含有富含类胡萝卜素的运动节杆菌提取物的化妆品、药物或食品组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种特别是用在化妆品中的运动节杆菌（Arthrobacteragilis)的提 取物，且更具体地，涉及一种富含类胡萝卜素的提取物。
[0002] 具体地，本发明依赖于检测到这种提取物能够通过保护蛋白质抵抗氧自由基 (R0S)和光（紫外光和可见光）辐射，以抵抗细胞（尤其是由外部侵害引起的皮肤）的改 变。因此，这种提取物（任选地与其他抗氧化剂结合）有助于抵抗包括细胞老化的氧化应 激。
【背景技术】
[0003] 在包括人的需氧生物中，氧气是生存所必需的，但也会导致与其活性代谢物有关 的氧化性损伤。因此，术语R〇S("活性氧簇"）或R0M("活性氧代谢物"）通常用于指所有的 自由基和非自由基化学形态（chemicalspecies)，它们参与氧化生物过程，且其过量被认 为是退化过程和疾病的数量增长的基础。更具体地，术语R0S包括超氧阴离子自由基02 ?、 羟自由基0H?、单线态氧丸和过氧化氢H202以及烷氧自由基R0 ?和过氧自由基R00 ?，它 们形成于氧化过程中的有机分子。这些代谢物的外源性产生基本上取决于物理活动（例如 紫外光辐射（UV))或化学活动（例如外源性物质）。反过来，内源性产生主要是由于线粒体 中电子在呼吸链中的泄漏。
[0004] 不管它们的形成过程，这些代谢物由于它们的高活性对机体是危险的，且它们的 活动影响多种细胞组分，这包括大量的结构蛋白、酶、氨基酸、DNA和RNA、糖类以及脂肪和 磷脂。
[0005] 需要注意的是，在紫外光辐射的情况下，除了产生反应活性组分，对细胞组分可能 存在更直接的物理损伤。因此，已知紫外线可诱导能引起DNA突变或断裂的胸腺嘧啶二聚 体。
[0006] 在过量产生活性代谢物的情况下，机体面临称作"氧化应激"的过程。
[0007] 为了保护自身免受这些代谢物引起的损害，机体已发展了抵抗氧化的防御系统， 以便减小这些物质的活性或中和它们。这些系统可以是蛋白质的，例如血清白蛋白（HSA)、 超氧化物歧化酶（S0D)、过氧化氢酶、氧化物酶或小肽，或者为非蛋白质的，例如泛醌、花青 素、黄酮类、脂溶性维生素（例如维生素A和E)和水溶性维生素（例如维生素C)。细胞也 具有修复系统和用于降解氧化的分子的系统。
[0008] 因此，为了抵抗氧化应激，可取的是采取富含天然抗氧化物质的饮食和服用含有 能中和活性反应组分的维生素的药物或保健品。在化妆品领域，将抗氧化剂掺入到许多产 品中以帮助抵抗由于氧化应激的过早衰老。
[0009] 因此，对掺入到保健品或化妆品组合物中的具有抗氧化活性的新分子或新提取物 的研究已经成为多年的主要挑战。
【发明内容】
[0010] 本发明依赖对源自具有大量抗氧化活性的极端微生物细菌的提取物的鉴定。除了 直接影响自由基，本发明还表明了这种提取物对由紫外光或可见光引起的损害具有特别的 效果，更通常的说，是对蛋白质的保护或稳定化效果，以及与已知抗氧化剂的协同作用。
[0011] 因此，本发明涉及一种细菌运动节杆菌（Arthrobacteragilis)的提取物，更具体 地，涉及一种从这种细菌中获得的富含类胡萝卜素的提取物。
[0012] 细菌运动节杆菌已经被例如Koch等（IntJSystBacteriol. 1995, 45(4) : 837-9) 所描述，并且能够容易识别，这是因为其16SRNA序列在数据库可以通过编号X80748获得， 且相当于以下的SEQIDN0:1 :
[0013]
[0014]
[0015] 因此根据特定形式的实施方式，所使用的菌株具有的16SRNA由具有与序列SEQ IDNO: 1超过90%或95%或99%或甚至为100%的同一性的序列（例如部分的序列SEQID NO:2)编码。
[0016] 根据特定形式的实施方式，这种提取物含有类胡萝卜素，优选富含类胡萝卜素。
[0017] 在本发明的上下文中，术语"类胡萝卜素"是指由其从红色到黄色范围的颜色和其 吸收光谱表征的脂溶性色素。它们属于萜类化合物的化学家族，具有多元不饱和的脂肪族 或脂环族的结构。
[0018] 如前所述，根据本发明的提取物含有类胡萝卜素，其可以为基于细胞膜的或细胞 质的。
[0019] 优选的，如例如由HPLC分析所证明的，本发明的提取物富含类胡萝卜素。类胡萝 卜素的最大吸收面积在400-600nm，更具体地在450-550nm，且通过它们在接近490nm波长 处的"3个指头"的吸收光谱是可辨认的。甚至更优选地，类胡萝卜素占超过50%、60%、 70 %、80 %或甚至90 %的提取物的质量。优选地，所述提取物不含蛋白质和/或DNA和/或 糖类。
[0020] 根据优选形式的实施方式，根据本发明的提取物含有不同形式的类胡萝卜素，优 选为包括不同异构体或糖基化形式的6种主要形式。
[0021] 优选的，根据本发明的提取物通过在以下条件下培养运动节杆菌获得：
[0022] 所使用的培养基通常为无盐的LB培养基，S卩，含有1重量％的胰蛋白 胨和0. 5重量％的酵母提取物。或者，可以考虑R2A(Koch等，1995,IntJSyst Bacteriol. 45(4) :837_9)和海生菌琼脂（BactoMarine)2216 培养基（Fong等， 2001，ApplMicrobiolBiotechnol. 56(5-6):750-6)〇
[0023] 所述细胞优选在包括20-30°C的温度（例如25°C)下培养。
[0024] 生长应发生在需氧条件下，优选在空气或纯氧气泡曝气（airoroxygenaeration bubble)下。
[0025] 根据本发明的提取物优选从稳定期的细胞中获得，S卩，通常在以上描述的条件下 生长3天后。
[0026] 为了获得所述提取物，细菌细胞经过提取/纯化实验步骤（protocol)以分离并纯 化所述类胡萝卜素。由于类胡萝卜素的脂溶性性质，获得本发明的主题的提取物优选依赖 于非极性相的分离。
[0027] 在第一步中，需要提取细胞膜和细胞质的组分，优选用除了脂类、蛋白质和DNA外 的试剂。适当地，使用极性溶液以"破坏"所述细胞膜并溶解大量亲水性和一些亲油性的分 子。
[0028] 因此通过示例的方法，可以使用丙酮、甲醇或丙酮和甲醇的混合物（例如以1/5的 体积）提取细菌颗粒（pellet)。
[0029] 在第二步骤中，加入极性溶剂（优选己烧）和饱和的盐水溶液（优选为饱和的NaCl溶液）使获得两相的混合物，S卩，一项为水相，另一项为对应本发明范围内的提取物的 非极性相。优选地，可以利用非极性溶液洗涤（如果必要的话多次）水相。
[0030] 随后将所述非极性相混合并在真空下蒸发。由此获得的提取物可以在冷处储存， 并可以冻结。
[0031] 根据此方法能够明显的看出，这是细菌提取物而不是培养上清液。
[0032] 根据第一种形式的实施方式，根据本发明的提取物以干燥形式的粉末使用。或者， 所述颗粒可以包括在任何适当的脂溶性相中。作为根据本发明的化妆品应用的部分，所述 提取物优选在油、丙二醇和微乳液中使用。
[0033] 能够容易地测量干燥的提取物重组的组合物的类胡萝卜素浓度，例如通过在DMS0 中测量512nm处或在丙二醇中测量502nm处的吸光度。
[0034] 注意的是，提取和纯化的不同阶段优选避光，在黑暗条件或半光下进行，以避免提 取物的任何恶化。
[0035] 由于在本申请的上下文以及以下讨论中所证明的显著性质，这种提取物能够特别 用在化妆品组合物、药物组合物或保健品中。
[0036] 根据第一方面，本发明涉及含有细菌运动节杆菌的提取物的化妆品组合物。根据 优选的实施方式形式，所述化妆品组合物含有细菌运动节杆菌的提取物，其富含类胡萝卜 素。
[0037] 根据本发明的化妆品组合物优选为外用的，旨在用在皮肤上并可能用在头发上。 所述组合物可以含有任何通常用在化妆品中的原料或赋形剂。换言之，其含有至少一种化 妆品上可接受的赋形剂，用在这种组合物中的所有赋形剂一定是化妆品上可接受的。
[0038] 注意的是，特别不考虑甲醇为化妆品上可接受的赋形剂。因此，根据具体形式的实 施方式，根据本发明的化妆品组合物不含有甲醇。
[0039] 所述组合物可以是洗液、乳膏、凝胶、喷雾剂的形式或任何其它形式。
[0040] 根据特定形式的实施方式，所述组合物具有粉红色的（pinkish)颜色。
[0041] 根据另一方面，本发明涉及含有细菌运动节杆菌的提取物的药物组合物。根据优 选形式的实施方式，所述药物组合物含有细菌运动节杆菌的提取物，其富含类胡萝卜素。
[0042] 根据本发明的药物组合物可以特别旨在用于外用给药（topical)或口服给药。所 述组合物可以含有通常用在药剂学中的任何原料或赋形剂。换言之，其含有至少一种药学 上可接受的赋形剂；用在这种组合物中的所有赋形剂一定是药学上可接受的。
[0043] 注意的是，特别不