发明的目的在于提供一种检测帕金森的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因 C220RF26,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 9,下游引物序列为SEQ ID NO. 10。
[0021] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0022] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0. 9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 11，下游引物序列为SEQ ID NO. 12。
[0023] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TR丨zolS Reagent进行样本RNA提取。
[0024] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2c〇pieS/ μ 1，最小检出浓度为lOOcopies/ μ 1。
[0025] 本发明目的是提供了一种帕金森检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测C220RF26 蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0026] 本发明目的是提供了一种检测帕金森的基因芯片，所述的基因芯片包括与 C220RF26基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0027] 图1 C220RF26基因在帕金森外周血及健康人外周血中相对表达量图
[0028] 图2 RNA干扰后各组C220RF26mRNA表达水平
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0030] 实施例1高通量测序及分析
[0031] 分别收集15例帕金森患者外周血样本及9例健康人外周血样本，进行RNA提取， RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否 可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品的提取 情况，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280为L 8-2. 2。
[0032] 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录 组深度测序，测序后我们运用 Fast-QC (http: //www. bio informatics, babraham. ac. uk/ projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值 的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析 时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，L0G2FO1 或〈-1，FDR〈0. 05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了 Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴 于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因 C220RF26。
[0033] 实施例2帕金森患者外周血及健康人外周血中C220RF26基因表达情况
[0034] 一材料和方法
[0035] 1、材料
[0036] 收集135例帕金森患者外周血及33例健康人外周血，对其进行分组及编号。
[0037] 2、方法
[0038] 2. 1帕金森外周血及健康人外周血总RNA的提取
[0039] 采用TRlzoH)) Reagent进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行。
[0040] RNA质量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱 有清晰的28S、18S条带；70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差 异。
[0041] 2. 2逆转录合成cDNA
[0042] 米用 Supe丨'ScriplK III Reverse Transcriptase (invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0043] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1 μ g总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25 μ 1反应体系，每个样品取1 μ g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
[0044] 5X 逆转录缓冲液 5 μ 1，10mmol/l dNTP 1· 25 μ 1，0· lmmol/1 DTT 2· 5 μ 1， 30ymmol/l OligodT 2μ1，20〇υ/μ1 MMLV 1·25μ1，模板 RNA lyg，加入灭菌水至总体系 25 μ 1。42°C孵育1小时，72°C 10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20°C冰箱备用。
[0045] 2. 3 Real-Time PCR
[0046] 2. 3. 1仪器及分析方法
[0047] 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2- ΛΛ CT法进行数据的相对定量分析。
[0048] 2. 3. 2引物设计
[0049] 采用在线引物设计软件，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如 下：
[0050] 表1引物序列
[0052] 操作过程如下：
[0053] ( 一）反应体系：用 Power Green PCR Master Mix (invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95° 10min，（95°C15sec， 60°C 60sec) X45 个循环。
[0054] 表2 RealTime反应体系
[0056] (二）引物筛选
[0057] 将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2 μ 1作模 板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95Γ进行融解曲线分析，根 据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
[0058] (三）样品 RealTimePCR 检测
[0059] 将各样品cDNA 10倍稀释后取2 μ 1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60-95Γ进行溶解曲线分析。
[0060] 二实验结果
[0061] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物 溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公 式：2-ACtX 100%，比较C220RF26基因在帕金森患者外周血和健康人外周血中的表达水 平。结果显示（具体见图1) :qRT_PCR扩增结果稳定，其中C220RF26在帕金森外周血中的 表达水平高于健康人外周血中的表达水平，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合 分析C220RF26在帕金森患者外周血中高表达的结果。
[0062] 实施例3细胞系SN4741的培养
[0063] 一、材料
[0064] SN4741细胞获赠于第四军医大学。
[0065] 二、实验方法
[0066] 细胞培养
[0067] 首先配制SN细胞专用的培养基：在500ml的DMEM (4. 5g/L D-葡萄糖）额外加入 FBS 54ml，D-葡萄糖16. 2ml，L-谷氨酰胺3. 8ml及青/链霉素双抗。接着从液氮中取出冻 存的SN4741细胞，将其放入37°C水浴在lmin内迅速解冻，把细胞悬液吸出，移入加有配制 好的培养基离心管中，轻轻混匀吹打，1200rpm离心5min，去上清，继续轻柔均匀吹打成细 胞悬液后移至培养皿中，在33°C，5% C02100%湿度恒温培养箱中培养。当细胞贴壁后且密 度至75-85%时可进行传代，先移去原培养基，加入PBS 1 ml冲洗细胞2次，然后加入lml 胰酶消化液，静置于培养箱消化l_2min后取出观察见细胞悬浮，间距加大时，立即吸出胰 酶加入原配制的含10% FBS培养基终止反应，用吸管枪吹打均匀后移入离心管中，1200rpm 离心5