一种绞股蓝皂苷纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品加工技术领域，涉及一种绞股蓝皂苷纯化方法，特别涉及歙县绞 股蓝皂苷的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum)是多年生的绞股蓝属草本植物，又名"五叶 参""甘茶蔓"等，其最早在我国明清医书中就有对其药用价值的相关记载[1]。其中，绞股 蓝皂苷是绞股蓝有效成分之一，其酸水解产物与人参皂苷的水解产物有同物异名性。因此， 人参皂苷的检测分析方法可作为绞股蓝皂苷定量的参考。
[0003] 首次发现绞股蓝含有人参皂苷类似成分是在1976年。至今，国内外通过检测确定 绞股蓝皂苷至少有84种，其中绝大部分绞股蓝皂苷与人参皂苷有类似的结构与理化性质。 由于绞股蓝皂苷具有降血脂、血糖、保护神经系统、抗肿瘤、抗衰老、抗动脉硬化、保护血管 等多种功能，目前投入了大量资金对其药用价值的研宄。
[0004] 由于绞股蓝皂苷具大的经济和药用价值，因此，高纯的的绞股蓝皂苷是绞股蓝皂 苷品质的重要保障。现有技术一般以相似相溶原理提取皂苷类物质，并进行适当破壁以提 高提纯效果。但经过粗提取后，还含有大量的杂质，严重影响绞股蓝产品的品质和后期理化 参数的检测等深入研宄。因此，分离提纯步骤对粗提取物的纯化来说是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种绞股蓝皂苷纯化方法，尤其针对安徽特有的歙县绞股蓝品 种优化纯化步骤，为日后大规模生产和利用提供了理论依据和技术指导。
[0006] 本发明目的通过以下方案实现
[0007] 1、本发明提供一种绞股蓝皂苷纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：
[0008] (1)湿法装柱：运用湿法装柱，将大孔树脂填充到柱体；
[0009] (2)提取液进柱：采用蠕动泵以1-1. 5BV的流速将提取液匀速吸入柱中；
[0010] (3)静置吸附 2h-2. 5h ;
[0011] (4)水洗杂质：将已被吸附完全的绞股蓝提取液用二倍柱的蒸馏水以1-1. 5BV的 流速冲洗柱体，使绞股蓝残液完全排出；
[0012] (5)乙醇解吸：用二倍体积的一定浓度的乙醇溶液以1-1. 5BV速度过柱，将大孔吸 附树脂上的绞股蓝皂苷洗脱下来；
[0013] 其中，乙醇溶液浓度为体积分数50-70%，洗脱时间为3-3. 5h。
[0014] 2.上述1提供的纯化方法，其中，步骤（5)乙醇进行解吸附步骤为：先用3-3. 5BV 蒸馏水洗脱，然后以5-5. 5BV体积分数为25-30 %的乙醇溶液洗脱，再用5-5. 5BV体积分数 为65-70%乙醇溶液洗脱。
[0015] 3.上述1提供的纯化方法，其中，步骤（1)的大孔树脂在填充前先进行预处理，其 方法为：用无水乙醇溶胀24h后，再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味。
[0016] 4.上述1提供的纯化方法，其中，步骤（1)所用大孔树脂为型号HP-20、D101、AB-8 的大孔树脂。
[0017] 5.上述1提供的纯化方法，其中，步骤（1)所用大孔树脂为型号AB-8的大孔树脂。
[0018] 6.上述1提供的纯化方法，其中，步骤（5)所用乙醇溶液浓度为体积分数70%。
[0019] 7.上述1提供的纯化方法，其中，所述绞股蓝皂苷为歙县绞股蓝皂苷。
[0020] 有益效果：
[0021] 1.本发明通过大量创造性劳动，发现以型号HP-20、AB-8大孔树脂进行吸附洗脱， 比吸附率都超过4. 5mg/g，同时比解吸量均为4. Omg/g以上，解吸附量达到90%以上；采用 湿法装柱可以使树脂之间堆叠紧密、堆层水平、柱效率高。总之，以此中大孔树脂进行吸附 纯化，可以达到纯化速度高，效果良好，大大提高绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷的纯化 效率。
[0022] 2.本发明在使用型号为AB-8大孔树脂的前提下，经过大量创造性试验，在洗脱乙 醇浓度为30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %条件下进行梯度洗脱，发现在50-70 %条 件下洗脱效果较佳，尤其是乙醇梯度洗脱时，70%乙醇皂苷解吸率为43. 3%，纯度由原先提 取液的32. 6%提高到78. 4%。同时，优化了在乙醇浓度为50-70%条件下进行乙醇洗脱的 步骤，保证使洗脱液中皂苷纯度提高，极大地减少更深入纯化的费用，避免了洗脱直接由高 浓度乙醇开始，造成大孔吸附树脂中产生难以去除的气泡，严重影响柱效率等问题。
[0023] 综上所述，本发明通过合理优化洗脱使用材料、洗脱方法获得了绞股蓝皂苷纯化 方法简单高效，为进一步纯化研宄绞股蓝皂苷尤其是歙县绞股蓝皂苷提供了参考。
【附图说明】
[0024] 图1人参皂苷Rbl的标准曲线
[0025] 图2五种大孔树脂静态等温吸附曲线
[0026] 图3大孔树脂静态解吸曲线
[0027] 图4不同浓度的乙醇溶液对绞股蓝皂苷的洗脱曲线
[0028] 图5高效液相绞股蓝皂苷分离色谱图
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
[0030] 实验材料及试剂
[0031] 绞股蓝：购自安徽易元堂中药饮片科技有限公司；大孔吸附树脂DM130、AB-8、 DlOl及人参皂苷Rb 1标准品：购自网络。
[0032] 香草醛、冰醋酸、乙醇、高氯酸等试剂均为分析纯，甲酸、乙腈为液相级。
[0033] 实验仪器设备
[0034]HPLC!Agilent1100 ;722G可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；旋转蒸 发仪：上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司。
[0035]实施例1 [0036] 树脂选择
[0037] I. 1皂苷含量的测定
[0038] 标准曲线的制备：准确称取20mg人参皂苷Rb1标准品，纯甲醇定容于IOOmL容量 瓶中，混合均匀，待用。精密吸取皂苷标准液200 y L、400 y L、600 y L、800 y L、1000 y L于 IOmL试管中，在70 °C水浴挥干甲醇后，各加新配制的5 %香草醛-冰醋酸溶液0. 2mL和高氯 酸0. 8mL，并混合均勾。再置于60°C恒温水浴锅中加热显色15min，后冰水冷却并各加5mL 冰醋酸，相应试剂作空白，在550nm测吸光值。
[0039] 以吸光度（X)对人参皂苷Rb1含量（y)做回归处理，得标准曲线：y = 0. 3439x+0. 0034(R2 = 0. 9998)。由图1可见，标准曲线在该范围线性良好，可以作为定量 的基准。
[0040] 皂苷含量的测定：取适量提取样品上清液，按上述方法进行显色并测吸光度，带入 标准曲线方程得阜苷得率：
[0042] 其中：n为皂苷得率，％ ;c为皂苷含量，mg/mL ;V为提取液总体积，mL ;m为绞股 蓝干粉质量，g。
[0043] 1. 2绞股蓝提取液的制备
[0044] 将干燥的绞股蓝用万能粉碎机粉碎并过200目筛，然后精确称取50g绞股蓝粉于 1000 mL烧杯中，加8倍体积的70%乙醇，超声提取30min，连续提取3次，抽滤、减压回收至 无醇味，将浓缩物加蒸馏水溶解、抽滤、定容，此时绞股蓝提取液中的皂苷的含量为0. 9~ 1. Omg/mLo
[0045] 1. 3大孔吸附树脂的确定
[0046] L3. 1树脂预处理
[0047]各取DM130、DlOl、AB-8、HP-20、HDP-100型号大孔树脂40g，用无水乙醇溶胀24h 后，再用蒸馏水多次冲洗抽滤至无醇味，待用。
[0048] 1. 3. 2静态吸附
[0049] 用DM130、DlOl、AB-8、HP-20、HDP-100五种树脂对安徽歙县的绞股蓝总皂苷的静 态吸附特性进行比较。每种树脂各精密称取3g已经预处理的大孔吸附树脂放入装有25mL 绞股蓝提取液的烧杯中，提取液过量，在25°C恒温水浴中反应，每隔半小时从上清液取样 一次，共取六次，达到平衡后，再将时间延长24h，，以5%香草醛-冰醋酸显色法对样品中绞 股蓝的皂苷含量进行检测，所有样品均重复三次平行。测算平衡吸附量和平衡解吸量。五 种大孔树脂的静态等温吸附率结果如图2所示，从图中可以看到，当时间延长时，树脂对绞 股蓝皂苷溶液吸附都在逐渐增加，DlOl树脂刚开始的Ih吸附比较强烈，但I. 5h之后，逐渐 被AB-8与DM130