用于作为佐剂使用的β-糖脂的制作方法
【专利说明】用于作为佐剂使用的β-糖脂 发明领域
[0001] 本发明涉及β -糖脂衍生物、其在疫苗中作为佐剂的制剂和用途。
[0002] 本发明发生于药物领域并特别发生于用于疫苗的佐剂领域。
[0003] 具体地，本发明涉及糖脂衍生物、及其在疫苗中作为适合于与用于细菌性和 病毒性疾病的抗原共施用的疫苗佐剂的用途。
[0004] 技术状态
[0005] 佐剂是当连同抗原一起施用时增强生物体的免疫应答的物质。疫苗制剂中使用 的佐剂旨在通过施用可能的最小量的抗原引发免疫应答，并因此避免源自暴露于大剂量抗 原的任何可能的风险。以该方式进行的疫苗程序促进能够以其特异性和记忆引发"二次应 答"的免疫记忆的形成，并允许生物体在重复暴露的过程中以较低效率和速度识别外源性 抗原。基于预形成的抗体的存在和对给定抗原的较大频率的细胞特异性的二次应答，允许 快速消除病原体（抗原衍生自该病原体），并防止由该病原体本身诱发的疾病所基于的生 理病理过程。因此，佐剂是疫苗制剂中的不可缺少的组分，并且事实上已是配制现代疫苗 制剂所必需的要求。例如，它们存在于抗甲型肝炎病毒和抗乙型肝炎病毒、抗人乳头瘤病毒 (HPV)、抗乙型流感嗜血杆菌（B-type Haemophilus influenzae)、抗肺炎球菌感染和抗许 多其他感染的疫苗制剂中。
[0006] 佐剂尽管增加免疫应答的持续时间和强度，对免疫系统既不引起特异性效应也不 引起持久效应。此外，它们还可被用于其他目的，诸如降低多组分疫苗的毒性或改善多组分 疫苗的稳定性。出于这些原因，佐剂的选择对使用通常包含天然或合成抗原物质以避免由 减毒或灭活的病原体的使用诱发的问题的现代疫苗通常是关键的。
[0007] 目前，更通常使用的人类疫苗的佐剂是铝盐，典型地氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝 钾。
[0008] 最近，先天免疫的原则已被用于开发新类别的佐剂，其包含多种类型的油乳剂或 脂质体、细菌产物诸如脂质A、病毒产物和皂苷。
[0009] 对于这些物质中的许多，尽管确切的作用机制是未知的，存在如下的证据：表明它 们通过先天免疫系统的细胞的募集效应和活化效应起作用、改进细胞处理和呈递抗原以特 别地目的在于引发特异性免疫应答或甚至特异性靶向机制或储存效应的能力。最近，鉴定 和开发新的佐剂的巨大推动力已通过降低包含高度纯化的抗原的疫苗和抗慢性病诸如例 如HIV、寄生虫疾病和某些肿瘤形式的疫苗中的毒性的需求来确定。
[0010] 已知α_磺基奎诺糖苷存在于所有光合生物体，诸如藻类和陆生植物 中。（Η. DANIEL 等，1961. The plant sulfolipid. Identification of 6-sulfo quinovose，JACS，83, 1765-1766 ;M. LEPAGEH 等，1961. The Plant Sulfolipid. Isolation and Properties of Sulfoglycosyl Glycerol, JACS，83, 157-159 ;Μ· ΜΙΥΑΝ0 等，1962. The Plant Sulfolipid. VI. Configuration of the Glycerol Moiety, JACS, 84, 57-58 ； L.Y.Okaya, 1964.The plant su 1 fo1 ipid: a crystallographic study.Acta Cryst. 17, 1276-1282 ;Frank D.等，The Lipid Handbook 第 3 版，CRC Press, Boca Raton, 2007, 123-128 页）。 toon]目前，因此存在对发现作为疫苗佐剂应用的生理学上可接受的物质的强烈需求。
[0012] 本发明的目的是发现适合于作为疫苗制剂中的药学上可接受的佐剂的物质。
[0013] 发明概述
[0014] 所述目的通过用于作为疫苗佐剂使用的具有式（I)的糖脂衍生物：
[0016] 其盐或金属络合物来实现，
[0017] 其中
[0018] 异头碳的缩醛键（acetalic bond)具有β (贝塔）构型，
[0019] AJP Α 2彼此独立地是饱和的或单不饱和的直链或支链的C「C3。烷基，或分别是酰 基-(CO) Ri和酰基-(CO) R 2，其中&和R 2彼此独立地是饱和的或单不饱和的直链或支链的 C「C29烷基，并且
[0020] X是磺酸基（_S03H)、硫酸基（_0S03H)、磷酸基（-opo3h 2)或膦酸基（-po3h2)。
[0021] 在另一个方面，本发明涉及包含至少一种式（I)的β -糖脂衍生物和疫苗的产品， 作为组合制剂用于在预防或治疗细菌性和/或病毒性感染中同时、单独或相继使用。
[0022] 在另外的方面，本发明提供包含至少一种式（I)的β -糖脂衍生物的产品，用于在 与免疫应答的改变相关的病理阶段的治疗中使用。
[0023] 在另一个方面，本发明提供式（I)的糖脂衍生物，用于在动物的免疫中使用， 任选地与动物必须针对其被免疫的抗原共施用。
[0024] 附图简述
[0025] 本发明的特征和优点将从以下详细描述、从被提供用于例证性且非限制性目的的 工作实施例、以及从附图中是清楚的，其中：
[0026] -图1示出通过化学合成获得的并在体外和体内在系统上测定的一些式⑴的 β-糖脂衍生物的结构；
[0027] -图2示出用于制备式⑴的β_糖脂衍生物的优选的合成方案，其中札=酰基 1，诸如棕榈酰基、油酰基、硬脂酰基、肉豆蔻酰基、辛酰基、异油酰基或月桂酰基，且R2 =酰 基2,诸如棕榈酰基、油酰基、硬脂酰基、肉豆蔻酰基、辛酰基、异油酰基或月桂酰基；
[0028] -图3示出在人类树突细胞中II类HLA分子表达的比较，所述树突细胞用TNF以 及通过以存在于光合生物体中的天然化合物的模型合成的α-磺基奎诺糖苷的混合物（图 3Α)以及通过具有通式（I)的合成的β -磺基奎诺糖苷的混合物（图3Β)共刺激。II类 HLA表达表征这些细胞的成熟，并使它们能够以有效的方式引发免疫应答。结果示出，天然 α -磺基奎诺糖苷在刺激树突细胞上是无效的，而β -磺基奎诺糖苷确定成熟程度中的深 度变化。用脂多糖代替TNF的共刺激或用两类硫脂的刺激取得了相同结果；(免>对照； 用TNF刺激的人类树突细胞；（☆)用TNF和α -磺基奎诺糖苷共刺激的人类树突细胞； (★)用TNF和β -磺基奎诺糖苷共刺激的人类树突细胞；
[0029] -图4示出β -磺基奎诺糖苷（特别是优选的化合物β -磺基奎诺糖基二棕榈酰 基-甘油）对由TNF和脂多糖（LPS)(阳性对照）刺激的人类树突细胞中的II类HLA分子 表达的干扰。应答示出不同类别分子之间不存在相互作用；人类树突细胞对照；（》>用 TNF共刺激的人类树突细胞；（☆)用脂多糖共刺激的人类树突细胞；（★)用TNF和脂多 糖和β-磺基奎诺糖基-二棕榈酰基-甘油共刺激的人类树突细胞；
[0030] -图5示出优选的化合物β -磺基奎诺糖基二棕榈酰基-甘油对从正常供体的 外周血液获得的树突细胞的剂量依赖性的效应；虚曲线：人类树突细胞对照；实曲线：用从 10ng/ml至100 μ g/ml的渐增浓度的β -磺基奎诺糖基-二棕榈酰基-甘油刺激的人类树 突细胞；
[0031] -图6示出对从用以下刺激的树突细胞产生白细胞介素12(IL12)的效应：图6Α = 从微藻类纯化的包含α -磺基奎诺糖苷和半乳糖脂的天然糖脂的混合物；图6Β =式（I)的 β -糖脂的钠盐的混合物；图6C = α -磺基奎诺糖基-二硬脂酰基甘油和α -磺基奎诺糖 基-二棕榈酰基甘油的钠盐的1:1混合物；图6D =式（I)的β -磺基奎诺糖苷的钠盐的混 合物；图6Ε = β -磺基奎诺糖基二硬脂酰基-甘油和β -磺基奎诺糖基二棕榈酰基-甘油 的钠盐的1:1混合物；图6F =纯的β -磺基奎诺糖基二棕榈酰基-甘油的钠盐。
[0032] -图7示出在用卵白蛋白加优选化合物β -磺基奎诺糖基二棕榈酰基-甘油（物 质）注射的小鼠的体内免疫之后特异性抗体滴度的值。该实验与用卵白蛋白和两个新一代 的商业级佐剂Freund(油滴和被杀死的结核杆菌的水性乳液）和TiterMax (包含角藍稀 的油性乳液）免疫的动物相比较来进行。单独的DMS0是阴性对照，所述DMS0被用作施用 β-磺基奎诺糖基二棕榈酰基-甘油的载体。特异性IgG值示出β-磺基奎诺糖基二棕榈 酰基-甘油的佐剂效应，这可比得上目前已经用于疫苗制剂的两个佐剂的佐剂效应。
[0033] 发明详述
[0034] 因此，本发明的目的是用于作为疫苗佐剂使用的具有式（I)的β -糖脂衍生物：
[0036] 其盐或金属络合物，
[0037] 其中
[0038] 异头碳的缩醛键具有β (贝塔）构型，
[0039] AJP Α 2彼此独立地是饱和的或单不饱和的直链或支链的C「C3。烷基，或分别是酰 基-(CO) Ri和酰基-(CO) R 2，其中&和R 2彼此独立地是饱和的或单不饱和的直链或支链的 c「c29烷基，并且
[0040] X 是磺酸基（_S03H)、硫酸基（_0S03H)、磷酸基（-opho3h 2)或膦酸基（-po3h2)。
[0041] 碳水化合物部分源自具有β构型异头碳的己醛糖或合成的结构类似物。
[0042] 事实上，已令人惊讶地