升高，能够比较温和、平稳的调节反应器内的pH值；而 行业内现用NaOH作为补料液，由于NaOH呈现强碱性，能够在一定程度上降低培养基的缓冲 能力，并且容易引起反应器内局部pH值迅速升高，不利于种细胞的生长；
[0039] 二、发明人经过研究发现，细胞反应器内的pH值呈酸性时，种细胞呼吸产生的C02等排泄物较难排出，排泄物长时间积累后，容易导致种细胞死亡；而细胞反应器内的pH值 呈碱性时，种细胞的生长速度慢，因此，发明人将pH值设置为6. 95-7. 15,为种细胞生长提 供较优的中性环境；
[0040] 三、发明人将溶氧浓度设置为45% -55%，溶氧浓度高，容易导致细胞反应器内pH 值呈碱性；溶氧浓度低，促使种细胞呼吸不畅，生长缓慢，导致种细胞进入无氧呼吸阶段，导 致细胞反应器内pH值呈酸性；
[0041] 四、细胞反应器内的温度高时，容易引起种细胞内的蛋白质变性，导致种细胞失去 活性死忙；相反，细胞反应器内的温度低时，导致种细胞内的各种酶活性降低，新陈代谢缓 慢，进而影响种细胞生长，因此，发明人将种细胞的生长温度设置为36. 5-37Γ ;
[0042] 五、细胞反应器内的压强低于外界大气压时，外界空气容易进入细胞反应器中，增 加污染率；细胞反应器内的压强明显高于外界大气压时，种细胞容易破裂，并且增加了氧气 通入难度，导致溶氧浓度过低，因此，发明人将压强设置为100-200mbar ;
[0043] 六、发明人将转速设置为60_90rmp，并且细胞反应器的转速按照前者转速的 10-20%逐级降低，种细胞借助体积不断增大的细胞反应器，实现逐级放大培养，伴随着体 积增大，在搅拌作用下，细胞反应器内产生涡流的维持时间加长，导致培养基、种细胞和补 料液等混合物的流动惯性增大，因此，需要逐级降低转速，另外，转速过快产生较大的涡流 剪切力，容易破坏种细胞。
[0044] 以上所述培养条件相辅相成，共同发挥作用，促使本发明培养出高密度的种细胞， 同时，发明人采用细胞种毒进行接毒，并将细胞反应器内的温度进行调整，为禽流感病毒的 生长提供合适的温度环境，促使本发明培养出高滴度的禽流感病毒，制得免疫效果显著的 疫苗。
[0045] 本发明的有益效果如下：
[0046] 1、本发明采用全悬浮培养MDCK-α -2,3Ga细胞技术生产禽流感病毒，提供了一种 全新的生产工艺，且生产出的禽流感病毒需要经过稀释后使用，具有成品疫苗质量高、有效 提高产量的特点。
[0047] 2、本发明使用无血清培养基，并且对种细胞的培养条件进行优选，显著提高了种 细胞密度，在接毒过程中接种细胞种毒，一次性完成培养过程，不需要更换培养基，有效减 少培养过程中的外源污染率，得到高滴度的禽流感病毒，具有简化培养过程、提高疫苗的免 疫效果、降低生产成本的特点。
[0048] 3、本发明对种细胞培养过程中的pH值、溶氧浓度、温度、转速和压强进行优选，为 种细胞创造较优的培养条件，同时发明人选用NaHC03作为补料液，能够温和调节pH值，避 免破坏种细胞，有助于种细胞生长，显著提高细胞密度。
[0049] 4、本发明培养的种细胞密度高，因此，可以实现7-2000L的生物反应器培养规模， 满足了规模化、工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。
[0050] 5、本发明在培养过程中向细胞反应器内流加不含钠离子的培养基，既能维持细胞 反应器内葡萄糖的含量，又不会改变溶液的渗透压，为种细胞提供良好的培养环境。
【具体实施方式】
[0051] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0052] 实施例一：
[0053] 本实施例中，所述无血清培养基的名称为:Bio-Engine?，所述细胞种毒的病原类 型为H5N1亚型，分支为Re-6株，所述流加培养基为无血清培养基的8倍浓缩液。
[0054] -种禽流感灭活疫苗生产工艺，所述生产工艺包括以下步骤：
[0055] 步骤一：采用无血清培养基全悬浮传代培养种细胞；
[0056] (1)将无血清培养基放置在36. 5°C水中，加热30min ;
[0057] (2)取1支MDCK-α -2,3Gal细胞冻存管，置于36. 5°C的水中，并震荡使其完全融 化，将细胞冻存管中的悬液转移至摇瓶中；
[0058] (3)在摇瓶中加入100ml的无血清培养基，初始细胞密度为0· 5X 106个/ml，并将 摇瓶转移至二氧化碳培养箱中培养，其中，二氧化碳的浓度为4% ;
[0059] (4)检测到摇瓶内细胞存活率为91%，且细胞密度为2X106个/ml时，将摇瓶内 的MDCK- α -2, 3Gal细胞无菌移种到7L细胞反应器进行培养，初始细胞密度为0. 5 X 106个 /ml ；
[0060] (5)检测到细胞存活率为91. 5%，细胞密度为4. 5 X 106个/ml时，将MDCK-α -2， 3Gal细胞无菌移种到130L细胞反应器培养，初始细胞密度为0. 5X 106个/ml ;
[0061] (6)检测到细胞存活率为93%，细胞密度为2X106个/ml时，将MDCK-α -2,3Gal 细胞无菌移种到650L细胞反应器培养，初始细胞密度为0. 5 X 106个/ml ;
[0062] (7)检测到细胞存活率为93. 5%，细胞密度为11. 6X106个/ml时，将MDCK-α -2， 3Gal细胞无菌移种到2000L细胞反应器培养，初始密度为0. 5X 106个/ml ;
[0063] 上述7L、130L、650L、2000L细胞反应器的校准方法如下：
[0064] (1)校准细胞反应器pH电极和p02电极，将无菌IN NaHCO 3补料液连接至细胞反 应器补料口；
[0065] (2)将细胞反应器及附属管道用纯蒸汽SIP 35min(彡121°C );
[0066] (3)调节细胞反应器的压强，设定pH值、温度、转速等参数，通入压缩空气校准溶 氧电极，溶氧稳定后进行溶氧斜率校准，设定溶氧参数；
[0067] 上述7L、130L细胞反应器内的培养条件为：pH值为6. 95,溶氧浓度为45%，温度 为36. 5°C，压强为120mbar，7L细胞反应器内的转速为90rmp，130L细胞反应器内的转速为 80rmp ；
[0068] 上述650L、2000L细胞反应器内的培养条件为：pH值为7. 0,溶氧浓度为50%，温 度为37°C，压强为150mbar，650L细胞反应器内的转速为70rmp，2000L细胞反应器内的转速 为 60rmp ;
[0069] 当各细胞反应器内葡萄糖含量低于3g/L时，向细胞反应器内流加不含钠离子的 流加培养基，初始细胞密度过低时，导致细胞群体效应差，细胞生长缓慢；
[0070] 步骤二：将步骤一培养的种细胞接种细胞种毒，培养禽流感病毒，制备制苗抗原；
[0071] (1)检测到2000L细胞反应器中细胞存活率为95%，且细胞密度为14.6 X106个/ ml时，领取H5N1亚型Re-6株细胞种毒，按照细胞反应器内培养基总体积的1 %，接入反应 器，种毒接种后，将细胞反应器的温度设置为39°C，并将转速降低40 %，维持2h，之后每6h 降低1°C，并将转速恢复至种毒接种时速度，细胞种毒接种23h后，每隔2. 5h采样检测病毒 含量、细胞密度和细胞活力，当病毒液血凝价为2048,细胞密度为2. 5X 106个/ml，且细胞 活力为2