rial natriuretic factor); BNP:脑钠尿肽（brain natriuretic peptide); a -SkA : α 骨骼肌肌动蛋白（a -skeletal actin); ERK1/2 :细胞外信号调节激酶 1/2 (extracellular signal-ragulated kinasel/2); p-ERKl/2 :磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (phospho-extracellular signal-ragulated kinasel/2)； PPARa :过氧化物酶体增殖物激活受体 a (peroxisome proliferator-activated receptor α )； IGF-1 :膜岛素样生长因子 I (insulin-like growth factor I); Feno :非诺贝特（fenofibrate); Gff ：GW6471 ； I+G ：IGF-1+GW6471 ； PD ：PD98059 ； PE+PD :苯肾上腺素+ PD98059 ; EGF :表皮生长因子（epidermal Growth Factor); I+E:胰岛素样生长因子I +表皮生长因子。
[0044] 实施例1本发明以下实施例所用到的实验方法 1、差异凝胶电泳（difference gel electrophoresis，DIGE) 将〇7076(〇72、〇73、〇75)从-20°(：取出，室温放置5 1^11，加入25以1^二甲基甲酰胺，涡 旋混匀，离心（12,000 g，30 s)，取出2 yL配成400 pmol/μ L的工作液，将蛋白质样品调 节pH为8. 5,按照标记比例400 pmol CyDye /50 μ g蛋白，在避光条件下进行标记。4个16 周龄SHR心肌样品及4个16周龄WKY大鼠心肌样品随机采用荧光染料Cy3、Cy5标记，以 排除标记效率或染料与样品结合力不同的影响，上述12个样品等量混合用Cy2标记作为内 标，以此消除胶与胶之间的误差，冰浴中反应30 min，加入IyL赖氨酸（10 mmol/L)终止反 应，冰浴10 min。将分别由Cy2、Cy3、Cy5标记的三个样品混合，加入相同体积的2倍缓冲 液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、2% DTT，4% CHAPS，2% Pharmalytes3-10)，冰浴 10 min， 再进行双向凝胶电泳。
[0045] 2、MALDI-T0F-T0F 质谱鉴定 点样方式：取1 μ L肽段提取液，与同等体积a-氰基-4-羟基肉桂酸饱和的0. 1 % TFA/50%乙腈溶液混合后，点于质谱仪的不锈钢MALDI靶板上，并在室温下自然干燥。
[0046] 质谱分析与数据库检索：样品用4700串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，波长 337 nm氮激光源，反射型飞行距离2. 3米，加速电压15 kV，脉冲电压2950 V，反射电压 500 V，检测电压1900 V。样品采集前首先用胰蛋白酶降解的乙醇脱氢酶（ADH)混合肽进 行外标校正，然后在图谱采集时用ACTH肽片段18-39 (MH+:2465. 199 Da)进行相邻校正 (lock mass)，并设定胰蛋白酶自切峰（MH+: 2211. 105 Da)进行内标校正。数据库搜索采用 Mascot (http://www. matrixscience. com/)检索。肽段准确度设定为 50 ppm，允许一个 可能的漏切位点（Miss cleavage sites)，最低匹配肽段数目为4个。先用标准肽外标校正 4700 Proteomics Analyzer。一维谱图的质量范围为800 Da -3500 Da，质量聚焦 1600 Da， 激光能量5400,其中最强的5个肽被选取串联测序，检测顺序由弱至强，二级质谱激光能量 6600。每一个质谱图由20个各含100次激光轰击的图谱合成。数据处理采用GPS Explorer 软件，其核心算法为MASCOT，检索时设定质量范围900 Da-3500 Da，图谱密度为每200 Da不 超过 50 个峰，信噪比 20。所得结果用 GPS (Applied Biosystems，USA)-MASCOT (Matrix Science，London，UK)进行数据库检索。
[0047] 3、大鼠游泳运动训练 采用游泳耐力训练方式，游泳池体积为100X60X60 cm，水深为50 cm，水温为 30°C~35°C，每周6次，每次持续训练60 min，维持此运动量共8周。训练前1周为试 游泳运动阶段，时间从第1天的15 min逐渐增加到第5天的60 min，第2周开始每天游 60 min，所有游泳运动训练均在上午进行。
[0048] 收缩压及左室重量指数的测定： 采用NIBP血压心率测定仪，连续测量3次，每次间隔约lmin，以其均值作为收缩压。 腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg)麻醉大鼠/小鼠，迅速打开胸腔，用预冷的生理盐水充 分灌注，取出心脏，滤纸吸干，电子天平称取心脏重量。沿房室环剪去大血管、心房及右室游 离壁，将余下的室间隔、左室游离壁作为左室重量。左室重量与体重的比值作为左室重量指 数。
[0049] 4、乳鼠心肌细胞的原代培养与纯化 取出生1~3 d的Wistar乳鼠，75%的酒精浸泡消毒，取左心室，预冷的D-Hanks液洗 3次，剪碎心室肌约1 mm3左右，加入0. 25%的胰蛋白酶，放入37°C水浴箱中消化10 min。 第1次消化后弃上清，余下的组织块加入胰酶继续消化4次，取上清加入等量的全培养液终 止消化。2000 r/min离心10 min，取沉淀，加入含15% FCS的DMEM，重新悬浮细胞团。经 滤网过滤后接种于培养瓶中，37 °C、5%C02培养箱中放置2 h，差速贴壁以减少成纤维细胞 的污染。孵育后，收集所有的培养液，细胞计数后将细胞密度调整至5 X IO5~6 X 10 5/mL，6 孔板每孔接种上述接种液2 mL，加入5-溴脱氧尿啼啶(终浓度0.1 mmol/L)，以抑制非心肌 细胞增殖。培养48 h后，换用无血清培养基，24 h后进行分组处理。
[0050] 5、SCAD siRNA 干扰 siRNA干扰序列购于上海吉玛生物制药技术有限公司，按照公司提供的说明书进行实 验。SCAD siRNA的核酸序列如下：
6、实时荧光定量PCR检测ANF、BNP、a -SkA、PPAR a、SCAD的mRNA表达 按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。取6 yL的总RNA按转录试剂盒说 明书逆转录为相应 cDNA，PCR 扩增 ANF、BNP、a -SkA、PPARa、SCAD 和 β -actin (作为内参照)。SCAD上游引物为5' -CGAGATTGGCGAAGATTACAT -3'，下游引物为 5'-AGGCTTTGGTGCCGTTGA-3'。PPARa 上游引物为 5'- CCT GGC AATGCACTGAACATC-3'，下 游引物为 5' -ACGCCGTTGGCTACCATC TTG-3'。ANF 上游引物为 5' -GGAAGTCAACCCGTCTCA-3'， 下游引物为 5' -AGC CCT CAGTTTGCTTTT-3'。BNP 上游引物为 5' -TTTGGGCAGAAGATAGACCG -3'，下游引物为 5' -AGAAGAGCCGCAGGCAGAG-3'。a -SkA 上游引物为 5' -CAG GCGGTGCTGTCTCTCTAT-3'，下游引物为 5' -GGCAGGGCATAACCCTCATA -3'。β -actin 上游引物 为10\1311打6『5 4 1^，(1犯13(10臟〇1/1)14 1^，正反向引物各0.5 4 1^，丁&1酶0.5 4 1^， SYBR Green 25 yL，DEPC-H20 19.0 yL 混匀。PCR 反应条件为：94 °C 预变性 5 min，94 °C 变性30 8,60.4°(：退火30 8,72°(：延伸30 8，共反应31个循环。481?481117300305软 件记录数据并分析，将目的基因的Ct用β-actin的Ct值进行标准化，根据比较法计算基 因表达相对量，采用ΛΛ "计算基因表达的相对倍数变化。
[0051] 7、Western-blot 检测 p-ERKl/2、ERKl/2、PPARa、SCAD 蛋白的表达 配制12%的SDS-PAGE分离胶和5%的积层胶，每孔加入40 μ g蛋白样品，置电泳缓 冲液中，60 V电泳约30 min，待样品进入分离胶后，120 V电泳至所需时间。将蛋白转印至 PVDF膜，用5%脱脂奶粉于室温封闭2 h，加相应的一抗。4 °C孵育过夜，次日TBST洗膜 3次，每次5 min，再加相应二抗室温孵育I h，发光剂孵育6 min，曝光、显影、定影，结果用 Labwork凝胶图像分析系统对条带进行分析。
[0052] 8、SCAD酶活性的检测 按照实验分组处理细胞，收集细胞后置于冰上裂解30 min，取上清液用BCA蛋白定量 试剂盒定量蛋白。酶活性检测是基于2,6-二氯靛酚钠作为人工电子受体，替代黄素腺嘌呤 二核苷酸，在SCAD的作用下，由短链酰基辅酶A提供的电子，经过硫酸甲酯吩嗪的传递，被 还原为无色产物，通过分光光度仪的峰值变化（600 nm波长)，来定量分析SCAD的活性。严 格按照SCAD酶活性检测试剂盒说明书进行。
[0053] 9、心肌细胞活力的检测 用MTT比色法测定心肌细胞活力。按照5 X IO4每孔的浓度将心肌细胞接种于96孔 板，按实验分组给予相应的处理因素，每组设6个复孔。处理终止后吸去原培养基，每孔 加入MTT溶液(浓度为5 g/L) 20 μ L，于5% C02、37 °C继续孵育4 h后，每孔加入150 yL的DMS0,摇床上震荡10 min使蓝紫色结晶甲瓒充分溶解，在酶标仪570 nm处测其 OD值并计算各组细胞存活率。
[0054] 10、流式细胞仪检测细胞凋亡 用0. 25%不含EDTA胰酶消化贴壁心肌细胞，1000 rpm，5 min离心收集细胞，用PBS漂 洗细胞两次，用500 μ L结合缓冲液重悬细胞并调整细胞浓度。应用Annexin V/PI试剂盒 进行双标。应用流式细胞仪检测心肌细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻情况，计算凋亡细胞的百分 比。
[0055] 11、统计分析 所有的数据以均数土标准差（mean土SD)表示，采用SPSS13