荧光；而所述复合保肝中药干预组中细胞核呈固缩或 颗粒状荧光的凋亡细胞明显减少。由Hoechst染色，我们进一步证实了所述复合保肝中药 可缓解游离脂肪酸诱导的细胞凋亡，保护脂毒性引起的细胞损伤（图2)。
[0097] 本发明中构建了肝细胞脂肪变模型，同时用所述复合保肝中药处理细胞模型，结 果发现所述复合保肝中药可降低肝细胞内TG含量。
[0098] 实施例2、所述复合保肝中药治疗非酒精性脂肪肝体内实验
[0099] 一、实验材料
[0100] 1. 1实验动物
[0101] C57BL/6J雄性小鼠购自北京维通利华公司，SPF级，体重18-22g。所述复合保肝 中药购自大连中科格莱克生物科技有限公司。实验动物饲养于SPF级标准实验室条件下， 保持良好通风，环境温度控制在23°C± 2°C，湿度控制在40 %~50 %，12h光照/12h黑暗循 环周期，自由摄取食物和水。在研究开始前适应性喂养小鼠正常饲养1周，自第2周开始实 验。
[0102] 1.2饲料配方
[0103] 基础饲料中10 %的能量来自脂肪，70 %来自碳水化合物，20 %来自蛋白质。高脂饲 料中45 %的能量来自脂肪，35 %来自碳水化合物，20 %来自蛋白质。
[0104] 二、实验方法
[0105] 2.1动物处理
[0106] 将18只健康雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，随机分为3组：正常对照组， NAFLD模型组及所述复合保肝中药治疗组，每组6只。对照组饲以普通维持饲料；其余两组 饲以高脂饲料。所述复合保肝中药组在高脂饲料的基础上腹腔注射每日200mg/kg的所述 复合保肝中药。正常组和模型组小鼠腹腔注射等体积0.9%的生理盐水。每周对各组小鼠 进行称重，仔细观察并记录老鼠的体重、毛发色泽、饮食、粪便、活动及死亡情况。处理16周 后，测体重，将小鼠禁食12h，乙醚麻醉后处死小鼠。迅速分离肝脏，一部分固定于多聚甲醛 中制作切片，观察肝脏病理改变；一部分肝脏包埋于OCT中制作冰冻切片，进行油红0染 色观察肝细胞脂肪变性程度；其余-80°C冻存，用于测定肝脏TG含量，结果以mg/g肝组织 表示。取血置于离心机中3000r/min离心lOmin，分离血清，测定血TG，_80°C保存。
[0107] 2. 2小鼠肝脏组织油红染色
[0108] 实验结束后处死小鼠，迅速取出肝脏，观察小鼠肝脏的质地、色泽，用生理盐水冲 洗，然后取肝大叶同一部位部分肝组织，包埋于OCT中，快速冰冻，制作冰冻切片，每张切片 厚度为10ym，进行油红0染色，光镜下观察肝脏脂质浸润情况。
[0109] 2. 3小鼠肝脏组织的HE染色
[0110] 取10%中性甲醛溶液固定好的肝组织，经过常规石蜡包埋，连续切片，制成5ixm 的石蜡切片；将石蜡切片常规脱蜡至水；苏木素染色IOmin;水洗、分化、反兰、水洗；伊红染 色30s;脱水、封片、光镜下观察肝组织的形态结构。
[0111] 2. 4肝脏组织甘油三酯（TG)测定
[0112] 2. 4. 1组织裂解：离心管精确称重，加入肝组织块后再称重，二者相减（即减量称 重法）精确计算肝组织重量约50mg。按每Img组织加20y1裂解液的比例加入裂解液，用 匀浆器破碎组织使组织充分裂解。取500y1裂解液转移到I. 5mL离心管，70°C加热lOmin， 组织量多时可能出现絮状沉淀。室温2000rpm离心5min，上层清液用于酶学测定。
[0113] 2. 4. 2配制工作溶液：R1与R2试剂按4:1比例混合，立即使用。
[0114] 2. 4. 3标准品稀释：4mmol/L甘油标准品用蒸馏水或与样本缓冲液一致的液体倍 比稀释为1000、500、250、125、62. 5、3L25、15. 625yM。注意设置0浓度对照反应管。
[0115] 2. 4. 4甘油三酯测定：参见下表加样测定标准品和样品。以96孔微板为例，IOiil 为起始加样量。37°ClOmin，反应平衡后，测定各管OD值。绘制标准曲线并计算甘油三酯 浓度。
[0116] 表3加样比例
[0117]
[0118] 2. 5统计学处理
[0119] 采用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据以均数土标准差表示，各组数 据间比较采用One-WayANOVA分析，组间两两比较采用SNK法，P〈0. 05被认为差异有统计 学意义。
[0120] 三、实验结果
[0121] 3. 1 -般情况及体质量比较
[0122] 对照组小鼠进食、生长正常，皮毛整洁，毛色润泽，活动度好，无死亡。模型组小鼠 进食正常，毛色偏暗，体重增加明显，体型增长明显较其他各组快，与正常对照组比显著性 差异（P< 0. 05)。所述复合保肝中药治疗组的小鼠活动度较好，毛色略有改善，与模型组相 比体质量下降，但差异无统计学意义（P>〇. 05)。（见表4)
[0123] 表4各组小鼠体质量的比较（X±S:):
[0124]
[0126] *与对照组比较P< 0. 05
[0127] 3. 2所述复合保肝中药对小鼠肝脏病理学及肝脏脂质沉积的影响
[0128] 小鼠肝脏HE染色显示高脂模型组小鼠肝细胞较对照组体积增大，排列紊乱，发生 明显脂肪变性；而所述复合保肝中药组肝细胞形态较正常，可见轻度脂肪变性（图3)。油 红0染色示对照组小鼠肝脏肝细胞中有少量红染颗粒，脂质沉积不明显；高脂组小鼠肝细 胞内出现大量的红染脂滴，胞核被推向周边，脂质异常沉积。所述复合保肝中药可降低肝细 胞内红染脂滴体积及数量（图4)。
[0129] 3. 3所述复合保肝中药对小鼠肝脏TG的影响
[0130] 所述复合保肝中药对小鼠肝脏TG的影响如图5所示，模型组肝脏TG含量均明 显高于对照组（P〈〇. 05)，而所述复合保肝中药组TG含量低于模型组，差异有统计学意义 (P〈0. 05) 〇
[0131] 所述复合保肝中药处理后小鼠肝细胞脂肪变程度明显减轻，TG含量降低。这些结 果表明所述复合保肝中药能减轻高脂小鼠肝脂肪变性，降低肝内TG含量，对NAFLD的治疗 有重要的临床指导意义。
[0132] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实 例对本发明进行了详细的说明，对本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所 记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并 不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，其特征在于所述复合保肝中药包括 以下组分，以重量份计：壳寡糖2-10重量份、红景天苷3-20重量份、白藜芦醇5-10重量份、 4下青素1〇 _20重量份和刺参糖胺聚糖5-15重量份。2. 根据权利要求1所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，其特征在于：所 述复合保肝中药包括以下组分：壳寡糖5g、红景天苷10g、白藜芦醇6g、虾青素15g和刺参 糖胺聚糖l〇g。3. 根据权利要求1所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，其特征在于：所 述复合保肝中药包括以下组分：壳寡糖8g、红景天苷5g、白藜芦醇6g、虾青素IOg和刺参糖 胺聚糖5g。4. 根据权利要求1所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，其特征在于：所 述复合保肝中药包括以下组分：壳寡糖2g、红景天苷8g、白藜芦醇8g、虾青素20g和刺参糖 胺聚糖5g。5. 根据权利要求1所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，其特征在于：所 述复合保肝中药包括以下组分：壳寡糖5g、红景天苷10g、白藜芦醇10g、虾青素18g和刺参 糖胺聚糖15g。
【专利摘要】本发明提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝的复合保肝中药，它包括以下组分，以重量份计：壳寡糖2-10重量份、红景天苷3-20重量份、白藜芦醇5-10重量份、虾青素10-20重量份和刺参糖胺聚糖5-15重量份。本发明通过NAFLD小鼠模型体内外实验，通过细胞及分子生物学方法确定了红景天苷、壳寡糖、白藜芦醇、壳寡糖和刺参糖胺聚糖5种生物活性成分经科学配比后，能够调节脂质代谢相关基因，具有显著降低NAFLD肝脏细胞内甘油三酯含量的作用，可以减轻脂肪酸诱导的细胞凋亡，可以减轻高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性，降低肝内TG含量，并且无明显副作用，无细胞毒性，不会破坏机体自身免疫平衡。
【IPC分类】A61K31/7032, A61K31/722, A61P1/16, A61K31/05, A61K31/702, A61K31/122, A61K31/737
【公开号】CN105030816
【申请号】CN201510504263
【发明人】辛永宁, 隋牮箐, 栾桂萍, 林中华
【申请人】青岛市市立医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月17日