悬浮。随后加入NaCl (氯化钠）的饱和溶液直到一项为水相和另一项为非极性相的两相混 合物分离。优选地，使用己烷再次提取水相且将己烷项混合。
[0112] 所述非极性相或己烷相优选在真空下于25°C蒸发。
[0113] SBE提取物可以在_20°C保存或可以米取为溶液，例如在DMS0(二甲基亚讽）或 THF(四氢呋喃）或丙二醇中以在活细胞上测试，且高度溶解在二氯甲烷和丙酮中。
[0114] 通过测定在DMS0中的512nm或丙二醇中502nm的吸光度确定类胡萝卜素的浓度。
[0115] 所述提取物的HPLC光谱和所有六个主峰中的每一个的吸收度光谱如图2所示。这 些光谱与文献数据（Fong 等，Appl Microbiol Biotechnol (2001)56:750-756)的比较显示 所述提取物含有显著量的类胡萝卜素，具有在490nm处的3个"手指"的特征吸收光谱。如 Fong 等（Appl Microbiol Biotechnol (2001) 56:750-756)所描述的，吸收光谱也显不存在 这些类胡萝卜素的糖基化形式和不同异构体。
[0116] 3、SBE提取物的活件
[0117]3-1. ABTS 试验
[0118] 如以上提到的，通常用于化妆品和农业食品行业的这种试验以纯化学方式有助于 建立提取物的"总抗氧化能力"。尽管这种试验是不完整的（因为其测定仅当处理特定种类 的自由基时的提取物的抗氧化活性），但通过用Trolox的标准化方式，其具有产生与以这 种方式测试的数以千计的其他分子可比较的结果的优点。
[0119]如 Re等，FreeRadic.Biol.Med.(1999) 26 (9-10): 1231-7 描述的进行这种试验。
[0120] 图3显示了根据本发明的提取物（SBE)显示了比参照抗氧化剂Trolox高出超过 4倍的抗氧化能力。
[0121] 在本发明的上下文中，对应所测试产品的摩尔数的Trolox当量有助于获得对于 lmol Trolox的有效当量。根据本发明的提取物使用类胡萝卜素作为提取物的标识进行量 化。因此，如通过在对应最大吸收的波长处并扣除类胡萝卜素的摩尔消光系数的吸光度测 量的，lmol的SEB提取物对应lmol的类胡萝卜素。
[0122] 3-2.针对自由基对蛋白质的保护
[0123] 在自由基（尤其是羟基（0H))和化合物或提取物的存在下，该测试包括在405nm 处测定碱性磷酸酶（AP)的活性，以便评估所述化合物或提取物面对蛋白质的保护能力。
[0124] 材料和方法
[0125] 试逝
[0126] 缓冲液："Tris缓冲盐水"粉末（Sigma ;产品货号：T6664-10PAK);
[0127] 酶
[0128] 溶于缓冲甘油溶液中的125U/ y L的碱性磷酸酶10KU(Sigma ;产品货号：P0114);
[0129] 氣化剂
[0130] 1、30%或9M的过氧化氢（Sigma ;产品货号：H1009-5ML):溶液B1 ;
[0131]2、0. 1M的七水硫酸亚铁（FeS04,?7H20)(Fluka;产品货号：44970):溶液 B2;
[0132] 基质
[0133] 4-硝基苯基磷酸（"碱性磷酸酶黄色基质"；Sigma;产品货号：P7998-100ML)。
[0134] 试剂盒
[0135] -96 孔板；
[0136] -缓冲液：20ml 的 TBS 溶液-0? 05M、pH 8 ;
[0137]-溶液A(酶）：在缓冲液中稀释度为1/1000的10yl(或1.25U，即0?125U/yL) 的储备原液；
[0138] -100 y 1的溶液B1和100 y 1的溶液B2或在缓冲液中适当稀释的对应溶液B1和 B2的混合物的溶液B (例如由30 y 1溶液Bl+30 y 1溶液B2,即，1/100稀释度获得的3ml的 90mM的溶液B);
[0139] -溶液C (基质）：5ml的市售溶液。
[0140]实验步骤
[0141]-以适当的稀释度在缓冲液中稀释溶液A;
[0142]-在每个孔中插入10 y 1所稀释的溶液A，以便具有0. 005-0. 05U的酶量；
[0143]-加入10 y 1待测的产品或提取物，任选地在每个孔中的缓冲液中稀释。单个孔能 够用于测试稀释的范围；
[0144]-在每个孔中加入30 y 1的溶液B。调整溶液B的浓度以获得90%存在的酶量的 失活。最终的氧化剂的浓度等于溶液B浓度的30%;
[0145] -不进行搅拌下在37°C孵育15分钟；
[0146] -加入50 y 1的溶液C。因此使反应体积等于100 y 1 ;
[0147]-搅拌下将所述平板放置于37 °C;
[0148]-在405nm处读取吸光度，进行20分钟（运动的）或反应5分钟后（选择性的）。
[0149] MM.
[0150] 图4A显示了根据本发明的提取物（SBE)具有抵抗自由基以保护蛋白质的能力，比 Trolox高约100倍，且比测试的所有抗氧化剂高出超过6倍。该结果与通过ABTS测量的抗 氧化潜能之间的差异证明对蛋白质的保护不仅是与SBE的抗氧化能力相关。
[0151] 此外，使用相同的技术比较了与HPLC识别的与6个主峰对应的6个部分（分等级 为SB1-SB6)与总提取物SBE的效果。
[0152] 从图4B明显看出SBE提取物针对游离蛋白质自由基具有比其包括的每个峰高出 2-4倍的保护能力，并证明了提取物的各个部分之间的协同效果。
[0153]3-3.保护蛋白祗抗UV
[0154] 该测试与之前部分中描述的相似。其包括：在化合物或提取物的存在下，在405nm 处测定使用UV-C(254nm)辐射的碱性磷酸酯（AP)的活性，以便评估对所述化合物或提取物 的蛋白质的保护能力。
[0155]材料和方法
[0156] 将碱性磷酸酶暴露于254nm的UV (对应UV-C)辐射。在连续搅拌下，将导致90% 酶失活的UV剂量用于反应介质并在与前述类似的那些条件下。注意被氧化剂占据的体积 用缓冲液代替。在实践中，使用功率等于〇, 〇365J/cm2/min的灯具，暴露时间为1或2小时。
[0157]
[0158] 图5显示根据本发明的提取物（SBE)具有保护蛋白抵抗UV的能力，其比Trolox 的高出300倍且比测试的所有的抗氧化剂几乎高出40倍。
[0159] 根据本发明的提取物的这种非常强的保护能力可以通过提取物中存在的多种组 合效果解释：
[0160] -中和由UV产生的单线态氧〇02)的效果；
[0161]-通过直接吸收UV的"屏幕"、"滤波器"或"屏蔽"的效果；
[0162] _传统的抗氧化效果，S卩，中和由单线态氧（i〇2)产生的自由基。
[0163]3-4.对蛋白质的保护
[0164] 无氧化应激而在提高根据本发明的提取物（SBE)浓度的存在下，测定碱性磷酸酶 的活性。
[0165] 图6显示了在根据本发明的提取物（SBE)以非常低的剂量的存在下，AP活性提高 了。这种提高可能是由于在培养和搅动期间对酶的保护。也可以认为在-20°C储存的酶的 一些氧化作用被SBE提取物降低了，这通过"恢复活力"可以提高其活性。
[0166] 以图6为基础，根据本发明的提取物（SBE)的适当浓度为0.001-100 ym，优选为 0. 1-1 yM。然而，这些是在皮肤的靶细胞会获得的浓度。因此，在化妆品组合物中的浓度一 定大大高出关于皮肤渗透所占据的损失。
[0167] 所述酶与提取物之间的相互作用可能是这种"助推（boosting)"行为的原因。推 而广之，根据本发明的提取物有可能保护机体中的蛋白质，尤其是直接参与保护机体抵抗 氧化应激或修复氧化损伤的那些。
[0168] 3-5.与其他抗氣化剂的协同作用
[0169] 为了鉴定可以提高根据本发明的提取物（SBE)的蛋白质保护效果的抗氧化剂，在 3-2部分描述的测试通过将根据本发明的提取物（SBE)与十二种已知抗氧化剂混合（单独 采取）进行。有必要鉴定与根据本发明的提取物（SBE)结合的分子的抗氧化效果或者以突 出超越加性效应的协同效应。这种混合物的另一优点是根据本发明的提取物（SBE)的可能 稳定性。
[0170] 图7显示了在测试的所有氧化剂的存在下，尤其是Trolox的存在下，根据本发明 的提取物（SBE)具有强大的协同作用，这显著提高了（通过是Trolox的5倍）其抵抗自由 基的蛋白质的保护能力。
[0171] 3-6.人细朐的保护
[0172] A、彗星试验
[0173] 为了证实根据本发明的提取物（SBE)对人细胞的保护，通过如0stling，0. 和 K.J.Johanson. (Biochemical and biophysical research communicatio nsl23. 1 (1984):