加至预先吸干培养基的实施例3所得支架内，于37°C溫度下 静置20min，然后翻转支架180°，滴加祉L无细胞培养基，于37°C溫度下静置20min，然后第二 次翻转支架180°，滴加祉L，重复此操作约5~6次，时长化。然后将接种过细胞的支架转移至 24孔板中，每孔加入2mL成骨培养基，在37 "C/5 % C〇2培养4~8周，每2~3天更换一次培养 基。所用成骨分化培养基为含有10 %胎牛血清、1 %青霉素-链霉素、IOOnM地塞米松、IOmMP-甘油憐酸钢和5〇4旨/1111的心抗坏血酸-2-憐酸醋钢的低葡萄糖含量DMEM培养基。
[0034] 得到的石墨締/丝素蛋白支架的微结构、DNA含量、力学性能、巧含量和基因表达情 况分别用如下仪器或试剂盒测试:游标卡尺、Picogreen试剂盒(Molecular Probes,OR)、显 微力学测试仪、Calcium(CPC)Liquicolor虚Kit试剂盒（Stanbio Laboratory,USA)和RT-PCR 分析仪。
[0035] 石墨締/丝素蛋白支架在与人间充质骨髓干细胞共培养后尺寸变化如图Ia所示， 当培养67化(week 4)后，支架体积发生收缩;当复合支架内rGO含量大于1%，支架未发生明 显收缩。通过测量支架厚度和直径，结果如图化所示，rGO含量为1%与3%的复合支架尺寸 没有发生明显改变，较好地维持了其=维多孔结构。
[0036] 石墨締/丝素蛋白支架内人间充质骨髓干细胞DNA含量如图2所示，随培养时间延 长，1 %和3 % rGO丝素蛋白支架内细胞DNA含量逐渐增加。培养结束后，0.5 % rGO丝素蛋白支 架内细胞DNA含量最高。
[0037] 石墨締/丝素蛋白支架在与人间充质骨髓干细胞共培养后支架力学性能如图3所 示，在没有接种细胞的情况下(without cells)，当rGO含量增加至3%时，支架杨氏模量显 著提高。接种细胞培后，样品杨氏模量显著提高，且随着rGO含量的增加，杨氏模量逐渐增 加。
[0038] 石墨締/丝素蛋白支架内人间充质骨髓干细胞巧含量如图4所示，与纯丝素蛋白支 架相比，加入rGO后可W促进支架内干细胞成骨分化，巧含量显著增加。
[0039] 石墨締/丝素蛋白支架内人间充质骨髓干细胞内成骨基因表达情况如图5所示，图 5a所示为BSP基因，图化所示为抓NX 2基因。实验结果表明加入石墨締后，可W促进支架内 干细胞成骨分化。
[0040] 实施例2
[0041 ] 1)将桑蚕虽(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕虽，然后将其置于化浓度为 0.02mol/L化2〇)3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗 脱胶丝素蛋白数次，并自然惊干；
[0042] 2)将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M Li化约地，待丝素蛋白完全溶解 后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白 水溶液存放在4 °C冰箱中待用；
[0043] 3)将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离屯、管中，将氧化石墨締GO水溶 液按照GO/丝素蛋白0.5wt %质量比加入丝素蛋白水溶液中，轻轻揽拌均匀。
[0044] 4)通过盐析法制备S维多孔支架，即W粒径为400~600皿氯化钢作为制孔剂，按 照2: Iw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于〇65mm培养皿中，室溫下静 置4她。
[0045] 5)待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除化Cl制孔剂。 待NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料。
[0046] 6)取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用直径为4mm打孔器将其切割成直 径4mm、厚度2mm的圆柱形=维多孔复合支架。
[0047] 7)将步骤6)制备的S维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件 下加热lOmin，得到石墨締/丝素蛋白支架。然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗所述支 架3次，将所述石墨締/丝素蛋白支架浸没在培养基中，W待向所述支架内接种细胞。
[004引实施例3
[0049] 1)将桑蚕虽(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕虽，然后将其置于化浓度为 0.02mol/L化2〇)3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗 脱胶丝素蛋白数次，并自然惊干；
[0050] 2)将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M Li化约地，待丝素蛋白完全溶解 后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白 水溶液存放在4 °C冰箱中待用；
[0051] 3)将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离屯、管中，将氧化石墨締GO水溶 液按照GO/丝素蛋白Iwt %质量比加入丝素蛋白水溶液中，轻轻揽拌均匀。
[0052] 4)通过盐析法制备S维多孔支架，即W粒径为400~600皿氯化钢作为制孔剂，按 照2: Iw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于〇65mm培养皿中，室溫下静 置4她。
[0053] 5)待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除化Cl制孔剂。 待NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料。
[0054] 6)取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用直径为4mm打孔器将其切割成直 径4mm、厚度2mm的圆柱形=维多孔复合支架。
[0055] 7)将步骤6)制备的S维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件 下加热lOmin，得到石墨締/丝素蛋白支架。然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗所述支 架3次，将石墨締/丝素蛋白支架浸没在培养基中，W待向所述支架内接种细胞。
[0056] 实施例4
[0057] 1)将桑蚕虽(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕虽，然后将其置于化浓度为 0.02mol/L化2〇)3溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白。煮沸结束后用去离子水清洗 脱胶丝素蛋白数次，并自然惊干；
[005引2)将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M Li化约地，待丝素蛋白完全溶解 后，用透析膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v%的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白 水溶液存放在4 °C冰箱中待用；
[0059] 3)将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离屯、管中，将氧化石墨締GO水溶 液按照GO/丝素蛋白3wt %质量比加入丝素蛋白水溶液中，轻轻揽拌均匀。
[0060] 4)通过盐析法制备S维多孔支架，即W粒径为400~600WI1氯化钢作为制孔剂，按 照2: Iw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于〇65mm培养皿中，室溫下静 置4她。
[0061] 5)待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除化Cl制孔剂。 待NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料。
[0062] 6)取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用直径为4mm打孔器将其切割成直 径4mm、厚度2mm的圆柱形=维多孔复合支架。
[0063] 7)将步骤6)制备的S维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件 下加热lOmin，得到石墨締/丝素蛋白支架。然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗所述支 架3次，将石墨締/丝素蛋白支架浸没在培养基中，W待向所述支架内接种细胞。
【主权项】
1. 一种基于石墨烯/丝素蛋白的骨组织工程三维多孔支架制备方法，其特征在于:所述 的制备方法引入石墨烯作为力学增强材料，步骤如下： 1) 将桑蚕苗(Bombyx mori cocoon)剪碎，称取5g桑蚕苗，将其置于21^浓度为0.02mol/L Na2C03溶液中煮沸30min，去除蚕丝表面丝胶蛋白；煮沸结束后用去离子水清洗脱胶丝素蛋 白数次，并自然晾干； 2) 将步骤1)制备的丝素蛋白在60°C下溶解于9M LiBr中4h，待丝素蛋白溶解后，用透析 膜透析72h，得到质量体积分数为6-7w/v %的丝素蛋白水溶液，将所述丝素蛋白水溶液存放 在4 C冰箱中待用； 3) 将步骤2)所得6-7w/v%丝素蛋白溶液置于50ml离心管中，将氧化石墨烯GO水溶液按 照GO/丝素蛋白0.1~3wt %质量比加入丝素蛋白水溶液中，搅拌均匀； 4) 通过盐析法制备三维多孔支架，即以粒径为400~600μπι氯化钠作为制孔剂，按照2: lw/v%加入步骤3)制备的GO/丝素蛋白溶液，将混合物置于Φ 65mm培养皿中，室温下静置 48h； 5) 待步骤4)制备的溶液变为凝胶后，将其置于去离子水中溶解，去除NaCl制孔剂；待 NaCl全部溶解后，用去离子水清洗样品3次，得到GO/丝素蛋白多孔材料； 6) 取出步骤5)制备的GO/丝素蛋白多孔材料，利用打孔器将其切割成圆柱形三维多孔 复合支架； 7) 将步骤6)制备的三维多孔复合支架置于41mmol/L抗坏血酸溶液中，在95°C条件下加 热lOmin，得到石墨烯/丝素蛋白支架;然后分别用去离子水、70%乙醇溶液清洗石墨烯/丝 素蛋白支架3次，将所述石墨烯/丝素蛋白支架浸没在培养基中，以待向石墨烯/丝素蛋白支 架内接种细胞。
【专利摘要】一种基于石墨烯/丝素蛋白的骨组织工程三维多孔支架制备方法，所述的制备方法引入石墨烯作为力学增强材料。将氧化石墨烯GO水溶液按照GO/丝素蛋白0.1～3wt％质量比加入丝素蛋白水溶液中，通过盐析法制备三维多孔支架。
【IPC分类】A61L27/56, A61L27/38, A61L27/44
【公开号】CN105664260
【申请号】CN201610097176
【发明人】李明, 莫茂松
【申请人】中国科学院电工研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月23日