lmmol/L的NaOH中，水浴加热 至70°C，制备150mmol/L的混合脂肪酸储存液。用双蒸水37°C溶解牛血清白蛋白（BSA)配 制成10%储存液，过滤除菌。将150mmol/L脂肪酸储存液溶于10%的牛血清白蛋白中得到 lOmmol/L的脂肪酸使用液。然后，将上述的lOmmol/L脂肪酸使用液稀释于RPMI-1640/1% (W/V)中，以获得所需脂肪酸的最终浓度，滤器过滤除菌。
[0049] (5)MTT溶液的配制
[0050] 称取MTT150mg，置于30mL的PBS中，用磁力搅拌器搅拌约30min，在超净工作台 用0. 22ym滤膜过滤以除去溶液里的细菌，EP管分装，放-20°C保存备用。
[0051] (6)油红0母液的配制
[0052] 用电子天平称取0.5g油红0粉末，置于1个200mL广口瓶中，向广口瓶中加入 IOOmL异丙醇，摇匀溶解，室温保存。
[0053] (7)油红0工作液的配制
[0054] 配制好的油红0工作液要在2h内用完，所以应该现用现配。配制时，取适量油红 〇母液与蒸馏水按体积比3 :2混合，将混合液用定性滤纸过滤，待用。
[0055] (8) 12%SDS-PAGE分离胶的配制（以配制IOmL为例）
[0056]取1支15mL离心管，向离心管内分别加入3. 3mL蒸馏水、4.OmL30%丙烯酰胺、 2.5mL1.5MTris(pH8.8)、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵，最后加4yLTEMED，吹打 混匀，加入TEMED以后要尽快使用。
[0057] (9) 5%SDS-PAGE浓缩胶的配制（以配制3mL为例）
[0058] 取1支15mL离心管，按适当比例向离心管内加入2.ImL蒸馏水、0.5mL30% 丙烯酰胺、〇.3811^1.0111^8化册.8)、0.031^10%303、0.031^10%过硫酸铵，最后加 3yLTEMED，吹打混匀，加入TEMED以后要尽快使用。
[0059] 二、实验方法
[0060] 1、细胞培养：L02细胞的细胞冻存液融化，并在细胞培养液中于37°C、5%C02的 恒温培养箱内进行培养，细胞培养的大部分操作需要在细胞培养室的超净工作台内完成， 操作开始之前先用75%的酒精擦拭细胞培养室和超净工作台，然后用紫外灯照射消毒 30min〇
[0061] 2、非酒精性脂肪肝细胞模型构建
[0062] 2. 1脂肪酸浓度的选择
[0063] 采用MTT比色法检测不同浓度的脂肪酸（0A:PA= 2:1)对细胞活性的影响。
[0064] (1)将L02细胞用胰酶消化，用RPMI-1640培养液终止消化。800r/min离心5min， 弃去上清液，加入1640培养液制成细胞悬液。计数后按4XIO4个/mL的细胞密度接种于 96孔板，置于37°C、5%CO2的培养箱中培养。
[0065] (2) 24h后各组按上述方法加入含不同浓度脂肪酸的培养液，每组设6个复孔。
[0066] (3) 24h后弃去含脂肪酸的培养液，每孔加入RPMI-1640180yL、5mg/mLMTT 20yL/孔，37°C继续孵育4h，使MTT还原为甲臜后，弃去旧液，每孔加DMSO150yL，微量振 荡器震荡l〇min，使甲臜充分溶解后。
[0067] (4)酶标仪选择波长为490nm，测定各孔吸光度即OD值。
[0068] 2. 2脂肪肝细胞模型的建立
[0069] 接种L02细胞于6孔板中，待细胞贴壁生长24h后，对照组加入含1 %BSA的 RPMI-1640培养液，模型组加入不同浓度的OA与PA的脂肪酸混合液（OA:PA= 2:1) (0. 25mmol/L, 0. 5mmol/L,lmmol/L)，培养24h后，测定细胞脂质含量，确定建模最佳脂肪酸 浓度。
[0070] 3?实验分组
[0071] 细胞接种于6孔板中，用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养24h后，将细胞分为3 组，分别为对照组（1 %BSA的无血清RPMI-1640培养基），模型组（lmmol/LFFA)，加入复合 保肝中药（本实施例中保肝中药包括壳寡糖5g、红景天苷10g、白藜芦醇6g、4下青素15g和 刺参糖胺聚糖l〇g)，继续培养24h。
[0072] 4?油红0染色
[0073] (1)当6孔培养板内细胞贴壁后，对照组加1 %BSA的RPMI-1640培养液，模型组 加入lmmol/L脂肪酸，所述复合保肝中药组在脂肪酸的基础上给予0. 5mg/mL所述复合保肝 中药，继续培养24h。
[0074] (2)吸出孔内的培养液，加PBS液清洗2遍，吸尽PBS液。向每个培养孔内加入3mL 4%多聚甲酉全固定液，室温静置20min。
[0075](3)吸出多聚甲醛固定液，向每个培养孔内加入ImL0. 5 %油红0工作液，室温静 詈15min〇
[0076] (4)吸出油红0染液，用清水洗净染液，向每个培养孔内加入ImL苏木精染液，室温 静置lOmin。
[0077] (5)吸出苏木精染液，用清水洗净染液直至视野变蓝，置于倒置显微镜下观察，收 集图像。
[0078] 5.测定细胞内的甘油三酯含量
[0079] 将细胞接种于6孔板中，待细胞融合至70%时，对照组、模型组、所述复合保肝中 药组分别给予相应处理，24h后用PBS轻柔冲洗3遍，加入裂解液裂解细胞，收集细胞放于 1.5mLEP管中1500rpm离心5min，吸取上清液待测。按照甘油三酯（组织细胞）酶法测定 试剂盒说明书，采用经典GPOTrinder反应，用酶标仪在570nm波长处测其吸光度值，吸光 度值与甘油三酯浓度成正比，以此计算甘油三酯浓度。同时用BCA法蛋白定量试剂盒测定 总蛋白浓度并对细胞内甘油三酯数值进行校正。所得数值为甘油三酯浓度与细胞总蛋白浓 度的比值，单位用mg/mg表示。
[0080]6.Hochest荧光染色
[0081] 将L02细胞接种于6孔板中，脂肪酸组加入2mmol/L脂肪酸，所述复合保肝中 药组在2mmol/L脂肪酸的基础上给予0. 5mg/mL所述复合保肝中药，对照组加1 %BSA的 RPMI-1640培养液。24h后将细胞用PBS洗涤两次，用4%多聚甲醛处理lOmin，并用IOyg/ mL的Hoechst33258染色lOmin。用荧光显微镜观察，拍摄照片。正常细胞，细胞核会出现 弥漫均匀的低强度荧光；凋亡细胞，其细胞核呈浓染致密的固缩形态或者颗粒状荧光。
[0082] 7?统计学分析
[0083] 所有数据以均数土标准差表示，采用SPSS17.O统计软件进行统计分析。各 组数据间比较采用One-WayANOVA分析，组间两两比较采用SNK法，P〈0. 05为差异有统计 学意义。
[0084] 三、实验结果
[0085] 3. 1所述复合保肝中药对L02细胞增殖的影响
[0086] 实验结果表明（表1):所述复合保肝中药中浓度为0? 025、0. 05、0.lmg/mL的各种 组分作用于L02细胞24h后，细胞存活率未见明显降低，表明该浓度的组分对细胞的生长无 明显影响。当浓度为〇. 2mg/mL时，细胞活力开始减退，故选取0. 025mg/mL作为壳寡糖等5 种（0.025X5mg/ml)有效成分干预脂肪变肝细胞的最适浓度。
[0087] 表1不同浓度所述复合保肝中药对L02细胞存活率的影响（％ )
[0088]
[0090] 3. 2所述复合保肝中药对L02脂肪肝细胞模型的影响
[0091] I.Ommol/LFFA混合液诱导细胞脂肪变性作为模型组，同时处理组还给予0. 5mg/ mL所述复合保肝中药刺激，24h后油红0染色显示：对照组仅见胞质内少量橘红色脂滴，而 模型组细胞内脂滴数量增多，且出现脂滴融合现象，成功建立肝细胞脂肪变模型（图1)。 给予所述复合保肝中药的处理后可见脂滴数减少。另外，通过检测细胞内TG的量来进行 定量分析。如表2所示，模型组和对照组相比，TG含量明显增高（P< 0. 05);给予0. 5mg/ mL所述复合保肝中药处理24h后，细胞内TG含量和模型组相比降低，差别有统计学意义（P < 0? 05)〇
[0092] 表2所述复合保肝中药对L02细胞甘油三酯含量的影响（mg/mg，i±s)
[0093]
[0094] 注：a与对照组相比，P<0? 05 ; b与模型组相比，P<0? 05
[0095] 3. 3所述复合保肝中药抑制脂肪酸诱导肝细胞的凋亡
[0096] 为了从形态学的角度直接观察L02细胞的凋亡情况以及所述复合保肝中药对其 凋亡的影响，对各实验组细胞进行了核染色。结果发现，对照组L02细胞染色质分布较均 匀，为弥漫均匀的低强度荧光；脂肪酸处理24h后，细胞呈现出典型的凋亡特征，大量的细 胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状