专利名称：一种广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及利用微生物降解农药残留的技术，特别是一种广谱降解土壤有机磷杀虫剂残留的细菌复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
近年来，有机磷杀虫剂在国内外农业中作为主要的农药，得到了广泛使用。有机磷农药(organophosphorus pesticides, Ops)由于具有高效和使用成本低等特点，使其在世界农业中起着极其重要的作用。我国农药产品结构仍以杀虫剂为主，杀虫剂的生产量占农药总产量70%左右，其中有机磷杀虫剂占杀虫剂总产量的70%，在年产量万吨以上的6个杀虫剂品种中，有5个是有机磷杀虫剂。有机磷杀虫剂从分子结构上主要分磷酸酯类(P = 0键)和硫代磷酸酯类(P = S键)两大类，按毒性划分，有机磷杀虫剂又分为剧毒类(甲拌磷、对硫磷、内吸磷等)、高毒类(甲基对硫磷、甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等)、中毒类(乙硫磷、敌百虫等)和低毒类(辛硫磷、马拉硫磷等)。由于其大多属于中高毒性农药，且多具有内吸毒性，在环境中残留量大，一般情况下有机磷农药的有效利用率仅为20 30%，大部分都残留在土壤或水体之中，水田中施用的有机磷农药几乎有90%左右都残留在农田。在保护农作物的同时，也造成环境的严重污染，并且已经危及到人体健康。减少农药的使用是解决农药危害的根本出路，农药残留的去除也是减少农药危害的有效途径。有机磷农药消除方法有许多，包括物理的、化学的和生物的。传统的物理方法 (包裹、焚烧和掩埋)和化学方法(包括氧化、还原和水解)成本高，可能产生新的污染物， 且作用相对较慢。利用生物或生物产品来降解污染物的生物修复方法具有无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和降解高浓度农药残留的一种安全、有效、廉价的方法。目前，国外许多专家学者致力于研究有机磷农药的生物降解技术，国内也有许多有机磷农药降解技术以及降解微生物筛选方面的研究报道，例如在敌敌畏、敌百虫、以及甲基对硫磷等常用有机磷农药的微生物降解技术方面有较详细的报道。对降解有机磷农药的微生物研究已有几十年的历史，已报道的能降解有机磷农药的微生物有细菌、真菌、放线菌和藻类等。例如，王善银等分离到一株黄杆菌(Flavobacterium sp. P3-2)，该菌具有广泛的底物适应能力可降解对硫磷、水胺硫磷、甲基对硫磷等；王永杰等从污泥中分离筛选到1株以共代谢方式可广谱降解有机磷农药的芽孢杆菌，初步鉴定为地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)。该菌对农药甲胺磷、敌敌畏、对硫磷的最高耐受浓度分别为3500，500，300mg/L。在30°C，100r/min 培养条件下，72h内对500mg/L甲胺磷、200mg/L敌敌畏、100mg/L对硫磷的降解率分别为 75. 8%,50. 3%和 25. 4%。国内外研究比较多的降解有机磷杀虫剂的微生物大部分是专一性裂解P = 0键或 P = S键，仅起到降解某一类有机磷杀虫剂的作用，降解范围具有局限性，并且降解率较低。 除了单菌株应用的报道外，曾有以细菌多菌株矿化对硫磷的报道，许多研究、实验还仅处于实验室阶段。到目前为止，未见到有利用两种或两种以上细菌联合降解土壤有机磷杀虫剂残留的报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的是提供一种广谱降解土壤有机磷杀虫剂残留的细菌复合菌剂及其制备方法，可有效解决土壤中多种有机磷杀虫剂残留的降解，减轻对环境的污染 ，及对人体健康危害的问题。本发明解决的技术方案是该复合菌剂是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液以体积比0.1 3 1复合配制而成，其制备方法是将有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水以重量比1 9制成混悬液，然后再用灭菌水ICT1 10_6倍比稀释后(即将混悬液用灭菌水稀释10 1000000倍)，涂布于甲拌磷基础盐固体培养基平板上，25 37°C，培养1 3 天，其中甲拌磷基础盐固体培养基为NaC10. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 · 7H20 0. Olg，琼脂1. 5g，加蒸馏水至IOOmL, pH 5. 5 7. 5，高压灭菌后冷却至50°C 左右，加入甲拌磷使其终浓度为100mg/L制成；所说的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水；在上述平板上挑取单菌落，通过平板划线分离纯化出两株细菌菌株J5P2和J2,经生理生化和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J5P2 (以下简称枯草芽孢杆菌J5P2，其基因序列在GenBank上的登录号为HM347450)和假单胞菌Pseudomonas sp. J2 (以下简称假单胞菌J2)；再经甲拌磷基础盐培养基传代驯化，方法是，取上述J5P2和J2菌接种入甲拌磷基础盐固体培养基中，25 37°C培养1 3天后，再接种入质量浓度为200mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基上，25 37°C培养1 3天，再接种入质量浓度为300mg/L的甲拌磷基础盐固体培养上，25 37°C，培养1 3天，以此连续传代培养，每次使甲拌磷质量浓度增加100mg/L，至甲拌磷最终浓度达500mg/L为止，完成传代驯化，传代驯化后，将驯化后的菌株J5P2和J2分别接种于LB液体培养基斜面，制成斜面菌种，_4°C保存，所说的LB液体培养基为胰蛋白胨(Tryptone)Ig,酵母提取物(YeastExtract)O. 5g，氯化钠(NaCl) lg，琼脂 (Agar) 1. 5g，加蒸馏水至IOOmL制成，pH 5. 5 7. 5。取上述J5P2和J2斜面菌种在甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基上活化24h 72h后，分别挑取J5P2和J2单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心lOmin，收集菌体，经0. 05M PH7. 4的Tris-HCl洗涤3次，再用0. 05mol/L,pH7. 4的Tris-HCl调整菌液浓度，使其浓度为IXlOici个/mL，成种子液，将上述J5P2*J2两种种子液以体积比0.1 3 1组配成具有广谱降解有机磷杀虫剂的细菌菌剂。不同含甲拌磷质量浓度的甲拌磷基础盐培养盐只是甲拌磷量的多少不同，其他组分量均是相同的。本发明的细菌菌剂用于土壤有机磷杀虫剂残留的降解，其优点在于1.该细菌菌剂抗逆性强、且降解酶系丰富，降解底物范围广，它不仅能降解以甲拌磷、辛硫磷为代表的硫代磷酸酯类(P = S键)有机磷杀虫剂，还能降解以氧化乐果为代表的磷酸酯类(P = O键)有机磷杀虫剂。2.该菌剂应用两种细菌配比实现了优势互补，有效地提高了对有机磷杀虫剂的降解率，缩短了降解时间。对甲拌磷的降解率最高达85 %，对辛硫磷降解率最高达70 %，对氧化乐果降解率最高达83%，比单菌菌剂的降解率高出10 40%。3.该菌剂对有机磷杀虫剂污染的土壤修复效果良好，能把有毒有害的有机磷转化成能被农作物直接吸收利用的无机磷，转化效率高，环保效果明显。生产采用通用发酵设备，生产工艺简单，生产原料易得，成本低，应用操作方便，无污染产生，易于推广应用。具体实施例方式以下结合具体情况对本发明的具体实施方式
做详细说明。本发明在具体实施时，可由所述的枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的种子液以体 积比0.5 1或1 1或2.5 1或3 1复合配制而成，其制备方法是由以下步骤实现的1、将有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水以重量比为1 9混配在一起，配制成混悬液，再用灭菌水将混悬液以 ο—1 10_6倍比稀释后，涂布于含甲拌磷质量浓度为100mg/L 的基础盐固体培养基平板上，温度25 37°C，培养1 3天；2、在上述平板上挑取单菌落经平板划线分离纯化后得到两株细菌，经生理生化和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J5P2，简称为J5P2，和假单胞菌 Pseudomonas sp. J2，简禾尔为 J2 ；3、传代驯化取上述J5P2和J2菌接种入甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基中， 300C，培养2天后，再接种入含甲拌磷质量浓度为200mg/L的甲拌磷基础盐培养基上，培养 2天后，再接种入含甲拌磷质量浓度为300mg/L的甲拌磷基础盐培养基上，培养2天，以此， 连续传代培养，每次使甲拌磷质量浓度增加100mg/L，直至甲拌磷终浓度达500mg/L为止， 完成传代驯化，将传代驯化后的J5P2和J2分别接种于LB液体培养基平板斜面上，成斜面菌种，-4°C保存；4、种子液的制备取上述斜面菌种J5P2和J2在含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基上活化24h 72h后，分别挑取J5P2和J2单菌落接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期，5000r/min离心IOmin,收集菌体，经0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗涤3次，再用 0. 05mol/L、pH7. 4的Tris-HCl调整菌液浓度，使其浓度为1 X IO10个/mL，成种子液；5、细菌菌剂的配制取上述J5P2和J2种子液以体积比0. 1 3 1配制成细菌菌剂。细菌菌剂的配制方法是①按4-6%接种量将不同组合接种于IOOmL以唯一碳源，含甲拌磷浓度为300mg/ L的甲拌磷基础盐液体培养基中，同时不接菌的甲拌磷基础盐固体培养基为对照。25 370C，最好30°C，培养3 5天后，最好5°C，用气相色谱测定其对甲拌磷的降解率为75%， 所说的甲拌磷基础盐液体培养基为NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 ·7Η20 0. 01g，加蒸馏水至lOOmL，pH 5. 5 7. 5，再加入甲拌磷，使其甲拌磷浓度 300mg/L 制成；②按4-6%接种量将不同组合接种于IOOmL以辛硫磷质量浓度为300mg/L为唯一碳源的基础盐培养基中，同时不接菌的甲拌磷基础盐固体培养基为对照。25 37°C，培养 3 5天后，用液相色谱测定其对辛硫磷的降解效果；③按4-6%接种量将不同组合接种于IOOmL以氧化乐果最终质量浓度为IOOOmg/ L为唯一碳源的基础盐培养基中，同时不接菌的甲拌磷基础盐培养基为对照，培养3 5天后，用气相色谱测定其对氧化乐果的降解效果；
最终筛选出两种种子液的最佳配比范围为枯草芽孢杆菌J5P2 假单胞菌J2 = 0. 1 3 1在以有机磷农药为唯一碳源的甲拌磷基础盐培养基中，25°C，培养5天，所得细菌菌剂对甲拌磷降解率为55 75%，耐受甲拌磷最高浓度为500mg/L ；对辛硫磷降解率为 60 73%，耐受辛硫磷最高浓度为500mg/L ；对氧化乐果的降解率为50 70%，耐受氧化乐果最高浓度为5000mg/L。枯草芽孢杆菌J5P2单菌菌剂对甲拌磷、辛硫磷和氧化乐果的降解率分别为30 55%、35 55%、40 65%，假单胞菌J2单菌菌剂对甲拌磷、辛硫磷和氧化乐果的降解率分别为40 5 5%、35 60%、40 65%。实施例1本发明在具体实施时，还可采用以下步骤1、将含有有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水以重量比为1 9混配在一起，配制成混悬液，再用灭菌水将混悬液稀释100倍后，涂布于含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基平板上，在30°C，培养时间2天；2、在上述平板上挑取单菌落经平板划线分离纯化后得到两株细菌，经生理生化和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J5P2和假单胞菌Pseudomonas sp. J2 ；3、传代驯化取上述J5P2和J2菌接种入含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基中，30°C培养2天后，再接种入含甲拌磷质量浓度为200mg/L的基础盐固体培养基上， 在30°C培养2天，再接种入含甲拌磷质量浓度为300mg/L的基础盐固体培养基上，30°C培养2天，以此，连续传代培养，每次使甲拌磷质量浓度增加100mg/L，直至甲拌磷终浓度达 500mg/L为止，完成传代驯化，将传代驯化后的J5P2和J2分别接种于LB液体培养基平板斜面上，成斜面菌种，-4°C保存；4、取上述斜面菌种J5P2和J2在含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基上活化24h 72h后，分别挑取J5P2和J2单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心IOmin,收集菌体，经0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗涤3次，再用0. 05Μ ΡΗ7. 4的Tris-HCl重新悬浮，调整菌液浓度，使其浓度为1 X IO10个/mL，成种子液，将种子液以J5P2 J2 = 3 1的体积配比配制成细菌菌剂，按4 6%接种量接种于IOOmL以甲拌磷为唯一碳源(含甲拌磷300mg/L)的甲拌磷基础盐培养基中，同时不接菌的基础盐培养基为对照，·培养5天后，用气相色谱法测得对甲拌磷的降解率为75%。实施例2以上述实例1的方法制得J5P2和J2种子液，按J5P2 J2 = 0.5 1的体积比制得细菌菌剂，将300mg/L辛硫磷水溶液均勻喷洒在200g灭菌试验土壤上，取20mL细菌菌剂接种于该试验土壤中混勻，加灭菌水调节含水量至60%的土壤湿度，将试验土壤置于30°C条件下培养，同时以不接菌的为空白对照，5天后取样用液相色谱法测定辛硫磷残留量，培养过程中加入无菌水保持60%的土壤湿度。培养5天，用液相色谱测得对辛硫磷的降解率为 73%。实施例3以上述方法，还可按种子液J5P2 J2=I 1或2 1的体积比制得本发明细菌菌剂。本发 明细菌菌剂经田间多次反复试验，取得了非常好的技术效果，有关实验情况如下田间试验选取交通便利、易于观察及管理、有代表性的田块，要求田块方正、田面平整、肥力均勻、排灌方便、种植水平与当地生产水平相当的河南省有机磷农药应用较多的济源市郊区小麦田。本试验共分两组(1)对照组常规施肥+多次喷施氧化乐果(其浓度为500mg/L)有机磷农药的田地。(2)处理组河南省科学院生物有限公司生产的有机磷农药降解菌剂处理组(常规施肥+生物所降解菌剂+多次喷施氧化乐果(其浓度为500mg/L)有机磷农药的田地) 试验设3次重复，处理随机排列，小区面积不小于60平方米。以实施例1同样的方法，按J5P2 J2 = 1 1的体积比制得细菌菌剂，按200mL/ m2的剂量喷洒于处理组土壤表面，分别在使用菌剂0、3、5、7、10天后取样，每小区按“S”形方法采取土样送检。检测土样有机磷农药氧化乐果残留量和无机磷(有效磷)含量变化。有机磷农药氧化乐果残留量结果如表1所示，在使用菌剂5天后氧化乐果基本降解完全，比对照组提前了 2 3天。由表2可知，施用菌剂的处理组比没施用菌剂的对照组 (即自然降解组)在施用菌剂后10天内土壤中无机磷(有效磷)含量有显著增加，并且在 5 7天无机磷转化效率较高。表1氧化乐果残留量(mg/Kg)
权利要求
1.一种广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液以体积比0.1 3 1复合配制而成。
2.根据权利要求1所述的广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂，其特征在于，是由所述的枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液以体积比0.5 1，或1 1，或2.5 1，或 3 1复合配制而成。
3.权利要求1或2所述的广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂的制备方法，其特征在于，将有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水以重量比1 9制成混悬液，然后再用灭菌水KT1 10_6倍比稀释后，涂布于甲拌磷基础盐固体培养基平板上，25 37°C，培养1 3 天，其中甲拌磷基础盐固体培养基为=NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、 MgSO4 · 7H20 0. Olg,琼脂1. 5g，加蒸馏水至IOOmL, pH 5. 5 7. 5，高压灭菌后冷却至50°C， 加入甲拌磷使其终浓度为100mg/L制成，所说的灭菌水是蒸馏水经灭菌后的水；在上述平板上挑取单菌落，通过平板划线分离纯化出两株细菌菌株，经生理生化和16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J5I32和假单胞菌I^seudomonas sp. J2;再经甲拌磷基础盐固体培养基传代驯化，方法是，取上述J5P2和J2菌接种入甲拌磷基础盐固体培养基中， 25 37°C培养1 3天后，再接种入质量浓度为200mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基上， 25 37°C培养1 3天，再接种入质量浓度为300mg/L的甲拌磷基础盐固体培养上，25 37°C，培养1 3天，以此连续传代培养，每次使甲拌磷质量浓度增加100mg/L，至甲拌磷最终浓度达500mg/L为止，完成传代驯化，传代驯化后，将驯化后的菌株J5P2和J2分别接种于LB培养基斜面，制成斜面菌种，-4°C保存，所说的LB培养基为胰蛋白胨lg，酵母提取物 0. 5g，氯化钠lg，琼脂1. 5g，加蒸馏水至IOOmL制成，pH 5. 5 7. 5，取上述J5P2和J2斜面菌种在甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐培养基上活化24h 7 后，分别挑取 J5P2和J2单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心lOmin，收集菌体，经 0. 05mol/L、pH7. 4 的 iTris-HCl 洗涤 3 次，再用 0. 05mol/L、pH7. 4 的 iTris-HCl 调整菌液浓度，使其浓度为1 X 101°个/mL士0. 5%，成种子液，将上述J5P2和J2两种种子液以体积比0.1 3 1组配成具有广谱降解有机磷杀虫剂的细菌菌剂。
4.根据权利要求3所述广谱降解有机磷杀虫剂的细菌复合菌剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现(1)、将含有有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水以重量比为1 9混配在一起，配制成混悬液，再用灭菌水将混悬液稀释100倍后，涂布于含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基平板上，在30°C，培养时间2天；(2)、在上述平板上挑取单菌落经平板划线分离纯化后得到两株细菌，经生理生化和 16S rDNA测序鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis J5P2和假单胞菌Pseudomonas sp. J2 ；(3)、传代驯化取上述J5P2和J2菌接种入含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基中，30°C培养2天后，再接种入含甲拌磷质量浓度为200mg/L 的基础盐固体培养基上， 在30°C培养2天，再接种入含甲拌磷质量浓度为300mg/L的基础盐固体培养基上，30°C培养2天，以此，连续传代培养，每次使甲拌磷质量浓度增加100mg/L，直至甲拌磷终浓度达 500mg/L为止，完成传代驯化，将传代驯化后的J5P2和J2分别接种于LB液体培养基平板斜面上，成斜面菌种，-4°C保存；(4)、取上述斜面菌种J5P2和J2在含甲拌磷质量浓度为100mg/L的甲拌磷基础盐固体培养基上活化24h 7 后，分别挑取J5P2和J2单菌落接种于LB液体培养基中培养至对数生长期，5000r/min离心IOmin,收集菌体，经0. 05M ρΗ7· 4的Tris-HCL洗涤3次，再用 0. 05mol/L, pH7. 4的Tris-HCl调整菌液浓度，使其浓度为1 X 101°个/mL，成种子液，将种子液以J5P2 J2 = 3 1的体积配比配制成细菌菌剂，按4 6%接种量接种于IOOmL以唯一碳源含甲拌磷300mg/L的甲拌磷基础盐液体培养基中，同时不接菌的基础盐培养基为对照，培养5天后，用气相色谱法测得对甲拌磷的降解率为75%，所说的甲拌磷基础盐液体培养基为 NaCl 0. lg、KH2PO4O. 05g、K2HPO4O. 15g、NH3NO3O. lg、MgSO4 · 7H20 0. Olg，加蒸馏水至 IOOmL, pH 5. 5 7. 5，再加入甲拌磷，使其甲拌磷浓度300mg/L制成。
全文摘要
本发明涉及广谱降解土壤有机磷杀虫剂残留的细菌复合菌剂及其制备方法，可有效解决土壤中多种有机磷杀虫剂残留的降解，减轻对环境的污染，及对人体健康危害的问题，该复合菌剂是由枯草芽孢杆菌J5P2和假单胞菌J2的菌液以体积比复合而成，其制备方法是将有机磷杀虫剂污染的土壤与灭菌水制成混悬液，经稀释后，涂布于平板上培养，挑取单菌落，通过平板划线分离纯化出两株细菌菌株J5P2和J2，再经甲拌磷基础盐培养基传代驯化并制成种子液，将两种种子液混配在一起，成广谱降解土壤有机磷杀虫剂残留的细菌复合菌剂，有效用于土壤有机磷杀虫剂残留的降解，土壤修复效果良好，成本低，环保，经济和社会效益巨大。
文档编号A62D101/04GK102154103SQ20101060326
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者刘莹莹, 李冠杰, 王继雯, 甄静, 谢宝恩 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司