基于石墨烯/丝素蛋白的骨组织工程三维多孔支架制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种骨组织修复与重建用的骨组织工程=维多孔支架制备方法，具体 设及一种利用盐析法制备石墨締/丝素蛋白=维多孔支架的骨组织工程支架的方法。
【背景技术】
[0002] 随着社会人口老龄化及运动损伤的增多，各种骨科疾病给患者带来了极大的困扰 与痛苦。其中由于先天性疾病或诸如外伤、感染和肿瘤切除等因素容易在骨内形成较大的 间隙-骨缺损。骨缺损修复一直是国际研究的热点，可采用骨移植（自体骨移植和异体骨移 植）、组织工程技术、膜引导性组织再生、基因疗法、生长因子诱导等技术来治疗骨缺损。
[0003] 组织工程技术是一口包含种子细胞、支架材料、生长因子=大要素的交叉学科。支 架材料为细胞生长提供了=维支撑结构，理想的=维骨组织工程支架需要有利于种子细胞 在其表面黏附、增殖和迁移，同时支架材料需具有生物相容性、骨传导性、骨诱导性和一定 的力学性能。
[0004] 目前国内外研究、开发的用于组织工程的天然生物材料主要有胶原、壳聚糖、明 胶、透明质酸、丝素蛋白等。丝素蛋白是一种从家蚕中提取的天然共聚物，主要由甘氨酸、丙 氨酸、丝氨酸和酪氨酸组成（占总量的95% W上）。丝素蛋白外通常包裹一层丝胶蛋白（Silk Sericin)，有研究表明蚕丝易引起免疫反应，因此在使用过程中需对蚕丝进行脱胶处理，除 去外层丝胶蛋白。作为一种天然活性蛋白，丝素蛋白具有较低的免疫原性、良好的生物相容 性、生物可降解性、良好的力学性能等性质，可W促进细胞黏附和诱导骨细胞生长，使其在 生物医用材料与组织工程领域里的应用研究受到越来越多的关注。
[0005] 丝素蛋白主要由结晶态和非结晶态两部分组成。结晶区的形成是由于丝素蛋白中 的氨基酸形成多肤分子后，侧链较为简单的、小的氨基酸残基按一定的序列结构形成规则 链段而产生，其结晶度在50%~60%左右，由氨酸、丙氨酸和丝氨酸(摩尔比3:2:1)组成。带 有较大侧基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非结晶区域。丝素蛋白有两种构象 Si化I和Si化IKSHk I构象主要为无规卷曲结构和由链内氨键作用产生的类a-螺旋(口-helix-Uke)构象，是一种介于a-螺旋和0-折叠的中间形态;SiIk II构象则为反平行0-折 叠(0-sheet)构象。SHk I构象结构不稳定，极易转变为Si化II构象，该0-折叠结构内肤链 排列整齐，链断间具有较强的氨键作用和分子间作用力，从而赋予丝素蛋白较高的硬度和 弹性。然而，在应用于骨组织修复与再生的过程中，丝素蛋白=维多孔支架的力学性能仍有 待进一步提高，因此需要在丝素蛋白内添加力学性能良好、具有一定生物活性的力学增强 材料。
[0006] 石墨締是由SP2杂化碳原子组成的具有蜂窝状晶体点阵结构的二维层状纳米材 料，作为一种新型纳米材料，石墨締具有优异的力学性能和良好的生物相容性，可用作生物 复合材料的力学增强相，W期提高生物材料的力学性能。目前有学者已经制备出多种石墨 締及其衍生物增强=维复合多孔支架用于骨组织修复与再生，如石墨締/生物陶瓷、石墨 締/壳聚糖、GO/聚乙締醇、石墨締/聚已酸内醋、GO/化GA、G0/聚乳酸/聚氨醋和G0/PLGA/胶 原等多孔支架。其优点主要有：（1)石墨締具有较大的比表面积，可W与基体材料(如丝素蛋 白）充分接触，易于在基体内形成有效的网状互联结构，有利于界面应力传导；（2)低添加量 条件下，可显著提高基体杨氏模量、断裂初性、屈服强度等力学性能；（3)具有一定的生物相 容性，可W与丝素蛋白产生协同作用，提高复合材料生物活性；（4)可W对石墨締进行化学 修饰，引入其它活性基团或物质；（5)有研究指出石墨締具有促进干细胞成骨分化的能力；
[6] 石墨締具有一定的抗菌性，有利于减少植入物术后感染率。
[0007] 因此在丝素蛋白内添加石墨締作为力学增强材料，W提高支架的力学性能、电传 导性和成骨活性。目前关于丝素蛋白/石墨締及其衍生物复合材料的生物医用研究还处于 探索阶段，相关研究主要集中在丝素蛋白/石墨締二维复合涂层/薄膜制备领域，且国内外 还没有文献和专利报道过利用盐析法制备石墨締/丝素蛋白=维多孔骨组织工程支架。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术所得丝素蛋白支架力学性能差、成骨活性低的缺 点，提出一种新的骨组织工程=维多孔支架的制备方法。本发明通过引入石墨締作为力学 增强材料，提高用于骨组织修复与重建用丝素蛋白支架的力学性能和成骨活性。
[0009] 本发明的目的通过W下技术方案实现。
[0010] 1)将桑蚕虽(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕虽，然后将其置于化浓度为 0.02mol/L化2〇)3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗 脱胶丝素蛋白数次，并自然惊干；
[0011] 2)将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M Li化约地，待丝素蛋白完全溶解 后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白 水溶液存放在4 °C冰箱中待用；
[0012] 3)将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离屯、管中，将氧化石墨締GO水溶 液按照GO/丝素蛋白0.1~3wt%质量比加入丝素蛋白水溶液中，轻轻揽拌均匀。
[0013] 4)通过盐析法制备S维多孔支架，即W粒径为400~600皿氯化钢作为制孔剂，按 照2: Iw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于〇65mm培养皿中，室溫下静 置4她。
[0014] 5)待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除化Cl制孔剂。 待NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料。
[0015] 6)取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用打孔器的圆柱形S维多孔复合 支架。
[0016] 7)将步骤6)制备的S维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件 下加热lOmin，得到石墨締/丝素蛋白支架。然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗石墨 締/丝素蛋白支架3次，将所述石墨締/丝素蛋白支架浸没在培养基中，W待向石墨締/丝素 蛋白支架内接种细胞。
[0017] 至此，本发明=维多孔支架制备完成。
[0018] 本发明石墨締/丝素蛋白=维多孔支架制备方法的设备简单，操作方便，工艺参数 易于控制，且成本费用低。与纯丝素蛋白支架相比，石墨締的加入后提高了丝素蛋白支架的 力学性能和成骨活性，推动了石墨締在骨组织工程领域的应用，也促进了丝素蛋白在骨缺 损修复领域的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图Ia为hMSC细胞接种于丝素蛋白及丝素蛋白/rGO复合支架内，在成骨分化培养基 中共培养2地、67化和134地后支架宏观光学照片，图化为hMSC细胞接种于丝素蛋白及丝素 蛋白/rGO复合支架内，在成骨分化培养基中共培养2地、67化和134地后支架的厚度、直径和 体积；
[0020] 图2 hMSC细胞接种于丝素蛋白及丝素蛋白/rGO复合支架内，在成骨分化培养基中 共培养2地、67化和134地支架内细胞DNA含量；
[0021] 图3 hMSC细胞与不同浓度石墨締的丝素蛋白/石墨締复合支架在成骨分化培养基 中共培养2地、67化和134地后在液体中的平衡杨氏模量；
[0022] 图4 hMSC细胞与不同浓度石墨締的丝素蛋白/石墨締复合支架在成骨分化培养基 中共培养67化和134地后细胞内化含量测定结果；
[0023] 图5a hMSC细胞与不同浓度石墨締的丝素蛋白/石墨締复合支架在成骨分化培养 基中共培养67化和134地后细胞内BSP基因表达情况，图5b hMSC细胞与不同浓度石墨締的 丝素蛋白/石墨締复合支架在成骨分化培养基中共培养67化和134地后细胞内RUNX2基因表 达情况。
【具体实施方式】
[0024] W下结合附图和【具体实施方式】进一步说明本发明。
[0025] 实施例1
[00%] 1)将桑蚕虽(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕虽，然后将其置于化浓度为 0.02mol/L化2〇)3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗 脱胶丝素蛋白数次，并自然惊干；
[0027] 2)将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M Li化约地，待丝素蛋白完全溶解 后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白 水溶液存放在4 °C冰箱中待用；
[00%] 3)将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离屯、管中，将氧化石墨締GO水溶 液按照GO/丝素蛋白0.1 wt %质量比加入丝素蛋白水溶液中，轻轻揽拌均匀。
[0029] 4)通过盐析法制备S维多孔支架，即W粒径为400~600皿氯化钢作为制孔剂，按 照2: Iw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于〇65mm培养皿中，室溫下静 置4她。
[0030] 5)待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除化Cl制孔剂。 待NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料。
[0031] 6)取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用直径为4mm打孔器将其切割成直 径4mm、厚度2mm的圆柱形=维多孔复合支架。
[0032] 7)将步骤6)制备的S维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件 下加热lOmin，得到石墨締/丝素蛋白支架。然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗石墨 締/丝素蛋白支架3次，将所述支架浸没在培养基中。
[0033] 8)取出步骤7)浸没在培养基中的石墨締/丝素蛋白支架，向所述支架内接种干细 胞，所用干细胞为在增殖培养基中培养至第四代的人间充质骨髓干细胞。增殖培养基为含 有10%胎牛血清、1 %青霉素/链霉素、0.1 ng/mL bFGF的高葡萄糖含量DMEM培养基。取15化 4X IO7CellsAiL细胞悬浮液，滴