一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用。所述基因是通过对有机磷降解酶基因的第253位、256位和271位三个氨基酸编码位点进行定点突变获得的。将具有突变的有机磷农药降解酶基因的核苷酸序列连接于载体pHT43中，然后将表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主细胞中进行表达，分离获得具有有机磷农药降解活性的表达蛋白。本发明中通过突变基因表达的有机磷农药降解酶与底物乙基对硫磷的亲和力和敏感性显著提高，其酶活力有明显提高，可用于农产品中有机磷农药残留的降解和消除，为工程酶降解有机磷农药开辟了新途径。
【专利说明】一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因生物工程领域，具体涉及一种突变的有机磷农药降解酶基因及其应用。
【背景技术】
[0002]随着科学的发展与社会的进步，越来越多的化合物进入人类的生产与生活环境。同时，许多人工合成且难以被自然环境降解转化的污染化合物进入自然界中，农药就是其中的一种。
[0003]目前使用的农药以杀虫剂为主，占总用量的70%;其中有机磷杀虫剂占整个杀虫剂用量的70%以上；而有机磷农药中高毒品种的产量又占有机磷农药产量的70%，这就是所谓结构不合理的三个“70%”。有机磷农药种类繁多，仅我国使用的就有三十余种，它们均具有一个五价磷原子的共性化学结构，其中毒机理是磷原子与乙酰胆碱酯酶共价结合形成磷酰化酶，阻断了乙酰胆碱的水解反应，导致神经系统中乙酰胆碱的累积引发突触的过渡兴奋，抑制神经冲动传导，产生一系列神经综合症，因此对人类与动物造成极大危害。然而，21世纪的农业发展仍离不开农药，如果要完全停止化学农药的生产与使用是不切实际的。因此，在合理使用有机磷农药的前提下，如何减少与消除有机磷农药的污染成为日益严峻的任务。
[0004]有机磷降解方面的最 初研究是有机磷降解菌株的分离与筛选。1973年Sethunarhan与Yoshida首次筛选并分离出了一株能降解对硫磷与二嗪农磷的黄杆菌(ATCC27551)。到目前为止，已发现了包括细菌、真菌、放线菌和藻类等不同微生物都能降解有机磷农药，其中细菌包括节细菌、假单胞菌、黄杆菌等二十余种，真菌中有木霉、青霉、曲霉等。随着进一步的研究发现，降解菌通过分泌一种能够水解磷酸酯键的酶(即有机磷降解酶)来实现对有机磷农药的降解作用。研究发现各种有机磷农药的结构都是类似的，只是取代基不同，因此一种有机磷降解酶可同时降解多种有机磷农药。分泌有机磷降解酶的天然微生物降解有机磷农药的速度缓慢，同时要求的生长环境条件比较严格，而直接使用有机磷降解酶制剂，降解效率远远高于使用产生这类酶的菌株。有机磷降解酶降解有机磷农药的效率高，只需数分钟就可将所使用农药的80%以上降解掉。到目前为止，多种酶已被鉴定出可用于降解有机磷农药，如从缺陷型假单胞菌(PTE)和放射形土壤杆菌属分离出的磷酸三酯酶。但是，有机磷降解酶在天然菌株中含量过低，提取成本比较高昂。近些年来，对有机磷降解酶的研究已进入分子水平，并取得了巨大的研究进展，不仅加深了对有机磷降解酶分子作用机制的了解，而且为通过基因工程和酶工程改良有机磷降解酶的性质，研制出适用于不同应用领域的有机磷降解酶产品奠定了基础。
[0005]大肠杆菌表达的有机磷降解酶(OpdA)在其应用中存在食品安全隐患；同时重组蛋白在大肠杆菌的胞质中以包涵体的形式产生，而包涵体的纯化与复性过程会对酶活力产生一定负面影响。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于通过基因工程技术对现有的有机磷农药降解酶进行氨基酸定点突变，提供一种突变的有机磷农药降解酶基因，以显著地提高该酶的活性和底物亲和性，克服农产品中有机磷农药残留的降解和消除中现有技术的不足，使改造后的有机磷农药降解酶对有机磷农药更敏感。
[0007]本发明所要解决的又一技术问题在于将上述定点突变后的有机磷农药降解酶基因在枯草芽孢杆菌表达系统中快速高效地获得表达。用此种方法获得的活性蛋白经过纯化之后便可以获得改造的有机磷农药降解酶，最终达到工业化生产的要求，为研制有机磷农药降解酶制剂产品提供了高活性的酶材料，具有很大的应用价值。
[0008]为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现:
[0009]一种突变的有机磷农药降解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。所述突变的有机磷农药降解酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010]通过将所述突变的有机磷农药降解酶基因与载体PHT43连接，获得一种含有所述突变的有机磷农药降解酶基因的表达载体。
[0011]本发明还提供了所述突变的有机磷农药降解酶基因的表达蛋白的制备方法，包括如下步骤:
[0012]I)利用反向PCR法依次对序列如SEQ ID NO:3所示的有机磷农药降解酶基因的第253位、256位和271位3个氨基酸编码位点进行突变，得到突变的有机磷农药降解酶基因序列并测序验证；
[0013]2)将前述突变的有机磷农药降解酶基因的核苷酸序列连接于载体PHT43中，形成有机磷农药降解酶基因表达载体；
[0014]3)将前述获得的表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主细胞中，形成含有突变的有机磷农药降解酶基因的重组细胞；
[0015]4)在适合有机磷农药降解酶表达的条件下，培养前述重组细胞；
[0016]5)分离获得具有有机磷农药降解活性的表达蛋白。
[0017]本发明还提供了所述突变的有机磷农药降解酶基因在有机磷农药降解中的应用。
[0018]本发明的有益效果在于:
[0019](I)本发明中使用的枯草芽孢杆菌表达系统克服了大肠杆菌表达系统的缺点，具有非致病、不产生毒素与致热致敏蛋白质的优点，是一种安全的表达系统；具有很强的蛋白质分泌功能，使蛋白分泌到胞外，利于纯化；可对蛋白进行多种翻译后的修饰，利于保持生物产品的活性和稳定性。
[0020](2)本发明通过人工分子改造获得新型基因资源，并利用基因工程手段在枯草芽孢杆菌细胞中高效表达突变基因，获得改造的有机磷农药降解酶。通过该方法获得的改造的有机磷农药降解酶与底物乙基对硫磷的亲和力和敏感性显著提高，酶活力得到了明显提高，可以用于农产品中有机磷农药残留的降解和消除，为研制有机磷农药降解酶制剂产品提供了高活性的酶材料，具有很大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例的技术流程图。[0022]图2为本发明实施例中重组表达质粒的酶切鉴定图，其中:1为DNA分子量标准DL15000 ；2-4 为重组质粒 pHT43-opdA_BamHI ;5_7 为重组质粒 pHT43-HHL_BamHI。
[0023]图3为本发明实施例中重组枯草芽孢杆菌中蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，其中:M为蛋白质分子量标准；1为转入pHT43-opdA的重组枯草芽孢杆菌的蛋白表达；2为转入PHT43-HHL的重组枯草芽孢杆菌的蛋白表达。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
[0025]实施例1
[0026]I)有机磷农药降解酶基因(opdA)序列的获得
[0027]从NCBI数据库上获得放射性土壤杆菌的有机磷降解酶基因opdA的全基因序列(NCBI登录号:ACCESS10N:AY043245)，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(序列如SEQ ID NO:3所不),该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所不。然后米用正向引物 opdA-F:5 ; -AAAGGATCCGCAAACGAGAAGAGATGCAC-3 ;(如 SEQ ID NO:5 所示)和反向引物 opdA-Rj' -AAACTCGAGTCGTTCGGTATCTTGACG-3 ;(如 SEQ ID NO:6 所示)进行 PCR扩增，获得opdA基因的扩增产物，并进行电泳回收。用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切回收PCR产物和pUC57载体，连接两者酶切后的片段，转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5 α ,获得含opdA基因序列的大肠杆菌克隆,将大肠杆菌中含opdA序列的质粒命名为 PBSK-opdA。
[0028]2)有机磷农药降解酶基因(opdA)的突变
[0029]根据蛋白结构与功能的关系，对OpdA蛋白的结构进行模拟分析，最终确定对以下位点的氨基酸进行定点突变改造:
[0030]对于第253位氨基酸突变，设计如下引物:
[0031]R253H-up: 5 ; -ACATGCCGTACAGTGCGATTGGTC-3 ;(如 SEQ ID NO:7 所示)
[0032]R253H-dn:5 ; -GATCTAAACCGACGAGGTATCCGCG-3 ;(如 SEQ ID NO:8 所示)
[0033]对于第256位氨基酸突变，设计如下引物:
[0034]Y256H-up: 5 ; -CACAGTGCGATTGGTCTAGAAGGCA-3 '(如 SEQ ID NO:9 所示)
[0035]Y256H-dn:5 ; -CGGCATGCGATCTAAACCGACGAGG-3 '(如 SEQ ID NO: 10 所示)
[0036]对于第271位氨基酸突变，设计如下引物:
[0037]F271L-up:5 ; -GGGTACTCGGTCGTGGCAAACAAGG-3 '(如 SEQ ID NO: 11 所示)
[0038]F271L-dn:5 ; -AAGAGCGCTAATGCACTCGCATTGC-3 ;(如 SEQ ID NO: 12 所示)`[0039]利用反向PCR法依次对上述位点进行突变，具体操作步聚按Τ0Υ0Β0定点突变试剂盒说明书进行(购自Τ0Υ0Β0公司)，并进行测序验证，最终获得含有预期突变位点的opdA基因序列。
[0040]3)有机磷农药降解酶基因(opdA)表达载体的构建
[0041]根据枯草芽孢杆菌表达载体pHT43 (购自MoBiTec公司)的多克隆位点，设计并合成一对引物 Pl:5 ; -AAAGGATCCGCAAACGAGAAGAGATGCAC-3 ;(如 SEQ ID NO:13 所示)和 P2:5 ; -CGCGGATCCTCATCGTTCGGTATCTTGACGG-3 ;(如 SEQ ID NO: 14 所示)，在 5 ’ 端分别弓 I 入酶切位点BamH I。分别以含有opdA基因的质粒和含有突变opdA基因的质粒为模板进行PCR扩增，扩增的产物采用BamH I进行单酶切并去磷酸化，酶切产物与同样进行单酶切并去磷酸化后的载体PHT43连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆进行酶切鉴定并测序。参见图2，该图为重组表达质粒的酶切鉴定图。其中:1为DNA分子量标准DL15000 ；2~4为重组质粒 pHT43-opdA-BamHI ;5_7 为重组质粒 pHT43-HHL_BamHI。所述 pHT43-opdA-BamHI为有机磷农药降解酶基因与载体PHT43经BamHI单酶切，连接，获得的含有有机磷农药降解酶基因的重组质粒。所述pHT43-HHL-BamHI为突变的有机磷农药降解酶基因与载体pHT43经BamHI单酶切，连接，获得的含有突变的有机磷农药降解酶基因的重组质粒。
[0042]上述由opdA基因与载体pHT43构建得到的表达载体命名为pHT43_0pdA ;由突变的opdA基因与载体pHT43构建得到的表达载体命名为PHT43-HHL(突变位点为R253H，Y256H和 F271L)。
[0043]4)电转化枯草芽孢杆菌
[0044]在50ml三角瓶中加入5ml LB液体培养基，将枯草芽孢杆菌WB600单菌落接种其中培养，培养条件为37°C，200rpm振荡培养12h。取0.1-4ml菌液，接种在40ml新鲜培养液中，再次剧烈振荡培养过夜，至0D600=0.8-1.0。4°C，5000rpm,离心5min，用50ml预冷的EM培养基重悬细胞沉淀，所述EM培养基是由LB培养基添加0.5mol/L的山梨醇(sorbitol)制备获得。4°C，5000rpm，离心5min，去上清，如此漂洗4次。用预冷的Iml EM培养基重悬细胞沉淀。
[0045]分别取60ul经上述处理的枯草芽孢杆菌细胞悬液，分别与预冷的表达载体pHT43-opdA和pHT43-HHL (5_20ug)混合。将混合物转移至预冷的电转化杯中。冰上放置5min。用电转化仪(购自Eppendorf公司)进行电转化(参数:2KV，200 Ω，25uF)。在电转化杯中迅速加入Iml预冷的RM培养基重悬菌液，颠倒数次，以混合细胞，冰浴数分钟，取菌液涂布于氯霉素(终浓度为5 μ g/ml)的LB固体培养基平板，温育(37°C，3-4d)至菌落出现。分别获得转入pHT43-opdA的重组枯草芽孢杆菌和转入pHT43-HHL的重组枯草芽孢杆菌。上述RM培养基是由LB培养基添加0.5mol/L的山梨醇(sorbitol)和0.38mol/L的甘露醇(mannitol))制备获得。
[0046]5)诱导枯草芽孢杆菌细胞表达有机磷农药降解酶(OpdA)蛋白
[0047]从前述步骤的LB固体培养基平板上培养的菌落中，分别挑取转入pHT43-opdA的重组枯草芽孢杆菌的单菌落以及转入PHT43-HHL的重组枯草芽孢杆菌的单菌落。将两种单菌落分别接种于5ml含有氯霉素(终浓度为5 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C，200rpm过夜培养。然后分别将培养的菌液接种到50ml含有氯霉素(终浓度为5 μ g/ml)的YT发酵培养基中，37°C，200rpm摇床培养，当菌液0D600的吸光值为0.7，加入1.25mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导温度为37°C，诱导时间为27h。将诱导后的菌液，离心收集上清，添加(NH4) 2S04至溶液饱和度为50%，4°C沉淀上清蛋白，5h。用0.02mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液对沉淀蛋白进行透析脱盐，每隔4h换一次透析液，共透析12h，制备蛋白样品。取出一部分用于SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，参见图3，该图展示了重组枯草芽孢杆菌中蛋白表达的SDS-PAGE电泳图，其中:M为蛋白质分子量标准；1为转入pHT43-opdA的重组枯草芽孢杆菌的蛋白表达；2为转入pHT43-HHL的重组枯草芽孢杆菌的蛋白表达。从图3可以看出，含有opdA的重组枯草芽孢杆菌以及含有opdA突变基因的重组枯草芽孢杆菌均在44.3kD左右出现特异性表达条带，与预期蛋白大小相符。
[0048]6)有机磷农药降解酶(OpdA)酶活的测定
[0049]在一定时间范围内，酶活性与其反应时间的比值保持稳定，这个时间范围内的酶反应为称为一级反应。以甲基对硫磷为反应底物，依次加入20 μ I的甲基对硫磷、100 μ I的HEPES、20l.! I的甲醇、20 μ I的氯化钴、40 μ I的复性酶液，混匀，37°C依次在酶作用1、3、5、7、10、13、16、20、24、27、30min终止反应，测量0D405吸光度值，确定酶的最佳反应时间。每个时间点的收集样品平行测定3次。测定的结果表明:工程菌株中表达的有机磷农药降解酶都具有较高的活性，opdA突变基因表达的有机磷农药降解酶比未突变的opdA基因表达的有机磷农药降解酶活性高，opdA突变基因表达的有机磷农药降解酶增加了酶与底物的亲和力和敏感性。本发明实施例中通过opdA突变基因获得改造的有机磷农药降解酶的技术方法为工程酶降解有机磷农药开辟了新途径，同时为研究和应用该酶奠定了良好的基础，将有助于有机磷农药环境污染的综合治理。
[0050]以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【权利要求】
1.一种突变的有机磷农药降解酶基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的突变的有机磷农药降解酶基因，其特征在于:其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种含有权利要求1所述的突变的有机磷农药降解酶基因的表达载体。
4.如权利要求1所述的突变的有机磷农药降解酶基因的表达蛋白的制备方法，包括如下步骤: 1)利用反向PCR法依次对序列如SEQID NO:3所示的有机磷农药降解酶基因的第253位、256位和271位3个氨基酸编码位点进行突变，得到突变的有机磷农药降解酶基因序列并测序验证； 2)将前述突变的有机磷农药降解酶基因的核苷酸序列连接于载体PHT43中，形成有机磷农药降解酶基因表达载体； 3)将前述获得的表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主细胞中，形成含有突变的有机磷农药降解酶基因的重组细胞； 4)在适合有机磷农药降解酶表达的条件下，培养前述重组细胞； 5)分离获得具有有机磷农药降解活性的表达蛋白。
5.权利要求1或2所述`的突变的有机磷农药降解酶基因在有机磷农药降解中的应用。
【文档编号】A62D3/02GK103525782SQ201310472902
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】王金斌, 唐雪明, 李文, 蒋玮, 何建华, 吴潇, 宿学峰, 任芳芳 申请人:上海市农业科学院