毛诃子肉抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药毛诃子肉抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤药物中的应用。所述的提取物通过如下方法制备：维吾尔药毛诃子肉经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100：0-100:4，体积比）洗脱，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100：5-100:6，体积比）洗脱，氯仿：甲醇100：5-100:6洗脱液干燥即得。
【专利说明】
毛诃子肉抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药用途
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药毛诃子肉抗肿瘤提取物及其组合 物的医药用途和制备方法以及它在制备预防及治疗乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺 癌、宫颈癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的用途。
【背景技术】
[0002] 本品为使君子科植物毛诃子，学名Terminalia chebula Retz.，使君子科植物田比 黎勒Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.的干燥成熟果实。产于我国云南西部和西南 部。果皮和树皮富含单宁（35-40%)，为一有价值的鞣料植物，系制革工业重要原料之一。 果实供药用，能敛肺涩肠，为治疗慢性痢疾的有效良药。幼果干燥后通称"藏青果"，治慢性 咽喉炎，咽喉干燥等。木材供建筑、车辆、农具、家具等用。。
[0003] 毛诃子肉功效清热解毒，收敛养血，调和诸药之功效。用于各种热证，泻痢，黄水 病，肝胆病，病后虚弱。但是，对其抗肿瘤的有效成分一直不清楚，本发明通过系统地筛选 研究，意外地发现毛诃子肉提取物具有显著抗肿瘤活性，即毛诃子肉提取物对乳腺癌、宫颈 癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的具有很好的预防及治疗作用， 可以应用于癌症的预防和治疗。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供一种毛诃子肉提取物。
[0005] 本发明还提供了以毛诃子肉提取物为主要活性成分的组合物。
[0006] 本发明同时提供了毛诃子肉提取物及其组合物的制备和在制备抗肿瘤药物中的 应用。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0008] 维吾尔药毛诃子肉经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，用氯仿：甲醇混合溶剂梯度洗脱（氯仿：甲醇，比例见表1)，各氯仿：甲醇比例混合溶剂 洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外抗肿瘤活性筛选体系测试其抗肿瘤活性，意外地发现先用 氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100 :0-100:4,体积比）洗脱，继用氯仿：甲醇混合溶剂 (氯仿：甲醇，100 :5-100:6,体积比）洗脱，氯仿：甲醇100 :5-100:6洗脱液干燥后，具有显 著地抗肿瘤活性，而其他比例的洗脱部位，没有抗肿瘤活性。优选地，先用氯仿：甲醇混合溶 剂（氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积 比）洗脱，氯仿：甲醇100:6洗脱液干燥即得。本发明的抗肿瘤活性的化合物，可以通过以 上方法，得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该提取物从未见文献报道，其TLC分析 表征如图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=3:1:1显色方 法：香草醛-硫酸显色。
[0009] 具体，发现过程如下：
[0010] 1、毛诃子肉经溶剂超声提取物的制备
[0011] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL溶剂超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 SN0047A 6. 1726g，SN0047B 0· 8814g，合并共 2. 8508g 留样 0· 0362g。
[0012] 2、氯仿：甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果
[0013] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 SN0047A 6. 1726g，SN0047B 0. 8814g，合并共 2. 8508g 留样 0. 0362g。上柱，甲醇溶解，共用 甲醇15ml。上硅胶柱色谱，拌样硅胶3g，空白硅胶10g，玻璃柱内径2cm，SN0047A 6. 1726g， SN0047B 0.8814g，合并共2.8508g留样0.0362g。系统梯度洗脱（条件见表1)，柱体积 22ml，每个梯度洗脱200ml，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，氯仿：甲 醇梯度洗脱提取物TLC分析结果见图2，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸 乙酯：甲醇=3:1:1，氯仿：乙酸乙酯：甲醇=1:1:1，显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0014] 表 1
[0016] 3、抗肿瘤活性筛选方法和结果
[0017] 1)实验条件
[0018] a)细胞株信息
[0019] 人乳腺癌细胞株MCF7购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0020] b)药品及试剂
[0021] 样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1640培 养液稀释至所需浓度（DMSO彡1%。）。
[0022] RPMI Medium 1640培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐（MTT)。
[0023] c)仪器
[0024] CO2培养箱（SANYO,日本）
[0025] 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）
[0026] 倒置生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）
[0027] 低/高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
[0028] 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）
[0029] 酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）
[0030] 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）
[0031] 鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）
[0032] PH 计（SART0RIUS，德国）
[0033] 2)实验方法和过程
[0034] 人乳腺癌细胞株MCF7以4000/孔的密度铺于96孔板，每孔IOOul，12h后使用。 各组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液，保存于-20°C待用。铺板后12h，观察细胞汇合率 约为40%，加药，浓度均为100 μ g/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组（培 养基+细胞；含〇. 1 % DMSO培养基+细胞），3个空白孔（只有培养基）。加入药物24小 时后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑盐化学名为3-(4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，继续培养 4 小时。完全弃去上清液，加入100 μ I DMS0,混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD 值。
[0035]
[0036] 3)实验结果
[0037] 表 2
[0038]
[0041] 结果发现：本发明优选的技术方案为：维吾尔药毛诃子肉经溶剂超声提取，提取 液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4， 体积比）洗脱，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱，氯仿：甲醇 100:6洗脱液经回收有机溶剂，干燥，得到高活性提取物，即为该抗肿瘤的提取物。该提取物 从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0042] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究
[0043] 1)提取溶剂的种类研究
[0044] 分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有 机溶剂提取，并测试提取物对MCF7细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0045] 表 3
[0046]
[0047] 研究结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水 混合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0048] 2)提取溶剂的用量研究
[0049] 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍（重量/体积比）有机溶剂提取，并测试提取物 对MCF7细胞的的抗肿瘤活性，结果如下：
[0050] 表 4
[0053] 提取物提取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。
[0054] 3)干燥方法的研究
[0055] 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到 的抗肿瘤活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干 燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对MCF7细胞抗肿瘤活性提取物进行干燥，其 中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0056] 表 5
[0057]
[0058] 因此，毛诃子肉抗肿瘤提取物的制备方法为：
[0059] 维吾尔药毛诃子肉经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱2-50倍柱体积，继用氯 仿-甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱2-50倍柱体积，氯仿：甲醇100:6洗 脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该提取物。以上条件最优为先用氯仿-甲醇混合溶剂（氯 仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6， 体积比）洗脱15倍柱体积。其中，
[0060] 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶 剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用有机溶剂用量为药材重量 的2-50倍（重量/体积比）。
[0061] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0062] 5.毛诃子肉抗肿瘤有效提取物（先用氯仿：甲醇=100:4洗脱，再用氯仿：甲醇= 100:6洗脱得到的提取物）的抗肿瘤活性研究
[0063] 利用各种肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝 癌等恶性肿瘤细胞株，分别测试毛诃子肉提取物对MCF-7抗肿瘤的抗肿瘤活性，IC5。结果如 下：
[0064] 表 6
[0068] 因此，我们发现，毛诃子肉抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性，可望用于各种肿瘤如乳 腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤、肝癌等恶性肿瘤细胞株的预防及治 疗。
[0069] 6、毛诃子肉抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研究
[0070] 1)固体分散体
[0071] 处方
[0073] 制备方法：
[0074] 称取毛诃子肉提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量 比分别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至毛诃子肉提取物和载体完全溶解，转 入旋蒸仪中除去溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得毛诃子肉提取物PVP包合物。
[0075] 2)环糊精包合物
[0076] 处方：
[0078] 制备方法：
[0079] 将β -环糊精与1-5倍水研匀，加毛诃子肉提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0080] 3)分散片处方：
[0081] 毛诃子肉提取物 10:0 十-烷基硫酸钠 1. 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 10: 微分硅胶 0.3
[0082]
[0083] 制备方法：
[0084] 1.毛诃子肉提取物淀粉分散体的制备，精密称取毛诃子肉提取物，加入适量的 十二烷基硫酸钠，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温度 下蒸干，粉碎，过100目筛；
[0085] 2.称取处方量，毛诃子肉提取物淀粉分散体，交联聚维酮，预胶化淀粉，用70%乙 醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60°C烘箱烘干 45min，16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
[0086] 7、毛诃子肉抗肿瘤有效提取物的检测方法研究
[0087] 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示毛诃子肉抗肿瘤有效提取 物的特征。见图1。.
[0088] 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)，显色方法： 香草醛浓硫酸显色
【附图说明】：
[0089] 图1毛诃子肉MCF7抑制活性提取物的TLC色谱图；
[0090] 图2毛诃子肉得到的化学组分的TLC色谱图。
【具体实施方式】
[0091] 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0092] 实施例1 :
[0093] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积 比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱 体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率0. 07%。
[0094] 实施例2 :
[0095] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积 比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱 体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该提取物，收率0. 056%。
[0096] 实施例3 :
[0097] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积 比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱 体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干燥，即为该提取物，收率0. 049%。
[0098] 实施例4 :
[0099] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶分 离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积 比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱 体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，离心干燥，即为该提取物，收率0. 053%。
[0100] 实施例5 :
[0101] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用娃 胶分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体 积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍 柱体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，旋蒸干燥，即为该提取物，收率0. 052%。
[0102] 实施例6 :
[0103] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1:1)超声提取 15min，提取液浓缩后，用硅胶分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合 溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲 醇，100:6，体积比）洗脱15倍柱体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥， 即为该提取物，收率0.061 %。
[0104] 实施例7 :
[0105] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1:1)超声提取 15min，提取液浓缩后，用硅胶分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混合 溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿：甲 醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥， 即为该提取物，收率〇. 056%。
[0106] 实施例8 :
[0107] 取维吾尔药毛诃子肉20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=90:10)超声提 取15min，提取液浓缩后，用硅胶分离，上样后的硅胶柱（2cm内径小柱），先用氯仿：甲醇混 合溶剂（氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱10倍柱体积，继用氯仿：甲醇混合溶剂（氯仿： 甲醇，100:6,体积比）洗脱15倍柱体积，氯仿：甲醇100:6洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干 燥，即为该提取物，收率〇. 065%。
[0108] 实施例9 :固体分散体
[0109] 称取毛诃子肉提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量 比分别放入烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，磁力搅拌器搅拌至毛诃子肉提取物和载体 完全溶解，充分混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得毛诃子 肉提取物PVP包合物。
[0110] 实施例10 :环糊精包合物
[0111] 将β -环糊精与1-5倍水研匀，加毛诃子肉提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0112] 实施例11 :分散片
[0113] 1.称取干燥的毛诃子肉提取物，加入适量的十二烷基硫酸钠，使用70%的乙醇充 分溶解，加入水溶性淀粉与毛诃子肉提取物（I: 1)，搅拌混合均匀，在70°c下干燥，粉碎，过 100目筛，得毛诃子肉提取物分散体。
[0114] 2.精密称取处方量，毛诃子肉提取物分散体，交联聚维酮，可压性淀粉，用70% 乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，14目筛制成湿颗粒，室温下放置15min后，70°C烘箱烘干 45min，16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
【主权项】
1. 一种维吾尔药毛诃子肉提取物，其特征为，维吾尔药毛诃子肉经溶剂超声提取，提取 液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱先用体积比100 :0-100:4的氯仿：甲醇混合溶剂 洗脱，继用体积比100 :5-100:6的氯仿：甲醇混合溶剂洗脱，氯仿：甲醇100 :5-100:6洗脱 液干燥即得。2. 如权利要求1所述的维吾尔药毛诃子肉提取物，其特征为，先用体积比100:4氯 仿-甲醇混合溶剂洗脱，继用体积比100:6的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，氯仿：甲醇100:6 洗脱液经回收有机溶剂，干燥即为该提取物。3. 如权利要求1或2所述的维吾尔药毛诃子肉提取物，其特征为，提取用溶剂为甲醇、 乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，优选甲醇或95%乙醇，提 取用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。4. 如权利要求1-3任何一项所述维吾尔药毛诃子肉提取物，其特征为，先用体积比 100:4的氯仿：甲醇混合溶剂洗脱2-50倍柱体积，继用体积比100:6的氯仿：甲醇混合溶剂 洗脱2-50倍柱体积。5. 如权利要求1-4任何一项所述的维吾尔药毛诃子肉提取物，其特征为，先用体积比 100:4的氯仿：甲醇混合溶剂洗脱10倍柱体积，继用体积比100:6的氯仿：甲醇混合溶剂洗 脱15倍柱体积。6. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的毛诃子肉提取物 和药学上可接受的载体。7. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-5任何一项所述的毛诃子肉提取物或 权利要求6所述的药物组合物。8. 权利要求1-5任何一项所述的毛诃子肉提取物或权利要求6所述的组合物或权利要 求7所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征为，所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰 腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤或肝癌。10. 如权利要求1-5任何一项所述的毛诃子肉提取物，其特征在于，用TLC法检测，其 色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇=3:1:1，氯仿：乙酸乙酯：甲醇 =1:1: 1，显色方法：香草醛-硫酸显色。
【文档编号】A61K36/185GK105982929SQ201510082182
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】王金辉, 黄健, 刘晓雪
【申请人】沈阳药科大学