r>[0026] 实施例3
[0027] 本发明透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物还可由以下方法实现：
[0028](1)、将0? 8g的CuS04 *5H20溶解于220ml水中，搅拌，加入6. 5g聚乙烯吡咯烷酮， 室温反应10~20min，加入1. 3g氢氧化钠，搅拌均勾，滴加14ml水合肼，搅拌5~lOmin， 再加入1. 4ml硫酸按，搅拌lh，用超纯水在15000rpm离心5-10min，水洗至中性，冷冻干燥 46-50h，成中空介孔硫化铜纳米颗粒；
[0029](2)、将中空介孔硫化铜纳米粒220mg加入220ml超纯水，超声分散10~30min， 再在搅拌下加入440mg疏基乙胺，搅拌24h，15000rpm离心5-10min得沉淀，沉淀用超纯水 复溶，再15000rpm离心5-10min，得沉淀，沉淀再用超纯水复溶，如此重复2~3遍，直至中 性，冷冻干燥，得氨基化中空介孔硫化铜复合物（CuS-NH 2);
[0030] (3)、将850mg透明质酸加入pH7~9的磷酸盐缓冲液54ml中，搅拌溶解，加入2. lg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺、1. 3g羟基琥珀酰亚胺为活化剂，室温搅拌30min， 成活化的透明质酸；
[0031] (4)、在冰浴下，将步骤（2)制备的氨基化中空介孔硫化铜复合物（CuS-NH2)用pH =7~9的磷酸盐缓冲液分散，得分散液，将活化的透明质酸缓慢加入分散液中，升至室温， 反应3h，15000rpm离心5-1 Omin得沉淀，沉淀加水分散，在水中透析2d，冷冻干燥，即得透明 质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物（HA-CuS)。
[0032] 所述的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物与药学活性或药理活性分子相结 合在制备纳米载药系统中的应用，所述药学活性或药理活性分子为阿霉素、紫杉醇、多烯紫 杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌。
[0033] 所述的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物在制备抗肿瘤药物（组合物）中的 应用。
[0034] 所述的抗肿瘤药物在制备抗肿瘤的注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
[0035] 所述的抗肿瘤药物在制备光热治疗、光声成像、实现热疗-化疗-肿瘤诊断综合治 疗一体化药物中的应用。
[0036] 透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物在制备抗肿瘤药物（组合物）中的应用， 方法是，透明质酸修饰的中空介孔硫化铜于磷酸盐缓冲液中探头超声溶解，与经适当溶剂 溶解的抗肿瘤药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌24小时后采用离心法、透析法 或超滤法除去有机溶剂及游离药物，冻干制得粒径为10~l〇〇〇nm的抗肿瘤药物组合物，所 述适当溶剂，指药学上使用的能溶解该药物的溶剂，如乙醇、超纯水或水。
[0037] 所述的抗肿瘤药物组合物，包含本发明所述的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜和 药学活性或药理活性分子，其中该药学活性或药理活性分子，优选自阿霉素、紫杉醇、多烯 紫杉醇、羟基喜树碱、米托蒽醌等抗肿瘤药物。
[0038] 所述的抗肿瘤药物组合物，可以用于注射、口服或植入给药。其中注射给药优选注 射剂、冻干粉针，口服给药优选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂，植入给药优选自凝胶 剂，溶液剂。
[0039] 经科学试验，本发明所制得的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物具有制备方 法简单，并将硫化铜显著的光热敏感性、强大的药物负载特性，透明质酸独特的肿瘤细胞靶 向性、辅助的抗肿瘤活性、良好的生物相容性有机的整合于一体，加之可以物理负载具有抗 肿瘤活性的化疗药物，既可克服传统光热疗、化疗技术的非靶向性难题，降低治疗过程中对 正常组织的损伤，与传统光热疗法相比具有高效、可控的优势，并且，其光热治疗与化疗技 术的结合更体现癌症综合治疗的问题。有关资料如下：
[0040] -、负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物的表征
[0041 ] 1、透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物中阿霉素含量的测定
[0042] 采用紫外分光光度法，于482nm波长处测定阿霉素的含量。以公式（1)计算样品 的载药量。载药量达到73%左右。
[0044] 2、负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物粒径和电位的测定
[0045] 取适量负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜分散于水中，用Nano_ZS90 型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为135nm和18. 4±2. 8mV。
[0046] 二、负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物的药物释放实验
[0047] 分别取4份HA-CuS/DOX纳米复合物，分别分散于50ml pH7. 4磷酸盐缓冲盐，pH5. 5 磷酸盐缓冲液，含透明质酸酶的PH7. 4磷酸盐缓冲液，含透明质酸酶的pH5. 5磷酸盐缓冲液 分散介质中，放置于摇床中（37°C，lOOrpm)，每隔2h取样0. 5ml，之后再加入0. 5ml的释放 介质，激光组在每个时间点用808nm激光（2W/cm2)照射10min。用高效液相检测样品，释药 14h后，在无透明质酸酶存在时，HA-CuS/DOX纳米复合物在pH 5. 5磷酸盐缓冲液中较pH7. 4 磷酸盐缓冲盐的释药率仅高4. 4%，激光组较非激光组释药率高11. 1 %;而在有透明质酸酶 存在时，HA-CuS/DOX纳米复合物在pH 5. 5磷酸盐缓冲液中较pH7. 4磷酸盐缓冲盐的释药 率高26. 6%，激光组较非激光组释药率高33. 2%。该结果说明，仅有透明质酸酶将透明质 酸降解后，负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物才得以有pH响应性释药。
[0048] 三、负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物的细胞增殖抑制实验
[0049] 采用SRB法，选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为5 X 104/ml接 种于96孔培养板，每孔100 y 1 (边缘孔用无菌PBS填充），细胞贴壁生长24h后加药，依次为 空白组、CuS组、HA-CuS组、D0X组、CuS/DOX组、HA-CuS/DOX组，药物终浓度设为4 y g/ml，并 分设激光组（2W/cm2, 3min)和非激光组。每组设6个复孔。24h后，每孔加入50 y 1 4°C预冷 的50%三氯乙酸（TCA)固定细胞，固定lOmin后移入4°C冰箱固定lh，取出弃去固定液，用 去离子水洗5遍，甩干，室温自然干燥。室温晾干后，每孔加入SRB染液50 y 1，室温避光放置 15~30min染色，弃染液，用1 %的冰醋酸洗5遍，室温干燥。之后，用150 y 1非缓冲Tris碱 液（10mM，pH= 10. 5)溶解与细胞蛋白结合的染料，摇床微振荡（37°C，100rpm，10min)，于 酶标仪515nm波长处测每个小孔的0D值，计算肿瘤细胞生长抑制率（％) = (1-实验组0D 值 / 对照组 0D 值）X 100%，计算得到 CuS 组、CuS-laser 组、HA-CuS 组、HA-CuS-laser 组、 D0X 组、DOX-laser 组、CuS/DOX 组、CuS/DOX-laser 组、HA-CuS/DOX 组、HA-CuS/DOX-laser 组各组的细胞生长抑制率分别为：3. 7%，22. 4%，6. 2%，28. 8%，50. 3%，54. 2%，48. 3%， 71. 5%，50. 8%，81. 6%。结果表明，载体CuS及HA-CuS在实验剂量下对细胞无明显毒性， 但在近红外光（808nm)照射下有明显的光热效应；在无近红外光照射时制剂组与原料药组 的细胞毒性差别不大，而在近红外光照射时HA-CuS/DOX对细胞杀伤效果最强，则是化疗与 热疗协同治疗的结果。
[0050] 四、负载阿霉素的透明质酸修饰的中空介孔硫化铜复合物的细胞摄取实验
[0051] 选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，以3 X 105个/孔接种于6孔板，每孔2ml， 贴壁生长24h后加药，依次为D0X组、CuS/DOX组、HA-CuS/DOX组，药物终浓度设为4 y g/ ml，孵育时间设为0. 5h，lh，2h。加药后在37°C，5% C02条件下培养后，将孔内含药培养基 弃去，每孔用lml PBS洗2~3遍，加入500 y 1不含EDTA的胰酶消化细胞，加lml培养基 终止消化，吹打，直至细胞与壁分离，将细胞悬液移入l〇ml离心管中，离心弃去上清，加PBS 重悬，用流式细胞仪测定，发现MCF-7人乳腺癌细胞0. 5h对DOX、CuS/DOX和HA-CuS/DOX的 摄取量分别为：41.3%、21.5%和22.8%;111时的摄取量分别为 ：88.6%、43.4%和72.9%; 2h