W)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0044] 2?病理学检测 2. 1制备石蜡标本切片 主要操作程序包括修剪心脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0045] 2. 2苏木精-伊红（HE)染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min-二甲苯5min，3次一100%酒精Imin- 95%酒精Imin- 70%酒精Imin-双蒸水Imin-苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min-水洗Imin- 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL70%酒精充分混合均匀）l-3s- 水洗Imin-Scott液(碳酸氢钠0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于IOOmL蒸馏水)Imin-水 洗Imin-伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3-5min-蒸馏水洗去浮色一70%酒精Is- 95% 酒精Is- 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹 干，显微镜拍照。
[0046] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-ProPlus6. 0软件圈细胞面积。
[0047] 2. 3麦胚凝聚素（WGA)染色 主要步骤：将经60°C烘烤30min的石蜡标本切片置于二甲苯5minX3次一100%乙 醇5minX2次一95%乙醇5min- 70%乙醇5min-蒸馏水漂洗5minX2次一PBS漂洗 5min-PBS漂洗IOmin-弃去PBS，滴加胰酶工作液（DIG-3008,福州迈新）37°C避光孵育 20min-PBS漂洗5minX3次一取出切片，用滤纸擦干组织周围的液体(组织切勿干燥)，用 组化笔划圈平放于湿盒中一滴加WGA-AlexaFlour488工作液（IOyg/mL)37°C避光孵育 2h-弃去染液，PBS漂洗 5minX3 次一SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI封 片一焚光镜下观察，显微镜拍照。
[0048] 2. 4天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：取石蜡标本切片55°C烘烤30min-二甲苯2min，3次一100%酒精Imin- 95%酒精Imin- 70%酒精Imin-流水冲洗IOmin-双蒸水Imin-质量分数0. 2%磷 钼酸2min- 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min-去除残液一0.OlN 盐酸4s- 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二 甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0049] PSR染色图片统计（Image-ProPlus6. 0软件):胶原比例=胶原面积八总面积-空 白面积）X100%。
[0050] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0051] WT及ABIN3-K0小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果见图1-3。Sham(假 手术)组中WT及ABIN3-K0小鼠的Hff/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小 鼠AB术后4周的Hff/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，ABIN3-K0小鼠的Hff/ BW、LW/BW及HW/TL均较WT小鼠上升（图1 )。HE及WGA染色切片可观察到：Sham组心脏无 明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，ABIN3-K0小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组 心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、 松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，ABIN3-K0组 则比WT组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图2)。PSR染色后，发现AB组心室心肌间质 胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状； ABIN3-K0小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量则比WT小鼠AB术后增加较 多（图3)。以上结果说明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ABIN3-K0小鼠的心肌 肥厚及纤维化程度大于WT小鼠。
[0052] 图5-7是NTG和ABIN3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后的表型结果。同样 NTG小鼠AB术后4周的Hff/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的Hff/ BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图5 )。HE及WGA染色切片可观察到：AB 组较Sham组的心脏均增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠；TG小鼠AB 术后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠AB组（图6)。PSR染色可见，TG小 鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量小于NTG小鼠AB组（图7)。以上结果说 明经AB术建模后，小鼠发生明显的心肌肥厚，ABIN3-TG小鼠的心肌肥厚及纤维化程度小于 NTG小鼠。
[0053] 实施例3心肌肥厚模型小鼠心功能检测 超声检测心功能 1.前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇? 2-0. 3mPa。
[0054] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0055] 2?心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用 高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径 (LVEDd)、射血分数（EF)及短轴缩短率（FS)。
[0056] 图4是WT和ABIN3-K0小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的超声检测结 果。与WTSham组相比，WT小鼠AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心 肌肥厚的指标LVEDd增加，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，ABIN3-K0小 鼠的心功能恶化程度大于WT小鼠。
[0057] 图8是NTG和ABIN3-TG小鼠采用AB术建立心肌肥厚模型后心功能的超声检测结 果。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指 标下降的程度则小于NTG组。
[0058] 由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，ABIN3基因缺陷 显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，ABIN3基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维 化，保护心功能。因此ABIN3基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是 ABIN3基因具有能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0059] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. A20结合的核因子抑制蛋白3在筛选保护心脏功能的药物中的应用。 2. A20结合的核因子抑制蛋白3在制备保护心脏功能的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：包括A20结合的核因子抑制蛋白3作为 保护心脏功能的药物的有效成分，能够促进A20结合的核因子抑制蛋白3表达的化学物质 作为保护心脏功能的药物的有效成分。 4. A20结合的核因子抑制蛋白3在筛选抗心脏纤维化的药物中的应用。 5. A20结合的核因子抑制蛋白3在制备抗心脏纤维化的药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括A20结合的核因子抑制蛋白3作为 抗心脏纤维化的药物的有效成分，能够促进A20结合的核因子抑制蛋白3表达的化学物质 作为抗心脏纤维化的药物的有效成分。 7. A20结合的核因子抑制蛋白3在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。 8. A20结合的核因子抑制蛋白3在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：包括A20结合的核因子抑制蛋白3作为 预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分，能够促进A20结合的核因子抑制蛋白3 表达的化学物质作为预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物的有效成分。
【专利摘要】本发明公开了一种A20结合的核因子抑制蛋白3（ABIN3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了ABIN3的表达与心肌肥厚之间的相互关系，研究结果表明抑制ABIN3表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能，促进ABIN3过表达则显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此，ABIN3可作为靶基因，用于筛选保护心脏功能、抗心脏纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，用于制备保护心脏功能、抗心肌肥厚和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【IPC分类】A61K45/00, G01N33/68, A61K38/17, A61K48/00, A61P9/00
【公开号】CN105194652
【申请号】CN201510633590
【发明人】李红良, 王丕晓, 张晓晶, 姬燕晓, 梅芳华
【申请人】武汉大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月29日