米钻石制备成纳米药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]现代生活中的饮食、环境污染，以及久坐不动、吸烟等不良生活习惯使得肿瘤的发病逐年增多。阿霉素是应用最为广泛的小分子化疗药物之一，但由于药物分布的无选择性等缺陷，使阿霉素进入体内后对正常组织产生十分严重的毒副作用。同时，如果长期使用阿霉素，还会诱导肿瘤细胞对其产生很强的耐药性。如何提高阿霉素体内分布的特异性，增强其化疗疗效，同时尽量减少其毒副作用便成为亟待解决的问题。
[0003]纳米药物因其特定的尺寸，可利用肿瘤组织的EPR(enhanced permeability andretent1n effect)效应提高药物对肿瘤组织的选择性，在一定程度上实现肿瘤的被动革巴向治疗。而通过化学键键合的纳米药物比物理吸附抗癌药物的纳米载药体系在血液循环时更加稳定，能有效避免药物突释。纳米钻石因其尺寸小、比表面积大、表面易于修饰和生物相容性好等物理化学特性，在生物医学应用方面引起了人们广泛的研宄兴趣。基于上述理论，我们首先以聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)修饰纳米钻石，然后通过酯键将化疗小分子药物阿霉素负载于其表面制备成纳米药物，并研宄了该药物的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005]本发明提供的一种酯键偶联纳米钻石阿霉素药物的制备方法，包括如下步骤:
[0006](I)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mg EDC,0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，从而得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1Μ、ρΗ为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)沉淀物；
[0007](2)取阿霉素(DOX)，按每毫克阿霉素加入1-1.5mL无水乙醇溶解，取5mL体积分数为10%的缩水甘油(GLY)无水乙醇溶液于容器中，在快速搅拌状态下缓慢加入上述阿霉素溶液，再加入几滴三乙胺，使体系PH约为8，室温避光搅拌反应24小时，反应完毕，抽滤收集产物，并用丙酮洗涤5-10次，得到阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)，置于真空干燥箱，避光保存；
[0008](3)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)沉淀物，按每毫克ND-PEG-C00H加入0.5-lmL的灭菌双蒸水中，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有0.2-0.3mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再按每毫克ND-PEG-C00H加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37°C水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，制得纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素ND-PEG-GLY-DOX(NP⑶)纳米药物，真空干燥，避光保存，其粒径大小为293.6±0.75nm。
[0009]与现有技术相比本发明的有益效果:本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞0fepG2)、人宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)和阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)通过酯键连接，制备得到NP⑶纳米药物，经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该药物对癌细胞具有一定的杀伤力；通过流式细胞仪测试凋亡实验，表明NPGD能够诱导肿瘤细胞凋亡，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
【附图说明】
[0010]图1纳米药物NP⑶(右侧)和ND-DOX (左侧)的紫外灯照射下的照片。
[0011]图2各种纳米颗粒的红外光谱图
[0012]图3不同pH对纳米药物NP⑶体外释药的影响
[0013]图4A不同浓度的纳米药物NP⑶对体外培养H印G2细胞活性的影响
[0014]图4B不同浓度的纳米药物NPGD对体外培养HeLa细胞活性的影响
[0015]图4C不同浓度的纳米药物NP⑶对体外培养MCF-7细胞活性的影响
[0016]图5A纳米药物NPGD对体外培养不同时间H印G2细胞活性的影响
[0017]图5B纳米药物NPGD对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
[0018]图5C纳米药物NPGD对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
[0019]图6A用流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡的结果
[0020]图6B用流式细胞仪检测纳米载体ND-PEG影响MCF-7细胞凋亡的结果
[0021]图6C用流式细胞仪检测纳米药物NPGD影响MCF-7细胞凋亡的结果
[0022]图6D用流式细胞仪检测阿霉素DOX影响MCF-7细胞凋亡的结果
[0023]图6E图6A-D细胞凋亡各实验组比较的柱状图
【具体实施方式】
[0024]以下为实施例中使用的材料:
[0025]纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm, Ireland)。
[0026]阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11.HCl，分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司生产，规格按C27H29NO11.HCl计算为10mg。
[0027]缩水甘油(GLY，分子量74.08)为Sigma公司生产。
[0028]聚乙二醇二胺(H2N-PEG-COOH,分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
[0029]实施例1:
[0030](I)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)纳米粒子的制备
[0031]准确称取1mg羧基化纳米钻石，分别经过二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(C2H5OH)、灭菌水(H2O)洗涤后，置于1mL MES (0.1M、pH5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入2mg EDC、2.5mg NHS，室温搅拌反应6h，待反应结束后以15000rpm高速离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
[0032]把活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1mL BBS(0.1M、pH8.4)缓冲溶液中，超声分散1min形成悬浊液，接着加入3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用蒸馏水继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。把未反应的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干净的烧杯中静置，待测定ND-PEG-C00H纳米颗粒上偶联H2N-PEG-COOH的质量。
[0033]精确称取Img H2N-PEG-COOH,用BBS (0.1M、pH8.4)溶解并定容于1ml的比色管中，分别量取0.8ml,0.56mL、0.4ml, 0.16ml,0.08mL置入2ml的EP管中，按摩尔比向其中入相应体积的荧光胺，再加入一定体积使溶液总体积为2mL，立即涡流10秒，放置5分钟，采用荧光分光光度法设激发波长为385nm，测485nm处的荧光强度，以H2N-PEG-COOH摩尔浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制H2N-PEG-COOH标准曲线。据标准曲线公式，用反应前加入H2N-PEG-COOH的总量减去反应后上清液中H2N-PEG-COOH质量，即得到每毫克ND纳米颗粒偶联 H2N-PEG-COOH 的量为 0.15mg。
[0034](2)称取纯阿霉素盐酸盐(DOX) 1mg,加入1mL无水乙醇溶解，取50mL体积分数为10%的缩水甘油(GLY)无水乙醇溶液于圆底烧瓶中，在快速搅拌状态下缓慢加入上述阿霉素溶液，再加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，室温避光搅拌反应24小时，反应完毕，抽滤收集产物，并用丙酮洗涤8次，得到富含羟基的阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)，置于真空干燥箱避光保存。
[0035](3)准确称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H) 1mg，接着加入1mL的灭菌双蒸水，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有3mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再加入2.0mg EDC,2.5mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37°C水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，将制得的纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(NP⑶)纳米药物，真空干燥，避光保存。
[0036]当阿霉素以酯键连接到纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)表面时，阿霉素的荧光发生猝灭，图1 (右侧)为纳米药物NP⑶以及纳米钻石物理吸附DOX的ND-DOX体系(左侧)在紫外照射下的样品示意图，由图可见ND-DOX体系发橙红色荧光，而纳米药物NPGD不发荧光，表明共价偶联。收集所有的上清液并记录体积，待测定未反应的阿霉素。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的连接量，经计算可知每毫克ND-PEG连接阿霉素质量约(150±1.75)微克。
[0037]实施例2:
[0038](I)?(2)的制备同实施例1
[0039](3)准确称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H) 1mg，接着加入1mL的灭菌双蒸水，超声分散30min形成悬浊液，然后逐滴滴入溶有2mg阿霉素-缩水甘油(DOX-GLY)的灭菌双蒸水中，接着再加入2.0mg EDC,2.5mg NHS，随后加入几滴三乙胺，使体系pH约为8，然后于37°C水浴锅避光搅拌反应24小时，待反应结束，以15000rpm高速离心5min收集上清液，用灭菌双蒸水洗涤5次，再用丙酮洗涤至上清液无色，将制得的纳米钻石-聚乙二醇-缩水甘油-阿霉素(NP⑶)纳米药物，真空干燥，避光保存。收集所有的上清液并记录体积，待测定未反应的阿霉素。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素490nm峰位处的吸光度，计算DOX的连接量，经计算可知每毫克ND-PEG连接阿霉素质量约(145±2.35)微克。
[0040]实施例3:
[0041]纳米粒子的红外光谱图表征
[0042]为了确认纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-C00H)与缩水甘油-阿霉素(GLY-D0X)之间是否形成酯键，分别取微量纳