移动和旋转，以便在其上接收到不同结构的三维实体网络结构。尖嘴喷头处挤出的丝材沉积到圆柱形，形成了本身就具有三维结构的实体网络；
4)三维贯通类血管结构网络的制备:将沉积后的三维实体结构(4-1)静置在具有设定浓度的水凝胶(4-2)中；室温静置后，待其凝胶化后取出；对其进行适当的修剪，露出三维实体结构的头部和尾部，以便对其进行处理;然后将其放入液体中进行溶解;三维实体结构溶解完毕后，即可获得三维贯通结构网络的水凝胶支架；
5 )组织工程支架细胞培养:将制备好的含有三维贯通结构网络的水凝胶支架含有细胞的培养液中进行动态培养。
[0019]实施例二:
本实施例与实施例一基本相同，特别之处如下:所述步骤I)材料和原液制备:三维实体网络材料选用无毒的水溶性丝材聚乙烯醇PVA;水凝胶采用明胶gelatin，通过热水浴的方法将其溶解，由于此特点，若将此支架移植到体内支架会溶解，因此为了提高此款支架的稳定性，特在水凝胶中加入提高其凝胶特性的谷氨酰胺转氨酶TG，提高其凝胶化程度，避免成型后溶解现象;其配制方法为先配制质量比为10 ± 0.5%明胶溶液，在60 ± 2 0C的热水浴中对其进行溶解，待其呈透明状时加入谷氨酰胺转氨酶粉末，搅拌均匀后即可使用，此款水凝胶中明胶和谷氨酰胺转氨酶的之中为10:1-1.1o
[0020]所述步骤2)材料挤出:材料挤出，将加热喷头加热到210±10°C，将推送到此模块的PVA丝材进行溶解，并由尖嘴喷头处挤出；
所述步骤3)三维实体网络结构制备:采用具有圆柱形滚筒进行接收，接收滚筒具有三个自由度，轴向的双向移动和旋转，以便在其上接收到不同结构的三维实体网络结构。尖嘴喷头处挤出的丝材沉积到圆柱形，形成了本身就具有三维结构的实体网络；
所述步骤4)三维贯通类血管结构网络的制备:将沉积后的三维实体结构(4-1)静置在具有一定浓度的水凝胶(4-2)中；室温静置15±0.5min后，将其放入到4±0.2°C的环境中30±lmin诱导酶促进明胶进行共价交联，然后将其放入到37土 TC的环境中6±0.2h，此时的酶活性最高，促进明胶的凝胶化，待其凝胶化后取出；对其进行适当的修剪，露出三维实体结构的头部和尾部，以便对其进行处理;然后将其放入水中进行溶解;三维实体结构溶解完毕后，即可获得三维贯通结构网络的水凝胶支架；
实施例三:制备骨组织结构体
在本案例涉及细胞操作，需要在无菌环境下进行，所以实验之前要对实验器材与材料进行消毒，实验在超净台中进行，具体步骤如下:
1)材料和原液制备:三维实体网络材料选用无毒的水溶性丝材聚乙烯醇PVA，使用前采用紫外灯进行消毒至少30min;水凝胶采用明胶gelatin，通过热水浴的方法将其溶解，由于此特点，若将此支架移植到体内支架会溶解，因此为了提高此款支架的稳定性，特在水凝胶中加入提高其凝胶特性的谷氨酰胺转氨酶TG，提高其凝胶化程度，避免成型后溶解现象;其配制方法为先配制质量比为10%明胶溶液，在60°C的热水浴中对其进行溶解，待其呈透明状时加入谷氨酰胺转氨酶粉末，搅拌均匀后即可使用，此款水凝胶中明胶和谷氨酰胺转氨酶的之中为10:1;明胶和TG酶使用前要经过高温进行消毒才可使用；
2)材料挤出:材料挤出，将加热喷头加热到210°C，将推送到此模块的PVA丝材进行溶解，并由尖嘴喷头处挤出；
3)三维实体网络结构制备:采用具有圆柱形滚筒进行接收，接收滚筒具有三个自由度，轴向的双向移动和旋转，以便在其上接收到不同结构的三维实体网络结构。尖嘴喷头处挤出的丝材沉积到圆柱形，形成了本身就具有三维结构的实体网络;滚筒使用前采用紫外灯进行消毒至少30min;
4)三维贯通类血管结构网络的制备:将沉积后的三维实体结构(4-1)静置在具有一定浓度的明胶(4-2)中；室温静置15min后，将其放入到4°C的环境中30min诱导酶促进明胶进行共价交联，然后将其放入到30min的环境中6h，此时的酶活性最高，促进明胶的凝胶化，待其凝胶化后取出；对其进行适当的修剪，露出三维实体结构的头部和尾部，以便对其进行处理;然后将其放入磷酸盐缓冲液PBS中进行溶解;三维实体结构溶解完毕后，即可获得三维贯通结构网络的水凝胶支架；
5)组织工程支架细胞培养:将制备好的含有三维贯通结构网络的组织工程支架采用酒精进行消毒；处理完后放入含有人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养液中进行动态培养;经过培养后的组织工程支架进行活死染处理，可以看见活细胞粘附在三维贯通结构网络的表面，促进组织工程支架血管化。
【主权项】
1.滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法，其特征在于:采用的三维实体网络制备系统由齿轮(1-2)和滚轮(1-3)提供所需材料推动力;米用加热模块(1-4)和挤出喷头(1-5)作为供料模块;采用不同含有不同结构的圆柱形滚筒作为收集装置;利用丝材PVA的水溶性特点，待其成型完毕后将其牺牲掉;制备工艺流程如下: I)材料和原液制备:三维实体网络材料选用无毒的水溶性丝材;水凝胶通过热水浴的方法将其溶解； 2)材料挤出:材料挤出，将加热喷头加热到设定温度，将推送到加热模块的丝材进行溶解，并由尖嘴嗔头(I_5)处挤出； 3)三维实体网络结构制备:采用具有圆柱形滚筒进行接收，接收滚筒具有三个自由度，轴向的双向移动和旋转，以便在其上接收到不同结构的三维实体网络结构;尖嘴喷头(1-5)处挤出的丝材沉积到圆柱形，形成了本身就具有三维结构的实体网络； 4)三维贯通类血管结构网络的制备:将沉积后的三维实体结构(4-1)静置在具有设定浓度的水凝胶(4-2)中；室温静置后，待其凝胶化后取出；对其进行适当的修剪，露出三维实体结构的头部和尾部，以便对其进行处理;然后将其放入液体中进行溶解;三维实体结构溶解完毕后，即可获得三维贯通结构网络的水凝胶支架； 5)组织工程支架细胞培养:将制备好的含有三维贯通结构网络的水凝胶支架含有细胞的培养液中进行动态培养。2.根据权利要求1所述的滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法，其特征在于:所述步骤I)材料和原液制备:三维实体网络材料选用无毒的水溶性丝材聚乙烯醇PVA;水凝胶采用明胶gelatin，通过热水浴的方法将其溶解，由于此特点，若将此支架移植到体内支架会溶解，因此为了提高此款支架的稳定性，特在水凝胶中加入提高其凝胶特性的谷氨酰胺转氨酶TG，提高其凝胶化程度，避免成型后溶解现象;其配制方法为先配制质量比为10±0.5%明胶溶液，在60±2°C的热水浴中对其进行溶解，待其呈透明状时加入谷氨酰胺转氨酶粉末，搅拌均匀后即可使用，此款水凝胶中明胶和谷氨酰胺转氨酶的之中为10:1?1.1。3.根据权利要求1所述的滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法，其特征在于:所述步骤2)材料挤出:材料挤出，将加热喷头加热到210土 10°C，将推送到此模块的PVA丝材进行溶解，并由尖嘴喷头处挤出。4.根据权利要求1所述的滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法，其特征在于:所述步骤3)三维实体网络结构制备:采用具有圆柱形滚筒进行接收，接收滚筒具有三个自由度，轴向的双向移动和旋转，以便在其上接收到不同结构的三维实体网络结构;尖嘴喷头处挤出的丝材沉积到圆柱形，形成了本身就具有三维结构的实体网络。5.根据权利要求1所述的滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法，其特征在于:所述步骤4)三维贯通类血管结构网络的制备:将沉积后的三维实体结构(4-1)静置在具有设定浓度的明胶(4-2 )中；室温静置15 土 0.5min后，将其放入到4 土 0.2 °C的环境中30±lmin诱导酶促进明胶进行共价交联，然后将其放入到37土 TC的环境中6±0.2h，此时的酶活性最高，促进明胶的凝胶化，待其凝胶化后取出；对其进行适当的修剪，露出三维实体结构的头部和尾部，以便对其进行处理;然后将其放入磷酸盐缓冲液PBS中进行溶解;三维实体结构溶解完毕后，即可获得三维贯通结构网络的水凝胶支架。
【专利摘要】本发明公开了滚筒式收集制备三维贯通类血管结构网络支架的方法。该方法在热熔挤出水溶性材料的基础上，采用滚筒收集的方式来形成预制的三维实体网络，再用水凝胶材料进行包埋，成型完毕后放入水中，去除三维实体网络，在水凝胶内部形成三维贯通的类血管结构网络。本发明打破了传统的层与层之间连接的三维思路，利用圆柱形滚筒的特点，在圆柱面上接收水溶性材料构建出挤出后本身就具有三维结构的实体网络。
【IPC分类】A61L27/38, B33Y30/00, B33Y10/00, A61L27/22, A61L27/52
【公开号】CN105664262
【申请号】CN201610026442
【发明人】胡庆夕, 李帅, 刘媛媛, 孙元劭, 李瑜, 刘嫦娥
【申请人】上海大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月16日