一种多尺度可控微孔结构骨组织工程支架及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种仿生骨组织工程支架材料及其制备方法，该支架材料具有与天然骨组织相似的多层级微孔结构，支架具有从500纳米至1000微米范围内可调的多层级仿生类骨三维孔结构。该多尺度孔结构可控的骨组织工程支架，首先通过快速成型技术对医用高分子材料进行三维打印，定制一级微米尺度三维孔结构及支架外形，然后再通过超临界气体发泡对支架内部进行二级微、纳米尺度微孔制备。最终制备的多尺度微孔骨组织工程支架不但可以提供骨组织再生所需的三维支撑，而且可以从不同尺度层面上满足蛋白吸附、营养物质/代谢产物输送、细胞迁移、组织长入的需要，在骨科临床上具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种多尺度可控微孔结构骨组织工程支架及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种结合三维打印快速成型以及超临界流体发泡技术制备具有多尺度可控微孔结构的骨组织工程支架材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。技术背景
[0002]天然骨组织是一种具有复杂分级孔隙结构的组织。理想的骨组织工程支架需尽量设计与天然骨组织解剖相似的微孔结构，同时具有良好的生物相容性，容易键合周围骨组织。为了满足新生骨组织长入的需求，骨组织工程支架必须设计具有相互贯通的三维多孔结构。三维孔隙结构可以为骨细胞的黏附、迀移和增殖提供必要的生存空间，同时为细胞的繁殖、代谢提供营养与代谢产物的传输通道。大量研究表明，理想骨组织工程支架既需具有宏观大孔结构(孔径为200?1000M1)，支持血管生长和组织向内长入，同时也需兼具几百纳米至10M1的微小孔隙，以提供与细胞相互作用的活性位点，及利于营养物质的扩散与输送。 多孔组织工程支架在组织再生中具有重要地位。其常规制备技术主要包括物理发泡、化学发泡、纤维粘结、相分离、微粒占位法、三维打印、静电纺丝等。然而，这些传统的多孔材料制备方法大多无法精确定制支架结构的微孔尺寸，无法实现多孔结构的连通形式控制，更无法针对天然骨组织的解剖结构，仿生制备具有复杂分级孔结构的骨组织支架。
[0003]超临界流体作为一种物理发泡工艺，其在针对高分子材料的发泡方面具有一定优势，例如(Supercritical carbon d1xide，ScC〇2)制备微孔可降解高分子支架工艺过程简单，C02无毒、价廉，无有机溶剂残留，不会引起机体产生炎症问题等。采用超临界流体制备微孔聚合物的基本原理是，在高温高压条件下，通过吸附二氧化碳超临界流体进入聚合物基体，再通过控制混合体系的压力和温度，急剧减压或升温以产生热力学不稳定，在聚合物中形成大量的超临界介质泡核，进而通过温度诱导和压力诱导发泡以成型微孔结构。这种方法得到的多孔结构其孔密度大、孔尺寸小且分布均匀，但其显著缺陷在于不便于成型宏观大孔结构(>l〇〇Mi)，不利于保障多孔结构的连通性、贯通性。[〇〇〇4] 近年来，三维打印(3D Printing，简称3DP)，也称快速成型(Rapid Prototyping， RP)作为一种先进制造成型技术在制备多孔支架方面具有无可比拟的优势，其打印系统通过读取文件中的横截面信息，用液体状、粉状或片状的材料将这些截面逐层打印、粘合起来从而制造出三维实体。针对于高分子材料，恪融沉积成型(Fused Deposit1n Modeling， FDM)作为一种典型3D打印技术，它通过把高分子材料用高温熔化成液态，然后通过喷嘴挤压出一个很小的熔料条，在熔料条挤出后立即固化，并通过喷嘴运动轨迹在立体空间的排列组合形成实物结构。FDM可以准确、快速地将设计产品转化为具有一定结构和功能的部件。三维打印技术尽管理论上可以实现任何孔形及结构的制备，但事实上由于受打印精度制约，如打印喷头直径，打印材料丝线、粒度等影响，其往往无法实现纳米尺度，以及小于10 Mi的微孔成型。
[0005]因此，本发明针对常规微孔成型工艺技术的不足，提出一种新型的可实现多尺度孔结构可控的骨组织工程支架的及其制备工艺。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种多尺度孔结构可控的骨组织工程支架及其制备工艺，多尺度孔结构骨组织工程支架不但可以提供组织再生所需的三维支撑，而且可以从多尺度层面上满足蛋白吸附、营养物质/代谢产物输送、细胞迀移、组织长入的需要。
[0007]本发明通过以下技术方案来实现:
[0008]一种多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其包含多尺度微观结构，三维宏观大孔尺度为:10-1000wii，大孔孔壁材料均匀分布三维微观小孔，小孔尺度为500nm-10wi!，支架的孔隙率:30%?95%。所述多尺度微孔骨组织工程支架结构高度模仿天然骨组织解剖结构。
[0009]作为优选方式，所述多尺度可控微孔结构骨组织工程支架材料成分可为:热塑性医用高分子材料为PLA、PLLA、PLGA、PEG或它们经过任意比例共混得到的复合材料中的一种。热塑性医用高分子材料可以通过超临界气体发泡制备微孔结构。
[0010]作为优选方式，所述多尺度可控微孔结构骨组织工程支架总体孔隙率为30%? 95%，宏观大孔尺度为:10-1000wii，大孔由快速成型技术制备，孔与孔之间可以通过任意形式互穿贯通，大孔孔壁均匀分布微观小孔，小孔尺度为500nm-10wii，小孔由超临界气体发泡制备。
[0011]作为优选方式，所述多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:所述支架的三维宏观大孔由快速成型技术制备，快速成型技术为恪融沉积成型(Fused Deposit1n Modeling，FDM)、选择性激光烧结(Selective Laser Sintering，SLS)、恪丝制造(Fused Filament Fabricat1n，FFF)、选择性热烧结(Selective Heat Sintering，SHS)等快速成型技术中的一种。快速成型技术通过支架孔结构预设计建模可以有效定制支架孔结构特征参数。
[0012]作为优选方式，所述多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:所述支架的三维微观小孔由超临界气体发泡制备，超临界气体发泡所用气体为二氧化碳或氮气中的一种。二氧化碳及氮气无毒性，价格低廉，超临界气体发泡工艺不引入其他化学试剂、溶剂， 避免了有毒、有害物质对支架材料的污染，确保产品的生物相容性和安全性。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种上述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架的制备方法，其操作步骤包括:
[0014](a)医用高分子材料骨组织工程支架宏观孔结构预设计及建模；
[0015](b)医用高分子材料骨组织工程支架一级宏观孔结构经快速成型技术打印制备；
[0016](c)将上述(b)步骤中打印成型的支架置于超临界气体反应斧中进行气体吸附，并达到支架基体材料气体饱和吸附状态；
[0017](d)控制(c)步骤中的反应釜压力及温度，通过减压或加温的途径进行支架气体发泡制备三维微观小孔结构；
[0018](e)灭菌封装:将步骤(d)所得多尺度可控微孔结构骨组织工程支架进行灭菌封装。
[0019]作为优选，所述步骤(a)中，医用高分子材料骨组织工程支架宏观孔结构模型设计的孔隙率为60 %?90 %，三维宏观大孔尺度为:200-800M1，大孔之间为三维互穿连接，各向同性。
[0020]作为优选，所述步骤(b)中，医用高分子材料骨组织工程支架宏观孔结构由FDM快速成型技术打印制备，打印喷头直径为〇.2-0.8mm，打印速度为50-200mm/s。[〇〇21]作为优选，所述步骤(c)中，所述超临界气体吸附为超临界二氧化碳气体吸附，超临界点为:Tc = 31.3°C，Pc = 7.3MPa，超临界气体吸附过程吸附温度及压力高于超临界点， 吸附过程持续1?10小时。
[0022]作为优选，所述步骤(d)中，所述通过减压或加温的途径进行支架气体发泡制备三维微观小孔结构，减压速率>〇.5MPa/sec至标准大气压，加温途径中的发泡温度为对应热塑性高分子材料玻璃态转变温度以上10-50 °C ;
[0023]本发明还提供了一种所述多尺度可控微孔结构骨组织工程支架的用途:将其用作人体硬组织缺损的修复或骨组织工程用支架材料。[〇〇24]作为优选，本发明所述三级仿生的骨组织工程支架材料还可与药物、基因、细胞等复合制备具有特殊药物、生物学功能的骨组织工程支架。[〇〇25]本发明的有益效果:
[0026] 1、本发明所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架以可生物降解医用高分子材料为原料，从材料成分上保证了支架的生物安全性和生物相容性，促进了其骨组织修复功能。
[0027] 2、本发明所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架具有多层级的微纳米孔结构，高度仿生天然骨组织解剖结构，这种结构一方面可以通过建模预定制支架的力学性能以匹配骨组织的生物力学特性，另一方面可以从多尺度范围内模拟天然骨相类似的多孔微环境，有助于促进骨组织整合与修复。
[0028] 3、本发明所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，不但可以提供骨组织再生所需的三维支撑，同时其宏观大孔有利于宿主骨组织及血管的长入，其微孔小孔结构可以满足蛋白吸附、营养物质/代谢产物输送以及细胞迀移等，可以从多尺度层面上满足支架的生物学功能实现。
[0029] 4、本发明所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架的整个制备工艺中，无化学反应及有机溶剂参与，避免了有毒、有害物质对支架的污染。产品具有良好的外形结构可设计性和多尺度微孔结构可设计性能，同时支架具有可调控的力学特性，可有效满足匹配天然骨组织的生物力学要求。【附图说明】
[0030]图1为本发明的制备工艺流程图；
[0031]图2为通过FDM打印定制微米尺度三维多孔支架；
[0032]图3为通过超临界气体发泡成型支架内部纳米尺度微孔；
[0033]图4为经roM打印成型的微米尺度三维多孔组织工程支架的SEM图，其支架宏观孔结构中，经喷头挤出丝线直径约为400mi，三维宏观大孔尺度约为:200X200mi，孔隙率约为 60%，大孔之间三维互穿连接，各向同性，无纳米尺度微孔。
[0034]图5为经超临界气体发泡后支架内部纳米尺度微孔的SEM图，其支架保留了原有的宏观孔结构，同时打印丝线中经超临界气体发泡成型了部分微纳米尺度微孔，微孔分布均匀，大小不一，其微孔尺度约为l-5wii，经超临界气体发泡成型的微纳米尺度微孔经一步提高了支架的整体孔隙率，其支架整体孔隙率约为65%。微、纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通连接，无严格的取向性。[〇〇35]具体实施方法:
[0036]为达上述目的，本发明按照下述方法制备这种多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，下面结合附图对本发明工艺作进一步详述。
[0037]本发明的制备工艺流程如图1所示。仿生多尺度可控微孔结构骨组织工程支架的制备分为两个步骤，其一是通过快速成型技术三维打印对医用高分子材料定制微米尺度内的三维孔结构及外形;其二是将由快速成型技术三维打印制备的微米尺度支架进行超临界气体发泡，由此在支架结构内部形成微纳米尺度的二级微孔。经本发明制备工艺成型的仿生多尺度可控微孔结构骨组织工程支架具有从500纳米至1000微米范围内可调的多层级仿生类骨三维孔结构。该骨组织工程支架不但可以提供骨组织再生所需的三维支撑，而且可以从多尺度层面上满足蛋白吸附、营养物质/代谢产物输送、细胞迀移、组织长入的需要。 [〇〇38]本发明所适用的支架三维宏观大孔可由包括以下快速成型技术制备:如熔融沉积成型(Fused Deposit1n Modeling，FDM)、选择性激光烧结(Selective Laser Sintering， SLS)、恪丝制造(Fused Filament Fabricat1n，FFF)、选择性热烧结(Selective Heat Sinter ing，SHS)等快速成型技术。[〇〇39]本发明所适用的医用高分子材料为热塑性高分子材料，如临床常用的PLA、PLLA、 PLGA、PEG或它们经过任意比例共混得到的复合材料中的一种。热塑性医用高分子材料可以通过超临界气体发泡制备微孔结构。
[0040]本发明中所适用的超临界气体发泡所用气体为:《)2或他中的一种。[〇〇41]以下所列为本发明的几个最佳实施例，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。[〇〇42] 实施例1
[0043]以热塑性医用高分子材料PLA为原材料制备仿生多尺度可控微孔结构骨组织工程支架。其制作具体步骤如下:[〇〇44]1)选择? 1.75mm的医用级PLA材料线材，经由FDM三维打印成型微米尺度三维多孔组织工程支架，其具体打印工艺中，选择直径为? 0.2mm的单喷头打印，喷头温度为200°C， 打印速度为150mm/s，截面内的宏观孔设计尺寸为200 X 200wii的正交大孔，垂直方向分层厚度为200wii。其最终成型的支架外形尺寸为?8X6mm，支架维宏观大孔尺度约为:200X200 X 200mi，孔隙率约为50 %，大孔之间三维互穿连接，各向同性。
[0045]2)将步骤一得到的三维大孔组织工程支架经超临界二氧化碳气体发泡制备二级微纳米尺寸微孔。其气体发泡工艺中，设置的吸附气体环境为T = 35°C，P = 7.5MPa，吸附时间为5小时，发泡温度为T=100°C，发泡时间为5秒。其最终获得的支架保留了原有的宏观孔结构，支架维宏观大孔尺度约为= 215X215 X215M1，同时打印丝线中经超临界气体发泡成型了部分微纳米尺度微孔，微孔尺度约为2mi，微孔分布均匀，无严格的取向性。经超临界气体发泡成型进一步提高了支架的整体孔隙率，其支架整体孔隙率约为55%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。
[0046]实施例2
[0047]其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于步骤一中采用不同的三维打印工艺。其具体打印工艺中，选择直径为?〇.4mm的单喷头打印，喷头温度为200°C，打印速度为150_/ s，截面内的宏观孔设计尺寸为400 X 400wii的正交大孔，垂直方向分层厚度为400mi。其最终成型的支架外形尺寸为? 8 X 6mm，支架维宏观大孔尺度约为:400 X 400 X 400mi，孔隙率约为52%，大孔之间三维互穿连接，各向同性。经由实施例1中步骤二的超临界气体发泡工艺， 最终成型的仿生多尺度微孔结构支架的宏观大孔尺度约为:420X420X420wii，打印丝线中成型的二级微纳米尺度微孔约为2wii，其支架整体孔隙率约为57%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。此实施例在步骤一中通过三维打印工艺，调控了支架的一级宏观大孔结构。
[0048]实施例3
[0049]其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于步骤一中采用不同的三维打印工艺。其具体打印工艺中，选择直径为?〇.4mm的单喷头打印，喷头温度为200°C，打印速度为150_/ s，截面内的宏观孔设计尺寸为600 X 600wii的正交大孔，垂直方向分层厚度为400mi。其最终成型的支架外形尺寸为? 8 X 6mm，支架维宏观大孔尺度约为:600 X 600 X 400mi，孔隙率约为66%，大孔之间三维互穿连接，各向同性。经由实施例1中步骤二的超临界气体发泡工艺， 最终成型的仿生多尺度微孔结构支架的宏观大孔尺度约为:620X620X420wii，打印丝线中成型的二级微纳米尺度微孔约为2wii，其支架整体孔隙率约为70%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。此实施例在步骤一中通过三维打印工艺，调控了支架的一级宏观大孔结构。
[0050]实施例4
[0051]其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于步骤二中采用不同的超临界气体发泡工艺。其步骤二气体发泡工艺中，设置的吸附气体环境为T = 35°C，P = 8.0MPa，吸附时间为5 小时，发泡温度为T=100°C，发泡时间为5秒。通过超临界气体发泡，打印丝线中成型了部分微纳米尺度微孔，微孔尺度约为lMi，其最终获得的支架具有一级宏观大孔尺度为:212X 212X212M1，二级微纳米孔约支架整体孔隙率约为53%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。此实施例在步骤二中通过超临界气体发泡工艺，调控了支架的二级微纳米孔结构。[〇〇52] 实施例5
[0053]其它条件及工艺同实施例4,不同之处在于步骤二中采用不同的超临界气体发泡工艺。其步骤二气体发泡工艺中，设置的吸附气体环境为T = 40 °C，P = 9.0MPa，吸附时间为5 小时，发泡温度为T=100°C，发泡时间为5秒。通过超临界气体发泡，打印丝线中成型了部分微纳米尺度微孔，微孔尺度约为800nm，其最终获得的支架具有一级宏观大孔尺度为:208 X 208 X 208M1，二级微纳米孔约? 800nm，支架整体孔隙率约为52%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。此实施例在步骤二中通过超临界气体发泡工艺，调控了支架的二级微纳米孔结构。
[0054]实施例6
[0055]其它条件及工艺同实施例3,不同之处在于步骤二中采用不同的超临界气体发泡工艺。其步骤二气体发泡工艺中，设置的吸附气体环境为T = 40 °C，P = 9.0MPa，吸附时间为 10小时，发泡温度为T=110°C，发泡时间为5秒。通过超临界气体发泡，打印丝线中成型了部分微纳米尺度微孔，微孔尺度约为600nm，其最终获得的仿生多尺度微孔结构支架的宏观大孔尺度约为:612X612X412mi，打印丝线中成型的二级微纳米尺度微孔约为600nm，其支架整体孔隙率约为67 %。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。此实施例在步骤二中通过超临界气体发泡工艺，调控了支架的二级微纳米孔结构。
[0056] 实施例7[〇〇57]其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于选择不同的医用高分子PLLA作为原材料。其步骤一具体打印工艺中，选择直径为? 〇.4mm的单喷头打印，喷头温度为210 °C，打印速度为120mm/s，截面内的宏观孔设计尺寸为600 X 600wii的正交大孔，垂直方向分层厚度为 600wii。经由实施例1中步骤二的超临界气体发泡工艺，最终成型的仿生多尺度微孔结构支架中的一级宏观大孔为:620 X 620 X 420mi，二级微纳米尺度微孔约为2mi，其支架整体孔隙率约为70%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。
[0058]实施例8
[0059]其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于步骤二中选择不同的发泡气体进行二级微纳米孔制备。其步骤二的具体工艺中，设置的吸附气体为氮气(N2)环境为T = 30°C，P = 8.0MPa，吸附时间为10小时，发泡温度为T= 100°C，发泡时间为5秒。打印丝线中经氮气发泡成型了部分微纳米尺度微孔，微孔尺度约为1.2wii。其最终成型的仿生多尺度微孔结构支架中的一级宏观大孔为:215 X 215 X 21 5mi，二级微纳米尺度微孔约为1.2mi，其支架整体孔隙率约为54%。一级、二级微纳米尺度微孔之间三维互穿，彼此贯通。0)2及他均无毒性、价格低廉，经它们成型的二级微纳米孔不会存在有毒物质残留，可以确保组织工程支架的生物相容性，避免植入体在体内出现炎症反应。
[0060]实施例9细胞毒性实验
[0061]取上述各实施例中制备的支架试样作细胞毒性实验研究，实验中以IX 105个/样的细胞密度进行种植，Osteoblast细胞在该试样表面进行悬浮培养，培养环境条件为5% C02，37°C，第1、3、5天进行激光共聚焦细胞形貌观察，同时通过MTT比色法检测细胞的存活和生长状况，实验结果显示，在各实施例中制得的骨组织工程支架上细胞存活、生长、增殖状况良好，细胞整体存活率>95%。此说明经本发明提供的支架材料不但可以提供成骨细胞生长所需的三维介质，同时可从多尺度层面上满足细胞黏附所需的材料表面理化特性， 利于营养物质/代谢产物传输。同时本发明以无毒的C02作为发泡剂，制备工艺中无任何有机溶剂参与，无任何毒副隐患，安全可靠。
[0062]以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种仿生骨组织工程支架材料，其特征在于，所述支架为医用高分子材质，包含从微 米至纳米范围内多尺度可调的三维孔结构，具体包括由医用高分子构成的一级三维宏观大 孔结构以及分布于所述一级三维宏观大孔结构孔壁上的二级三维微观小孔结构。2.根据权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:所述支架 原材料为热塑性医用高分子材料。3.根据权利要求2所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于，所述热塑 性医用高分子材料为PLA、PLLA、PLGA、PEG或它们经过任意比例共混得到的复合材料中的一种。4.根据权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:支架的孔 隙率:30%?95%，三维宏观大孔尺度为:10-1000ym，大孔孔壁材料均匀分布三维球状微观小 孔，小孔尺度为500nm-10ym〇5.根据权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:所述支架 的一级三维宏观大孔由快速成型技术三维打印成型，三维打印快速成型技术为熔融沉积成 型(fused deposit1n modeling，FDM)、选择性激光烧结(selective laser sintering， SLS)、恪丝制造(Fused Filament Fabricat1n，FFF)、选择性热烧结(Selective heat sintering，SHS)等快速成型技术中的一种。6.根据权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于:所述支架 的二级三维微观小孔由超临界气体发泡制备，超临界气体发泡所用气体为二氧化碳或氮气 中的一种。7.—种如权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架，其特征在于，其制作 步骤包括:(a)医用高分子材料骨组织工程支架宏观孔结构预设计及建模；(b)医用高分子材料骨组织工程支架宏观孔结构经快速成型技术打印制备；(c)将上述(b)步骤中打印成型的支架置于超临界气体反应斧中进行气体吸附，并达到 支架基体材料气体饱和吸附状态；(d)控制(c)步骤中的反应釜压力及温度，通过减压或加温的途径进行支架气体发泡制 备三维微观小孔结构。8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，还包括步骤(e)灭菌封装:将步骤(d)所 得多尺度可控微孔结构骨组织工程支架进行灭菌封装。9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，医用高分子材料骨组 织工程支架宏观孔结构由H)M快速成型技术打印制备，打印喷头直径为0.2-0.8mm，打印速 度为50-200mm/s;所述步骤(d)中，所述通过减压或加温的途径进行支架气体发泡制备三维 微观小孔结构，减压速率0.5MPa/sec至标准大气压，加温途径中的发泡温度为对应热塑性 高分子材料玻璃态转变温度以上10-50 °C。10.—种如权利要求1所述的多尺度可控微孔结构骨组织工程支架的用途，其特征在 于，将其用作骨组织工程支架材料。
【文档编号】A61L27/54GK105944147SQ201610260534
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】周长春, 樊渝江, 王科锋, 朱向东, 裴玄, 殷国富, 张兴栋
【申请人】四川大学