专利名称：一种绞股蓝总苷颗粒的检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，属于对药品进行质量控制的技术领域。
背景技术：
绞股蓝作为ー种重要的中药材，在降血脂、抗肿瘤方面得到了广泛的应用。研究表明，绞股蓝中含有多种皂苷、黄酮类物质、多糖等化学成分。目前绞股蓝化学成分的研究主要针对其皂苷成分，另ー类活性成分黄酮却极少有人研究，近年来黄酮类化合物日益引起人们的重视，目前国内绞股蓝总苷颗粒制备过程中，含量控制指标单一，主要以测定人參皂苷Rb1的含量来控制绞股蓝总苷颗粒的质量，而绞股蓝总苷颗粒中另一重要活性物质黄酮类物质(槲皮素、山奈素、异鼠李素)，都可以作为含量測定的指标，以此来进行质量控制。目前多数绞股蓝总苷颗粒的含量測定方法较为单一，而且主要采用分光光度法， 此法专属性不够，检测结果不精确，其产品质量不易控制，因此，在生产过程中，用该质量控制方法不能有效控制绞股蓝颗粒的质量，从而影响其临床疗效。
发明内容
本发明的目的是为了提供ー种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，该方法针对现有质量控制标准的不足，对绞股蓝总苷颗粒的检测方法进行了研究，补充建立了绞股蓝总苷颗粒中所含有效成分的含量测定项目，提高了绞股蓝总苷颗粒的质量控制标准，从而保证了该药物的质量和临床效果。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案ー种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，所述的检测方法主要包括定性鉴别方法和含量測定方法；其中的定性鉴别方法包括对绞股蓝颗粒中的皂苷、多糖、人參皂苷Rb1的鉴别；人參皂苷Rb1的鉴别是以人參皂苷Rb1—甲醇溶液作为对照品溶液，以氯仿-甲醇-水=65:35:10为展开剂的薄层色谱法；所述的含量測定方法包括以分光光度法测定绞股蓝总苷颗粒中人參皂苷Rb1的含量，以高效液相色谱法測定绞股蓝总苷颗粒中的总黄酮醇苷的含量。本发明的绞股蓝总苷颗粒以绞股蓝药材为原料，辅以乳糖和糊精精制而成。进ー步的，所述的定性鉴别方法包括以下项目中的ー项或全部(I)取绞股蓝总苷颗粒Ig,置具塞试管中，加水IOml与稀盐酸1ml，摇匀；(2)取绞股蓝总苷颗粒lg，研细，加甲醇15ml，振摇，过滤，取滤液5ml，置蒸发皿中蒸干，加醋酐Iml溶解蒸干后的残渣得试剂，将试剂移至试管中，滴入硫酸2ml ；(3)取前述(2)项下剩余的滤液5ml，蒸干，趁热滴加新制的三氯化锑的氯仿饱和溶液；(4)薄层色谱法測定人參皂苷Rb :取绞股蓝总苷颗粒I. 5g，研细，加甲醇15ml，摇匀，浸溃20分钟，过滤，滤液经水浴加热浓缩至约2ml，作为供试品溶液；
取人參皂甙Rb1加甲醇制成对照品溶液海Iml甲醇中含2mg人参皂苷Rb1)；精确吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水=65:35:10在10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸こ醇溶液，在105°C加热10分钟至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点。所述的含量测定方法包括分光光度法测定绞股蓝颗粒中人參皂苷Rb1的含量(I)制备对照品溶液精密称取经五氧化ニ磷减压干燥24小时的人參皂苷Rb1IOmg,置于5ml量瓶中，加甲醇使之溶解并稀释至5ml刻度，摇匀；(2)标准曲线的绘制精密量取上述对照品溶液O. 0μ 1、30. 0μ 1、60. 0μ I、90. O μ 1,120. ομ 1,150. ομ I分别置具塞试管中，经水浴蒸去甲醇，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0. 2ml与高氯酸0. 8 ml，摇匀，密塞，置60°C水浴中加热15分钟，用流水冷·却至室温，再分别精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以0. 0μ I的对照品溶液为空白，在550nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，浓度为横座标，绘制标准曲线；(3)制备供试品溶液取绞股蓝总苷颗粒混匀，研细，精密称取I. 5g，置索氏提取器中，加适量甲醇，加热回流2小时后提取；蒸干提取液，残渣加水20ml使溶解，分次移至分液漏斗中；依次用20 ml,20 ml、10 ml、IOml水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇提取液，再用水30ml分三次洗涤，弃去水洗液；正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解后，移至IOml量瓶中，并稀释至IOml刻度，摇匀得清液；精密量取清液60 μ 1，照标准曲线制备的方法，依法測定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人參皂甙Rb1重量；高效液相色谱法測定制剂中总黄酮醇苷的含量(I)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇ー0. 4%磷酸水溶液=50:50为流动相，检测波长360nm，理论塔板数应不低于2500 ；(2)对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素适量，加甲醇制成每Iml各含0. 03mg槲皮素、0. 03mg山奈素、0. 02mg异鼠李素的混合溶液,作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取研细后的绞股蓝总苷颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液25ml后称定重量，加热回流I小时，冷却后再称定重量，用25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤后取滤液；(4)含量測定分别吸取对照品溶液与供试品溶液20μ 1，注入液相色谱仪，測定，即得槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量；再计算出总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)X 2. 51。本发明的有益效果如下I、通过增加绞股蓝总苷颗粒中有效成分的含量控制指标，能更好的保证产品质量，增加可控性；2、本发明在薄层鉴别法、分光光度法上增加了高效液相色谱法，高效液相色谱法的分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广，利于产业化推广；3、本发明所涉及的主要含量检测指标是人參皂苷Rb1、槲皮素、山奈素、异鼠李素，比现有含量检测指标增加了三项指标，后三项均属于黄酮类物质，具有自由基清除作用，在治疗脑血管疾病中起着重要作用，作为绞股蓝总苷颗粒中的有效成分，将其列入含量控制指标，能更有效的保证产品质量和临床疗效。4、本发明是通过独创的检测技术參数，以用于在各项检测中精密测量绞股蓝总苷颗粒的各有效成分的含量，从而有效控制绞股蓝总苷蓝颗粒的药效，能提高绞股蓝总苷颗粒质量标准，有利于产品的长远发展和提高产品竞争力。
具体实施例方式分别对2批次的绞股蓝总苷颗粒以本发明的检测方法进行检测定性鉴别方法(I)取绞股蓝总苷颗粒Ig,置具塞试管中，加水IOml与稀盐酸lml，摇匀一分钟后，产生持久性蜂窝状泡沫，10分钟内不得显著消失，即检测出含有皂苷；(2)取绞股蓝总苷颗粒lg，研细，加甲醇15ml，振摇，过滤，取滤液5ml，置蒸发皿中 蒸干，加醋酐Iml溶解蒸干后的残渣得试剂，将试剂移至试管中，滴入硫酸2ml，两液交界处显棕红色环，检测出含有黄酮类物质；(3)取前述(2)项下剩余的滤液5ml，蒸干，趁热滴加新制的三氯化锑的氯仿饱和溶液，显紫色，检测出含有人參皂苷；(4)薄层色谱法測定人參皂苷Rb1 :取绞股蓝总苷颗粒I. 5g，研细，加甲醇15ml，摇匀，浸溃20分钟，过滤，滤液经水浴加热浓缩至约2ml，作为供试品溶液；取人參皂苷Rb1加甲醇制成对照品溶液海Iml甲醇中含2mg人參皂苷Rb1)；精确吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水=65:35:10在10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸こ醇溶液，在105°C加热10分钟至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同顔色的斑点，检测过程中，要注意色谱中颜色和位置要一致。含量测定方法分光光度法测定绞股蓝颗粒中人參皂苷Rb1的含量(I)制备对照品溶液精密称取经五氧化ニ磷减压干燥24小时的人參皂甙RbiIOmg,置于5ml量瓶中，加甲醇使之溶解并稀释至5ml刻度，摇匀；(2)标准曲线的绘制精密量取上述对照品溶液O. 0μ 1、30. 0μ 1、60. 0μ I、90. O μ I、120. O μ I、150. O μ I分别置具塞试管中，经水浴蒸去甲醇，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml与高氯酸O. 8 ml，摇匀，密塞，置60°C水浴中加热15分钟，用流水冷却至室温，再分别精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以O. O μ I的对照品溶液为空白，在550nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，浓度为横座标，绘制标准曲线；(3)制备供试品溶液取绞股蓝总苷颗粒混匀，研细，精密称取I. 5g，置索氏提取器中，加适量甲醇，加热回流2小时后提取；蒸干提取液，残渣加水20ml使溶解，分次移至分液漏斗中；依次用20 ml,20 ml、10 ml、IOml水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇提取液，再用水30ml分三次洗涤，弃去水洗液；正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解后，移至IOml量瓶中，并稀释至IOml刻度，摇匀得清液；精密量取清液60 μ 1，照标准曲线制备的方法，依法測定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人參皂甙Rbl重量；高效液相色谱法測定制剂中总黄酮醇苷的含量(I)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇ーO. 4%磷酸水溶液=50:50为流动相，检测波长360nm，理论塔板数应不低于2500 ；(2)对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素适量，加甲醇制成每Iml各含O. 03mg槲皮素、O. 03mg山奈素、O. 02mg异鼠李素的混合溶液,作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取研细后的绞股蓝总苷颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液25ml后称定重量，加热回流I小时，冷却后再称定重量，用25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤后取滤液；(4)含量測定分别吸取对照品溶液与供试品溶液20μ 1，注入液相色谱仪，測定，即得槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量；再计算出总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)X 2. 51。以每袋重量3g绞股蓝总苷颗粒为检材，经分光光度法測定人參皂苷Rb1，每袋含人參皂苷Rb1不得少于36mg，以高效液相色谱法測定总黄酮醇苷，每袋含总黄酮醇苷不得小于10 mg，才能符合绞股蓝总苷颗粒的质量标准，以保证药品的疗效。以上检测项目的具体实验数据如下实施例I :批号 20110502分光光度法测定人參皂苷含量标准曲线方程y=0. 4049x+0. 0188 r=0. 9984&:浓度，7:吸收度)Al=O. 0833，Cl=O. 1594mg/ml, ml=l. 8010g,A2=0. 0798, C2=0. 1508mg/ml, m2=l. 6555g,测得含量为样1=1. 48%，样2=1. 52%，平均值=1. 5%，含量结果为每袋含人參皂苷Rb1ASmg0高效液相色谱法测定总黄酮醇苷(槲皮素、山奈素、异鼠李素)样I :(槲皮素)=O. 15% (山奈素)=O. 07% (异鼠李素)=O. 005% 总黄酮醇苷=0. 56%, ml=5. 0235g ；样2 (槲皮素)=0. 13% (山奈素)=0. 06% (异鼠李素)=0. 003% 总黄酮醇苷=0. 48%，m2=5. 0026g ；总黄酮醇苷平均值为O. 52%，含量结果为每袋含总黄酮醇苷15. 6mg实施例2 :批号20110503分光光度法测定人參皂苷含量标准曲线方程y=2. 0519x-0. 0078 r=0. 9987&:浓度，7:吸收度)Al=O. 286，Cl=O. 1431mg/ml, ml=l. 6009g,A2=0. 222，C2=0. 1119mg/ml, ml=l. 441 lg，测得含量为样1=1. 49%，样2=1. 29%，平均值=1. 4%，含量结果为每袋含人參皂苷Rb142mg ；
高效液相色谱法测定总黄酮醇苷(槲皮素、山奈素、异鼠李素)样I :(槲皮素)=O. 13% (山奈素)=O. 07% (异鼠李素)=O. 002% 总黄酮醇苷=0. 51%, ml=5. 0458g ；样2 :(槲皮素)=O. 12% (山奈素)=O. 05% (异鼠李素)=O. 001% 总黄酮醇苷=0. 43%,m2=5. 0169g ；总黄酮醇苷平均值为O. 47%，含量结果为每袋含总黄酮醇苷14. Imgo
权利要求
1.一种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，其特征在于所述的检测方法主要包括定性鉴别方法和含量测定方法；其中的定性鉴别方法包括对制剂中的皂苷、多糖、人参皂苷Rb1的鉴别；人参皂苷Rb1的鉴别是以人参皂苷Rb1—甲醇溶液作为对照品溶液，以氯仿-甲醇-水=65:35:10为展开剂的薄层色谱法；所述的含量测定方法包括以分光光度法测定制剂中人参皂苷Rb1的含量，以高效液相色谱法测定颗粒中的总黄酮醇苷的含量。
2.根据权利要求I所述的一种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，其特征在于所述的定性鉴别方法包括以下项目中的一项或全部 (1)取绞股蓝总苷颗粒lg，置具塞试管中，加水IOml与稀盐酸1ml，摇匀； (2)取绞股蓝总苷颗粒lg，研细，加甲醇15ml，振摇，过滤，取滤液5ml，置蒸发皿中蒸干，加醋酐Iml溶解蒸干后的残渣得试剂，将试剂移至试管中，滴入硫酸2ml ； (3)取前述(2)项下剩余的滤液5ml，蒸干，趁热滴加新制的三氯化锑的氯仿饱和溶液； (4)薄层色谱法测定人参皂苷Rb1:取绞股蓝总苷颗粒I. 5g，研细，加甲醇15ml，摇匀，浸溃20分钟，过滤，滤液经水浴加热浓缩至约2ml，作为供试品溶液； 取人参皂苷Rb1加甲醇制成对照品溶液(每Iml甲醇中含2mg人参皂苷Rb1)； 精确吸取供试品溶液和对照品溶液各5 yl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水=65:35:10在10°C以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热10分钟至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.根据权利要求I所述的一种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，其特征在于所述的含量测定方法包括 分光光度法测定绞股蓝总苷颗粒中人参皂苷Rb1的含量 (1)制备对照品溶液精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的人参皂苷Rb1IOmg,置于5ml量瓶中，加甲醇使之溶解并稀释至5ml刻度，摇匀； (2)标准曲线的绘制精密量取上述对照品溶液0.0iU、30. 0iU、60. 0iU、90. OiU、120. Oul, 150. O u I分别置具塞试管中，经水浴蒸去甲醇，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2ml与高氯酸0.8 ml，摇匀，密塞，置60°C水浴中加热15分钟，用流水冷却至室温，再分别精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以0. O ill的对照品溶液为空白，在550nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵座标，浓度为横座标，绘制标准曲线； (3)制备供试品溶液取绞股蓝总苷颗粒混匀，研细，精密称取I.5g，置索氏提取器中，加适量甲醇，加热回流2小时后提取；蒸干提取液，残渣加水20ml使溶解，分次移至分液漏斗中；依次用20 ml,20 ml、10 ml、IOml水饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇提取液，再用水30ml分三次洗涤，弃去水洗液；正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解后，移至IOml量瓶中，并稀释至IOml刻度，摇匀得清液；精密量取清液60 iil，照标准曲线制备的方法，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Rb1重量； 高效液相色谱法测定颗粒中总黄酮醇苷的含量 (1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇一0. 4%磷酸水溶液=50:50为流动相，检测波长360nm，理论塔板数应不低于2500 ； (2)对照品溶液的制备分别精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素适量，加甲醇制成每Iml各含0. 03mg槲皮素、0. 03mg山奈素、0. 02mg异鼠李素的混合溶液,作为对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取研细后的绞股蓝总苷颗粒5g，置具塞锥形瓶中，精密加入25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液25ml后称定重量，加热回流I小时，冷却后再称定重量，用25%盐酸溶液一甲醇=1: 4混合溶液补足减失的重量，摇匀，过滤后取滤液； (4)含量测定分别吸取对照品溶液与供试品溶液20yl，注入液相色谱仪，测定，即得槲皮素含量、山奈素含量、异鼠李素含量；再计算出总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)X 2. 51。
全文摘要
本发明涉及一种绞股蓝总苷颗粒的检测方法，所述的检测方法主要包括定性鉴别方法和含量测定方法；其中的定性鉴别方法包括对绞股蓝颗粒中的皂苷、多糖、人参皂苷Rb1的鉴别；人参皂苷Rb1的鉴别是以人参皂苷Rb1—甲醇溶液作为对照品溶液，以氯仿-甲醇-水=65:35:10为展开剂的薄层色谱法；所述的含量测定方法包括以分光光度法测定绞股蓝总苷颗粒中人参皂苷Rb1的含量，以高效液相色谱法测定绞股蓝总苷颗粒中的总黄酮醇苷的含量。采用本发明方法检测绞股蓝总苷颗粒，能够精密测量绞股蓝总苷颗粒的各有效成分的含量，从而有效控制绞股蓝总苷蓝颗粒的药效，更好的保证产品质量。
文档编号G01N21/31GK102707008SQ20121019756
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者姜新宇, 罗帆, 赵守明, 邓霜 申请人:湖南麓山天然植物制药有限公司