AZ31镁合金表面Zn‑MMT涂层的制备与测定方法与流程

本发明属于医学材料技术制备领域，尤其涉及一种az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备与测定方法。

背景技术：

镁合金材料在工业用途中出现的化学性质活泼，易腐蚀降解等缺点，恰恰可以用来作为医用可降解植入材料，但仍然存在降解过快的问题，怎样使其在完成植入材料的支撑功能后再逐渐降解是医用材料及临床医生关心的重点；另外，在医用材料植入手术后由于感染导致的植入失败的案例不在少数，能否将植入材料中引入抗菌元素，使可降解及抗菌功能结合，不失为完美之举。蒙脱石由于其资源丰富，廉价易得，除了在医药领域的应用，在多个行业也应用广泛。

探讨在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层的方法。目前尚无该种矿物应用到镁合金表面的报道，根据文献中有关水滑石等矿物涂层的制备，经过多次试验，反复研究，确定制备工艺为水热法，温度160℃，ph10.5，36h。制备出的涂层与基体结合紧密，较均匀，膜层性能相对较好，具有广阔的研究潜力。

zn-mmt涂层在az31合金表面形成的机理研究。zn-mmt在酸性环境中的研究较多，在碱性条件的变化研究的较少，仅仅在放射性物质深埋后对mmt的影像中涉及到，碱性环境下，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层机理较复杂，缺少相应的研究。

改进模拟体液，增加动态元素，用于研究zn-mmt涂层的耐蚀性。在生物医用材料做生物降解研究中，大多研究人员选用生理盐水、pbs，hanks等作为模拟体液，上述液体能在一定程度上反映体液的无机盐成分，但均不含氨基酸等有机成分，不能完全反应机体的状况；另外浸泡实验多采用静置的方式，也与机体流动的体液，差距较大，数据很难反映出机体真实情况。

探讨zn-mmt涂层提高az31镁合金血液相容性的机理。目前，大多数研究停留在血液相容性研究层面上，对机理研究的较少，

目前用于人体的骨固定金属材料为不锈钢、钛及钛合金钴基合金等，这些金属材料在应用过程中仍然存在问题：1、金属离子释放造成的机体反应；2、强度及弹性模量高；3、需要二次手术。

在不断探索过程中，镁合金走进研究人员的视野----生物医用降解材料。在镁合金最初研究中，人们发现还是降解太快。存在问题：性质活跃、易腐蚀，降解快，其在体内未完成支撑使命后降解，从而导致植入失败。此阶段，镁合金医用材料的研究大多是围绕提高其耐蚀性及生物相容性进行，例如增加微量元素制成合金、表面改性制备涂层。随着医用镁合金的研究不断推进，体内植入及临床应用试验表明，围绕植入材料为中心的感染问题，也是导致植入失败的又一重要原因。(镁合金抗菌的研究迫在眉睫)。

因此，在提高镁合金耐蚀性基础上，研发具有抗菌性能的医用镁合金植入材料，具有现实性重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备与测定方法，旨在解决背景技术提及的现有技术的缺陷问题。本发明主要目标就是将自备的具有抗菌功能的zn-mmt，通过水热法负载到az31镁合金表面，提高耐蚀性、血液相容性的同时增加抗菌功能，拓展蒙脱石的应用领域，为镁合金医用植入材料的临床应用奠定基础。应用于人体的镁合金骨植入材料主要是减缓降解速度，控制腐蚀，在骨骼修复后，逐渐降解。技术上采用水热法制备zn-mmt涂层，表面发生一定反应，结合力不强，后期会逐渐脱落，有利于控制镁合金的降解；在水热法处理前，首先进行超声处理30min，这一技术可将蒙脱石的片层状结构破坏，有利于插入片层状结构的zn²⁺的溶出，发挥更好的抗菌效果。

本发明是这样实现的，一种az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备方法，所述az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备方法包括以下步骤：

以钠化蒙脱石(na-mmt)为载体，硝酸锌为锌源；以zn²⁺含量为检测指标，采用离子交换法制备zn-mmt抗菌中间体，首先进行单因素实验，分析硝酸锌用量、温度、时间对zn-mmt抗菌中间体zn²⁺含量的影响；然后，在单因素基础上，利用响应面法优化工艺条件，建立响应面模型；

利用水热法，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层。

进一步，建立响应面模型中选用二次多项式模型建立与检验回归方程；回归方程为：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²。

在单因素实验的基础上，使用design-expert8.0用中的box-behnken设计模式进行实验设计，以影响锌含量的3个因素：硝酸锌的量a、温度b、时间c为自变量，各因素设计三因素三水平实验。

进一步zn-mmt涂层制备方法包括：称取zn-mmt溶于去离子水中制成2％的悬浮液，超声破碎30min；置于250ml锥形瓶中，在室温下磁力搅拌0.5h，使zn-mmt分散均匀；调节悬浮液ph值至10.5，80℃搅拌4.5h；将预处理的az31镁合金放入水热釜中，需保持镁合金直立，将搅拌后悬浮液装入水热釜中，置于恒温干燥箱中130℃，36h后取出，去离子水清洗，吹干；得到zn-mmt涂层。

进一步，硝酸锌用量对zn-mmt中zn²⁺含量的影响中随着硝酸锌用量的增加zn-mmt中zn²⁺含量也逐渐增加；当硝酸锌用量达到4mmol时，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大；当硝酸锌的用量继续增加，zn²⁺含量不再继续升高，zn²⁺含量达到饱和状态；

反应温度对zn-mmt中zn²⁺含量的影响中随着温度的升高，进入到na-mmt中的zn²⁺含量开始增加，当到达80℃时，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大，此后，当温度继续升高，zn²⁺含量不再增加，反而逐渐减少；

反应时间对zn-mmt中zn²⁺含量的影响中随着反应时间的延长，进入到na-mmt中zn²⁺含量逐渐增加，当反应时间达到4h，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大，此后，继续延长反应时间，zn²⁺含量基本保持不变，na-mmt中zn²⁺含量达到饱和。

本发明另一目的在于提供一种az31镁合金表面zn-mmt涂层的测定方法，所述az31镁合金表面zn-mmt涂层的测定方法包括：利用电镜、eds、xrd、ftir进行表征，分析形成机理；以dmem+10％fbs为模拟体液，利用浸泡后电镜观察、析氢实验，ph测定、eis曲线及极化曲线分析na-mmt涂层耐蚀性机理。

通过溶血率、动态凝血时间、血细胞计数及血小板黏附实验分析zn-mmt涂层的体外血液相容性；采用接触角计算表面张力，分析zn-mmt涂层降低溶血率，提高镁合金血液相容性的机理。

进一步，依据young方程由液体接触角估算固体的表面张力；固体总表面张力近似等于固体表面张力的非极性值和极性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且与接触角的关系见式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液体的表面张力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分别是液体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分别是固体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；测定两个已知γ^dl和γ^pl的探测液体在固体表面的接触角，代入式(1)，联立方程求解可得固体γ^ds、γ^ps和固体的表面张力γs..

界面张力的计算依据owen-wendit方程,计算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)。

本发明另一目的在于提供一种az31镁合金表面zn-mmt涂层的测定方法，所述az31镁合金表面zn-mmt涂层的测定方法包括：

利用抑菌圈实验、细菌生长曲线实验分析zn-mmt涂层的抗菌性能；采用原子吸收法分析zn-mmt涂层中zn²⁺缓释性能。

本发明的zn-mmt涂层提高了az31镁合金的耐蚀性，生物相容性；有望成为一种理想的医用镁合金植入材料。

本发明采用dmem+10％fbs为模拟体液，每24h更换，既能使各种离子更接近人体，又增加动态元素，更能真实地模拟体内环境，得出的数据及结论能客观地反映体液、涂层两者之间的相互作用。

本发明通过测定zn-mmt涂层对极性、非极性溶液的接触角，计算表面张力，分析提高了涂层对血液相容性的机理。

本发明利用水热法，以az31为基体，温度160℃，ph10.5，时间36h，将zn-mmt成功负载到az31镁合金表面。zn-mmt涂层电镜下呈现典型的蒙脱石片层状结构，能清晰地看到锌的纳米颗粒。纵切面图显示zn-mmt涂层与合金结合较紧密，厚度约40μm。线扫描及eds图谱分析可以看出，在涂层表面除了存在mg、al、o、si等元素外，还出现了zn，进一步说明在az31表面形成的涂层为zn-mmt。xrd呈现mmt的特征峰。通过析氢及电化学试验发现，zn-mmt涂层耐蚀能力较好，延缓了az31镁合金在模拟体液中的降解。

本发明对az31镁合金表面的zn-mmt涂层进行血液相容性探讨。结果发现zn-mmt涂层溶血率均低于5％，基体的溶血率为41.62％，大于5％；zn-mmt涂层均对红细胞、白细胞、血小板数量无明显影响；对机体凝血无明显影响。总之，体外实验证明，az31镁合金表面的zn-mmt涂层均提高了az31镁合金的血液相容性；分析其机理可能与涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

本发明对az31镁合金表面的zn-mmt涂层进行抗菌性及缓释性探讨，zn-mmt涂层对s.aureus和e.coli均有明显抗菌效果；zn-mmt涂层中zn²⁺可以缓慢释放达144h，能够对医用植入材料植入初期起到抗菌作用，减少植入感染的机会。

本发明以na-mmt、硝酸锌为原料，采用液相离子交换法制备zn-mmt抗菌中间体；应用响应面法设计优化条件；以na-mmt为载体，硝酸锌为锌源，采用离子交换法，制备zn-mmt抗菌中间体；利用水热法，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层；研究了涂层的在dmem+10％fbs溶液中的降解行为和耐腐蚀机理；采用测定溶血率、动态凝血时间，血小板粘附实验、接触角计算等研究两种涂层的血液相容性；通过抑菌圈实验、细菌生长曲线实验及zn²⁺的累积释放曲线，研究zn-mmt涂层的抗菌性能及缓释性能，得出以下结论：

(1)以na-mmt、硝酸锌为原料，采用液相离子交换法制备zn-mmt抗菌中间体。

(2)采用响应面法优化工艺条件为：硝酸锌为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，蒙脱石载锌量达到94.65mg/g。

(3)利用水热法，将我们前期制备的抗菌中间体zn-mmt负载到az31镁合金表面，制备了zn-mmt涂层。涂层与基体结合紧密；高倍电镜可观察到除了mmt典型的片层状结构，还出现纳米锌的颗粒；eds及xrd均显示出锌存在；

(4)电化学实验、析氢实验、浸泡过程中ph测定，均显示出zn-mmt涂层提高了az31镁合金的耐蚀能力，起到较好地延缓降解的效果。

(5)对az31镁合金表面的zn-mmt涂层溶血率均低于5％，基体的溶血率为41.62％，大于5％；两种涂层均对红细胞、白细胞、血小板数量无明显影响；对机体凝血无明显影响。其机理可能与两种涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

(6)对镁合金表面的zn-mmt涂层抑菌圈及细菌生长曲线实验证明对s.aureus和e.coli均有明显抗菌效果。zn-mmt涂层中zn²⁺的缓慢释放结果表明，zn-mmt涂层中zn²⁺可以缓慢释放达144h，能够对医用植入材料植入初期起到抗菌作用，减少植入感染的机会。

附图说明

图1是本发明实施例提供的az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的电镜下zn-mmt涂层(a)(b),纵切面(c)(d)图；

图3是本发明实施例提供的na-mmt涂层的eds元素组成图；

图4是本发明实施例提供的az31、zn-mmt涂层与zn-mmt的xrd分析图；

图5是本发明实施例提供的az31镁合金及zn-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中浸泡1d和3d后的电镜形貌图；

图中：zn-mmtcoating(a)(b)为1d，(c)(d)为3d；az31(e)(f)为1d，(g)(h)为3d。

图6是本发明实施例提供的抑菌圈效果图。

图7是本发明实施例提供的细菌生长曲线图。

图8是本发明实施例提供的锌离子累积释放曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的az31镁合金表面zn-mmt涂层的制备方法，包括以下步骤：

s101：以钠化蒙脱石(na-mmt)为载体，硝酸锌为锌源；以zn²⁺含量为检测指标，采用离子交换法制备zn-mmt抗菌中间体，首先进行单因素实验，分析硝酸锌用量、温度、时间对zn-mmt抗菌中间体锌含量的影响；然后，在单因素基础上，利用响应面法优化工艺条件，建立响应面模型；

s102：利用水热法，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1.1实验试剂、材料与设备

1.1.1实验试剂

实验中所用到主要试剂见表1.1

表1.1化学试剂

1.1.2实验材料

实验所用基材为挤压态az31合金，化学组成见表1-2。

表1.2实验用的材料组成(wt％)

1.1.3实验条件

实验中析氢和浸泡实验温度通过恒温水浴控制在36.5±1℃，电化学试验温度为室温。析氢和浸泡实验中，模拟体液为dmem溶液+10％小牛血清(fbs)，其配方见表1.3。

表1.3dmem的组成成分

1.1.4实验设备

主要实验设备见表1.4。

表1.4主要仪器设备

1.2材料的制备

1.2.1zn-mmt的制备

1.2.1.1制备工艺

称取na-mmt5g，加入95ml去离子水，搅拌分散得到悬浮液；加入一定量的硝酸锌；恒温搅拌5h；1500r/min，10min，得到白色沉淀物；反复洗涤、过滤，用0.1mol/l的na2s检验，直至滤液中无zn²⁺检出，65℃干燥，研磨，过200目筛，即得zn-mmt。

1.2.1.2锌标准曲线的制备

称取光谱纯锌0.1000g，溶于20ml硝酸(6mol/ml)，移入1000ml容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，含zn²⁺100μg/ml；取7个100ml容量瓶，分别加入100μg/mlzn²⁺标准溶液0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，用去离子水稀释至刻度，摇匀。系列锌标准溶液浓度为0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml，4μg/ml，5μg/ml，6μg/ml。采用原子吸收光谱仪在213.9nm测定吸光值，每个梯度测三次，取平均值，绘制zn²⁺标准曲线。

1.2.1.3锌含量的测定

称取1gzn-mmt，加入10％硝酸20ml中，浸泡48h；离心分离，洗涤2次，洗涤液回收入容量瓶，定容至100ml；原子吸收法测定吸光值，利用zn²⁺标准曲线，计算含锌量，每组三个平行样，取平均值。

1.2.1.4单因素分析

将5gna-mmt通过搅拌分散在95ml去离子水中得到悬浮液，分别分析硝酸锌的量、反应时间、温度对zn-mmt载锌量的影响。

1.2.1.5响应面法优化工艺条件

在单因素实验的基础上，使用design-expert8.0用中的box-behnken设计模式进行实验设计，以影响锌含量的3个因素：硝酸锌的量(a)、温度(b)、时间(c)为自变量，各因素设计三因素三水平实验。实验因素水平设计见表1.5，响应面实验设计方案见表1.6。

表1.5响应面因素水平设计

表1.6响应面实验设计方案

1.2.2az31镁合金样品的预处理

实验用az31采用线切割加工成20×20×4mm和15×15×4mm的方块。分别用360^#，600^#，800^#，1000^#，1200^#，1500^#水磨砂纸依次对样品进行打磨，丙酮浸泡去除合金表面油污和氧化皮，然后，用无水乙醇冲洗并用吹风机吹干，备用。

1.2.3zn-mmt涂层的制备

zn-mmt涂层的az31镁合金样品制备，称取zn-mmt溶于去离子水中制成2％的悬浮液，超声破碎30min，其余步骤同1.2.3。

1.2.4镁标准曲线的制备

称取1.6583g优级纯mgcl2，溶于去离子水中，定容至1000ml，分别量取上述溶液10ml、20ml、30ml、40ml、50ml于100ml容量瓶中，定容，得到0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l的梯度浓度溶液，采用原子吸收法，213.9nm处测od值，绘制镁标准曲线。

1.3涂层组织结构及成分分析

1.3.1扫描电子显微镜形貌观察及能谱分析

样品、涂层及腐蚀前后微观形貌及截面形貌采用扫描电子显微镜观察(novananosem450，usa)，实验参数为加速电压15kv。样品上样前喷金。利用扫描电镜中附带的能谱仪(eds)对上述样品进行点扫描、线扫描及面扫描，分析各样品的组成元素和含量变化。

1.3.2x射线衍射分析(xrd)

采用d/max-2500/pcx-衍射仪分析样品及其腐蚀产物的物相组成，实验参数为：管电流i＝40ma，管电压u＝40kv，扫描角度范围2θ为2-80°，扫描速度为8°/min，靶材为cu-kα(λ＝0.154060nm)靶。

1.3.3傅立叶红外光谱分析

采用nicolet380傅立叶红外光谱仪，测定na-mmt、zn-mmt涂层在dmem++10％fbs中腐蚀后产物的官能团。实验参数为：波数范围：4000-400cm^-1,分辨率：4cm^-1，背景采集：kbr压片，采集点数：32个。

1.4涂层耐蚀性能测试

1.4.1电化学实验

az31合金和zn-mmt涂层的耐腐蚀性能主要采用电化学测量的方法电化学测试，通过由美国parstat2273电化学工作站完成。测试采用三电极体系：参比电极为饱和甘汞电极(sce)，辅助电极为铂电极，工作电极为被测样品。腐蚀介质为ph7.4的dmem+10％fbs溶液，实验温度为室温，测试样品面积与测试溶液体积比为1cm²/400ml。动态极化测试时，电位扫描范围为自腐蚀电位(ec)±300mv起，扫描速度为1mv/s。电化学测试前，样品在dmem+10％fbs溶液中浸泡5min以使开路电位尽可能稳定。电化学阻抗谱(eis)采用powersuite-powersine作为测试软件，测试后采用zview软件进行阻抗谱的拟合与分析。

1.4.2浸泡实验

为进一步评价镁合金及涂层的耐腐蚀性能和降解性能，进行体外浸泡试验。浸泡试验按照astm-g31-72标准在dmem+10％fbs溶液中进行，测试过程中溶液温度保持在36.5±1℃。浸泡一定时间后进行形貌观察，成分分析等。

1.4.3析氢实验

腐蚀析氢实验采用排水集氢气法，由酸式滴定管、玻璃漏斗和烧杯组成。浸泡样品表面积约为12cm²，dmem+10％fbs溶液的体积约为300ml，面积/溶液比为1:25cm²/ml。由反应方程式可知，每溶解一个镁原子就会产生一个氢气分子，因此通过测量试样在腐蚀过程中产生氢气的体积就可以计算样品的析氢腐蚀速率。

1.4.4ph值的变化

将az31合金、zn-mmt涂层的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，每24h更新液体，起初浸泡24h内每隔1h测一次，后期每24h测定一次，溶液温度保持在36.5±1℃，以时间为横坐标，ph为纵坐标，绘制ph变化图。

1.4.5浸泡溶液离子测定

将2cm×2cm×0.4cmaz31合金和zn-mmt涂层的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，浸泡溶液体积为100ml，温度36.5±1℃，在浸泡2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h后，分别取出样品，利用原子吸收法检测浸泡液中的镁离子的变化。

1.5体外血液相容性及机理

1.5.1溶血实验

1.5.1.1溶血率的测定

(1)材料浸提液的制备

取2cm×2cm×0.4cm的az31合金、zn-mmt涂层的az31各4块，分别以0.9％nacl作为浸提液，按照iso10993-1标准(试样表面积/浸提介质)3cm²/ml的比例，静置于36.5±1℃恒温培养箱中浸提90min。用细菌过滤器过滤除菌后，4℃冰箱保存备用。

(2)2％红细胞悬液的制备

取新鲜人血4ml(本实验室人员志愿捐献，不存在医学伦理争议)，1500r/min离心10min，用胶头滴管吸出上清液，沉淀在底部的红细胞用0.9％nacl按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％nacl配成2％的混悬液(红细胞1ml，加0.9％nacl至50ml)。

(3)溶血率计算

分别取上述三种样品的材料浸提液7ml、与0.9％nacl(阴性对照组)和蒸馏水(阳性对照组)为对照，分别做三组平行样。每组浸提液中加2％红细胞悬液1ml，混匀后置36.5±1℃恒温培养箱孵育1h，1000r/min离心10min，吸取上清，在545nm处测od值，取平均值计算溶血率。

溶血率(％)＝(实验组od值－阴性对照组od值)/(阳性对照组od值－阴性对照组od值)×100％

1.5.1.2材料浸提液ph的变化

用ph计测量上述各浸提液浸提不同时间时的ph值。

1.5.1.3材料浸提液中镁离子的变化

采用原子吸收光谱仪测定材料浸提液浸提不同时间的镁离子、锌离子的变化，方法同1.4.4。

1.5.2血细胞计数实验

将az31合金和zn-mmt涂层的az31合金分别置于10ml人抗凝血中(柠檬酸钠抗凝)，静置，30min后进行血细胞计数，与未接触材料的血细胞数量进行比较。

1.5.3动态凝血时间实验

体外动态凝血时间实验可检测内源性凝血因子被激活的程度,使镁合金实验样品与血液接触,测定游离血红蛋白的光密度值,动态地观察不同样品对凝血时间的影响。

分别取30μl人抗凝血，滴在az31合金和zn-mmt涂层表面。每组试验设有6个间隔时间(5、20、35、50、90、130min)，每个时间3平行样。到达预定时间后，样品立即放入盛有15ml去离子水的烧杯中，静置10min待未凝固的红细胞充分溶于水中，在540nm处测溶液od值，绘制动态凝血曲线，人为定义od值0.1为出现凝血。

1.5.4血小板黏附实验

将新鲜抗凝人血(实验室人员捐献)以1000r/min离心10min，即可得到富血小板血浆。分别移取20μl富血小板血浆滴于az31合金和zn-mmt涂层的表面，36.5℃恒温箱中保温30min，然后用pbs(ph＝7.4)清洗除去样品表面未黏附的血小板。2.5％戊二醛固定液中固定，乙醇系列梯度脱水，取出在空气中自然干燥，喷金，扫描电镜观察黏附的血小板形貌。

1.5.5接触角测定

在室温、空气条件下，利用躺滴法，采用德国的easy-drop型接触角测量仪测定去离子水在样品表面的接触角，将三种样品置于接触角测量仪的样品室，利用微量进样器将0.6μl极性液体去离子水滴于样品表面，接触很短时间，立即采集液滴的图像，利用量角法测得接触角。每个样品取3个平行样品，每个平行样测试4个不同的点，取其平均值。

1.5.6表面张力计算

依据young方程可由液体接触角估算固体的表面张力。根据owens-wendt-kaelble观点，固体总表面张力近似等于固体表面张力的非极性值和极性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且与接触角的关系见式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液体的表面张力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分别是液体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分别是固体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)。因此，测定两个已知γ^dl和γ^pl的探测液体在固体表面的接触角，代入式(1)，联立方程求解可得固体γ^ds、γ^ps和固体的表面张力γs..

界面张力的计算依据owen-wendit方程,计算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

如表1.7实验用液体表面张力及各分项值。

表1.7实验用液体表面张力及各分项值

1.6抗菌性能及机理分析

1.6.1实验菌传代及菌悬液制备

从试管斜面上挑取e.coli和s.aureus菌体，接种于相应的液体培养基中，37℃摇床过夜培养12h。离心收集菌体，用50mmol/l磷酸缓冲液(ph为6.5)洗涤2次，再加入缓冲液，制备细菌悬液，备用。

1.6.2抑菌圈(如图6)实验

(1)抑菌片的制备：az31基体、na-mmt涂层和zn-mmt涂层的az31合金，灭菌后直接作为抑菌片。

(2)试验菌平皿的制备：通过分光光度法稀释菌液浓度为10⁷cfu/ml。取0.1ml菌悬液在培养皿上均匀涂布。

(3)抑菌剂样片贴放：每个平板贴放3片试验样片，用无菌镊子分别取各种抑菌片贴放于平皿合适位置，并做好标记。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面，盖好平皿，置37℃温箱，培养18h-24h观察结果，试验重复3次。

1.6.3细菌生长曲线(如图7a、b)

将培养至对数生长期的e.coli和s.aureus菌液,按1％的接种量(菌体浓度为10⁸个/ml)分别接种至肉汤液体培养基中，将az31基体zn-mmt涂层的az31合金三种样品置入上述培养基中，37℃，150r/min摇床振荡培养，每隔一定时间取样，用分光光度计测定od410(e.coli)、od650(s.aureus)，绘制生长曲线。

1.6.4zn-mmt涂层中锌的体外累积释放(如图8)

将制备了zn-mmt涂层的az31镁合金样品置于ph7.4的pbs中，36.5℃，100rp/恒温振荡，每隔一定时间取1ml液体，然后加入等量预热的pbs液体，继续振荡，直至实验结束。将取出的液体用用原子吸收光谱仪测定其中锌离子释放量，每组设三个平行样，取平均值，绘制锌离子累积释放曲线。

1.7数据处理

采用spss16.0统计软件对所得数据进行分析，采用平均值x±标准差(sd)记录实验结果，对实验数据结果进行方差分析或t检验，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异非常显著。

2.载锌蒙脱石制备工艺优化及表征

蒙脱石(mmt)是一种片层状硅酸盐，由于其特殊的片层状结构，带电荷的不均匀性及较大的比表面积，在医药上广泛用作乳化剂、助悬剂、增稠剂、吸附剂、缓释载体等。另外，mmt在无机和有机抗菌材料的载体方面的应用，也受到研究人员的广泛关注。在众多抗菌材料中，无机抗菌剂的应用较为广泛，也是研究的热点，尤其是金属离子抗菌剂ag⁺、cu²⁺、zn²⁺均具有较好的抗菌效果。遗憾的是，以ag⁺作为抗菌离子时易变色而失性；cu²⁺抗菌作用较好，但对人体有一定毒害；zn²⁺的抗菌性能稍弱，但zn²⁺是机体必须的阳离子，相比之下，用作抗菌离子时，具有成本低、性能持久、生物相容性好等优点，可广泛应用于各种抗菌材料中。在抗菌材料领域，另外一个热点是载体材料。近几年，天然非金属矿物用作抗菌剂的载体备受关注。mmt是其中之一，天然蒙脱石层间阳离子通常是ca²⁺、na⁺、k⁺、mg²⁺，可以通过离子交换法制备h⁺、li⁺、nh⁴⁺、k⁺、cu²⁺、zn²⁺、al³⁺、fe³⁺等改性蒙脱石。我国天然蒙脱石以钙基蒙脱石为主，存在阳离子交换容低的缺点，为改善这一缺点，常常先进行钠化，即钠化蒙脱石(na-mmt)，然后再进行阳离子交换。本实验以na-mmt为载体，将硝酸锌中的zn²⁺引入na-mmt的层间，制备载锌蒙脱石(zn-mmt)抗菌中间体，并对其进行表征，以zn²⁺含量为指标，采用响应面法优化工艺条件。本发明为蒙脱石作为载体制备抗菌材料的研究提供理论基础，同时拓宽其应用领域。

2.1响应面模型优化zn-mmt制备工艺

2.1.1单因素分析

2.1.1.1硝酸锌用量对zn-mmt中zn²⁺含量的影响

硝酸锌用量对zn-mmt中zn²⁺含量的影响，随着硝酸锌用量的增加，zn-mmt中zn²⁺含量也逐渐增加。当硝酸锌用量达到4mmol时，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大。当硝酸锌的用量继续增加，zn²⁺含量不再继续升高，由此说明4mmol硝酸锌与5gna-mmt进行离子交换反应，zn²⁺含量达到饱和状态。

2.1.1.2反应温度对zn-mmt中zn²⁺含量的影响

反应温度对zn²⁺含量影响，随着温度的升高，进入到na-mmt中的zn²⁺含量开始增加，当到达80℃时，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大，此后，当温度继续升高，zn²⁺含量不再增加，反而逐渐减少。由此可见，80℃为此离子交换反应的较佳反应温度，此时，na-mmt中的zn²⁺含量最高。

2.1.1.3反应时间对zn-mmt中zn²⁺含量的影响

反应时间对zn-mmt中zn²⁺含量的影响，随着反应时间的延长，进入到na-mmt中zn²⁺含量逐渐增加，当反应时间达到4h，zn-mmt中zn²⁺含量达到最大，此后，继续延长反应时间，zn²⁺含量基本保持不变，由此可见，反应达到4h，na-mmt中zn²⁺含量达到饱和，继续增加反应时间反而可能导致zn²⁺从mmt层间少量溶出。

2.1.2响应面模型设计与结果

线性及三次模型拟合不显著(p>0.05)，二次模型拟合极显著(p<0.01)，因此选用二次多项式模型。系统趋向于选择拥有最大预测决定系数和最小预测残差平方和的模型，即二次多项式模型。

2.1.3建立与检验回归方程

应用design-expert软件对表2.1的实验数据进行回归分析，得到回归模型为：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²

对上述模型进行方差分析，结果见表2.1。

表2.1回归模型方差分析表

2.1.4回归方程的参数评估与因子效应分析

二次回归模型的参数评估见表2.2，由表2.2可知，a、b、c、ac、c²达到显著水平，a²、b²为极显著水平，由此可见，硝酸锌的量、温度、时间对zn-mmt中zn²⁺含量有显著影响。综合考虑各因素的影响，3个因素对zn-mmt的zn²⁺含量的影响次序为：硝酸锌用量＞反应温度＞反应时间。

表2.2回归模型系数显著性检验表

2.1.5响应面交互作用分析

2.1.5.1硝酸锌的量与反应温度的交互作用

反应时间4.5h时，硝酸锌用量、反应温度对zn-mmt中的zn²⁺含量的影响显著，硝酸锌用量与温度交互作用不显著。固定反应时间，随着硝酸锌用量的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量也增大，硝酸锌用量达4mmol左右时，zn²⁺含量最高；硝酸锌用量为4mmol时，随反应温度升高，zn-mmt中的zn²⁺含量逐渐增加，80℃左右zn²⁺含量最高，温度再继续升高，zn²⁺含量不再升高，反而有所下降。分析原因可能为在一定的温度范围内，升高温度加快离子交换的反应速度，通过离子交换进入到na-mmt中zn²⁺增加；但是，温度继续升高，zn²⁺从蒙脱石中的溶出也会相应增加；另外，zn-mmt中zn²⁺除了离子交换的部分，还有以化学吸附的形式进入si-o四面体和al-o八面体的微孔中少量的zn²⁺，反应温度升高，这部分zn²⁺可能出现解吸附，在洗涤过程中去除，导致zn²⁺含量下降。

2.1.5.2硝酸锌用量与反应时间的交互作用

反应温度80℃时，硝酸锌用量、时间显著影响zn-mmt中的zn²⁺含量，二者存在显著的交互作用。固定反应温度，随反应时间增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐渐增加，4.5h时zn²⁺含量最高；反应时间为4.5h时，随着硝酸锌用量的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐渐增加，4mmol左右达到最大。分析原因可能随着反应时间的增加，蒙脱石中阳离子交换不断增加，4.5h后na⁺、zn²⁺交换达到平衡，再增加时间，也不会使更多的zn²⁺进入na-mmt层间。

2.1.5.3.反应时间与温度的交互作用时间

硝酸锌用量为4mmol时，反应时间、温度对zn-mmt中的zn²⁺含量有显著影响，但二者无显著交互作用。固定硝酸锌浓度，随反应温度的增加，zn-mmt中的zn²⁺含量逐渐增加，80℃时zn²⁺含量最高，当反应温度80℃时，zn-mmt中的zn²⁺含量随时间的增加而逐渐增加，4.5h时zn²⁺含量最高，进一步增加反应时间，zn²⁺含量不再增加，反而逐渐下降。这是因为随着反应时间的延长，离子交换反应增加，使交换进入na-mmt中zn²⁺增加，继续延长反应时间zn²⁺的溶出也会相应增加；另外，si-o四面体和al-o八面体的微孔中吸附少量zn²⁺可能出现解吸附，导致zn-mmt中的zn²⁺含量下降。

2.2zn-mmt的表征

2.2.1形貌观察及成分分析

zn-mmt电镜下形貌，离子交换前的na-mmt，镜下可见颗粒较大，聚集成花絮状、团块状聚集体，边缘呈圆盾状、旋涡状、尖角状等形貌。zn-mmt镜下形貌，颗粒较细小，很少聚集成团块，颗粒呈不规则形，有的边缘也存在片层状，旋涡状形貌。由于eds点扫中na与zn的峰重合，但zn含量明显比没交换前na增多，说明zn的峰是交换进去的zn与未交换的na两者的重合。zn²⁺成功插入到na-mmt片层中。

2.2.2xrd分析

蒙脱石离子交换前后xrd分析，na-mmt和zn-mmt在衍射角0°–30°之间两个峰无明显差别，说明在zn-mmt制备过程中只发生了zn²⁺和na⁺离子的交换，蒙脱石的结构并未发生改变；另外，未出现锌的衍射峰的，说明层间的锌粒子比较细小，无明显的团聚现象。

当离子交换后，蒙脱石(d001)面衍射角2θ向低角度方向偏移。利用布拉格(bragg)方程：

2dsinθ＝nλ

其中：d为蒙脱石片层的晶面间距；

θ为入射角；

λ为入射x射线的波长，此处λ＝0.15406nm；

n为衍射级数，此处取n＝1。

可分别计算到各自的晶面间距d001，所得结果见表2.3。

表2.3蒙脱石及样品层间距

由表2.3可知，离子交换后蒙脱石片层的晶面间距增大，由1.48nm增加到1.57nm，说明zn²⁺交换后，蒙脱石的(001)面网间距增加，分析zn²⁺交换层间的阳离子引起蒙脱石d(001)值增大的原因，可能是由于zn²⁺主要是以水合锌离子的形式进入了蒙脱石晶格的层间。

本发明以na-mmt、硝酸锌为原料，采用液相离子交换法制备zn-mmt抗菌中间体；应用响应面法设计优化条件；采用扫描电镜观察zn-mmt形貌；eds、xrd等分析组成及插层机理，得出以下结果

(1)以硝酸锌为原料，采用离子交换法成功制备zn-mmt抗菌中间体。

(2)单因素试验分析表明，采用na-mmt5g，分别在硝酸锌用量为4mmol、温度80℃、反应时间4h时，各自得到最高的zn²⁺含量。

(3)采用响应面法，对zn-mmt制备工艺进行优化，得到的回归方程为：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²；最佳优化条件：硝酸锌为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，此时得到的zn-mmt抗菌中间体中的zn²⁺含量达到94.65mg/g。

(4)zn-mmt镜下呈现颗粒细小，很少聚集成团块，颗粒呈不规则形，有的边缘也存在片层状，旋涡状形貌。zn²⁺主要是以水合锌离子的形式进入了蒙脱石晶格的层间，层间距由离子交换前的1.48nm增加到1.57nm。

3、zn-mmt涂层的耐蚀性能及降解机理

据统计，我国每年由于疾病、交通事故和运动创伤等造成的骨缺损和缺失患者人数近1000万人，在骨修复手术过程中，骨植入材料起到至关重要的作用。目前，在临床上常用的传统骨科内固定材料主要有不锈钢、钛合金、钴铬钼合金等，虽然，这些材料较广泛地应用于临床，但仍存在弹性模量高于人骨，多数需要二次手术等缺点。因此，发展可降解金属生物材料已成为当前骨植入材料发展的方向，镁合金以其具有可降解性能、良好的生物学特性及力学性能渐渐引起研究人员的关注，大量的基础研究、体外实验、体内植入实验，均取得可喜的成绩。但是，也要看到镁合金作为医用植入材料仍然存在许多问题：镁合金植入材料在人体内含有cl^-离子体液环境中会迅速降解，使之不能维持到骨骼愈合；另外腐蚀产生的物质刺激局部组织出现炎症反应等等。镁合金医用材料的这些缺点严重影响其应用，制约了它的发展。如何减慢镁合金的降解速度，特别是控制其植入初期的降解，使之在体内完成使命后再逐渐降解？目前这一问题成为研究的热点。对镁合金表面进行改性是提高镁合金耐腐蚀性行之有效的方法，不改变镁合金固有的特性，通过调整改性表面的成分和结构控制其腐蚀速率。

天然蒙脱石是由两层硅氧四面体夹一层铝氧八面体构成的层状硅酸盐粘土矿物，是非金属纳米矿物，其钠化后的蒙脱石具有分散能力好、吸附性能及离子交换能力强等优点，加之矿产资源丰富、价格低等，广泛应用于石油化工、冶金、污水处理、农业、医药等行业。

本发明通过水热法在镁合金表面制备zn-mmt涂层；电镜观察形貌；eds、xrd分析其组成，探讨涂层形成机理；通过电化学实验、浸泡实验、电镜观察浸泡后形貌及xrd分析涂层的抗腐蚀性能及机理。本发明首次将蒙脱石应用于镁合金表面，为镁合金改性提供新的方法，为后续研究zn-mmt涂层的抗菌性能打下基础。

3.1zn-mmt涂层的形貌与成分分析

3.1.1zn-mmt涂层的电镜形貌及eds分析

图2为az31基体和zn-mmt涂层表面电镜形貌，从图2(a)(b)中可以看出zn-mmt涂层附着在az31表面形成了一层较厚均匀的涂层，呈典型的蒙脱石片层状结构，电镜下能清晰地看到锌的纳米颗粒。图2.(c)为纵切面图，显示zn-mmt涂层与合金结合较紧密，厚度约40μm。图2(d)线扫描图谱。

图3为zn-mmt涂层的eds元素组成图，为zn-mmt涂层的eds分析，在涂层表面除了存在mg、al、o、si等元素外，还出现了zn，进一步说明在az31表面形成的涂层为zn-mmt。

3.1.2zn-mmt涂层的xrd分析

zn-mmt涂层的xrd分析见图4，az31、zn-mmt和zn-mmt涂层在2θ角为20°时，zn-mmt存在特征峰；同样，在zn-mmt涂层存在zn-mmt的特征峰，说明涂层是由zn-mmt形成的。

3.2zn-mmt涂层的耐蚀性能

选用模拟体液为dmem+10％fbs培养液，相对于当前研究所用较多的hank's液和sbf等，主要成分是无机盐离子和葡萄糖，而dmem在上述基础上增加了多种氨基酸，另外血清中含血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素等成分，更贴近人体内环境，以此作为腐蚀介质分析az31基体和zn-mmt涂层的抗腐蚀性能，对今后镁合金的体内植入等应用性研究更有参考价值。

3.2.1zn-mmt涂层的电化学分析

利用电化学分析技术对az31镁合金及zn-mmt涂层在体外模拟腐蚀体系中腐蚀速率进行分析，评估其作为体内可吸收降解医用植入材料的可行性。

3.2.1.1极化曲线

极化曲线反应了电极电位与极化电流或电流密度之间的关系。腐蚀电位(ecoor)的大小反映了材料全面腐蚀反应发生的难易程度：电位越高，耐蚀性越好。腐蚀电流(icorr)大小反映了腐蚀进行的快慢以及腐蚀发生的程度。腐蚀电流越小，则腐蚀速率越小，耐蚀性越好。az31镁合金基体和na-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中36.5℃时的极化曲线图表明，az31在dmem+10％fbs溶液中的腐蚀电位ec＝-1.54v，zn-mmt涂层的腐蚀电位ec＝-1.33v。结果表明，在dmem+10％fbs溶液中zn-mmt涂层比az31镁合金的耐腐蚀性强，也就是说水热法制备的zn-mmt涂层在模拟体液中对镁合金有一定保护作用。表3.1为az31镁合金及zn-mmt涂层的自腐蚀电位，腐蚀电流密度，由表可知，zn-mmt涂层的az31镁合金基体腐蚀电流密度比az31基体提高了约2个数量级，腐蚀速度下降明显。由此说明，zn-mmt涂层明显提高了az31镁合金的耐蚀性。

表3.1az31基体及zn-mmt涂层的自腐蚀电位，腐蚀电流密度

3.2.1.2交流阻抗谱测试

通过交流阻抗法(eis)对zn-mmt涂层的性耐蚀进行了进一步分析，结果表明，zn-mmt涂层在高频区的容抗弧直径远高于az31镁合金基体，因此其阻抗值zn-mmt涂层＞az31，由此表明zn-mmt涂层极大地提高了az31镁合金基体的耐蚀性，能更有效地防止各种离子向镁合金基体的扩散、渗透，从而降低az31镁合金基体的腐蚀速率。

3.2.2zn-mmt涂层浸泡中的析氢变化

az31镁合金基体及zn-mmt涂层在dmem+10％fbs液体中的析氢速率中可以发现，zn-mmt涂层的腐蚀速度明显低于az31镁合金基体本身，在浸泡初期12h，随着时间的增加，az31基体表面有大量气泡生成，24-60h内均维持较高的氢气释放速率，约为0.07ml·cm^-2·h^-1；60h后az31基体的析氢速率缓慢下降为0.06ml·cm^-2·h^-1，可能是腐蚀产物堆积及溶液ph升高，使腐蚀速度降低所致。图中显示zn-mmt涂层的析氢速率明显低于az31，腐蚀速度低于基体本身，平均析氢率为0.015ml·cm^-2·h^-1左右，说明zn-mmt涂层有效地改善了az31镁合金的抗腐蚀能力。

3.2.3zn-mmt涂层浸泡时ph变化

az31镁合金基体及zn-mmt涂层在dmem+10％fbs液体浸泡时ph变化可知，z31合金在dmem+10％fbs溶液浸泡前5h，ph值迅速上升，然后缓慢升高，浸泡24h后ph升高至8.9左右；而zn-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液浸泡后ph缓慢增加，24h后ph升高至7.91。由此可以看出，zn-mmt涂层起到了一定的保护作用，减缓了az31镁合金的腐蚀。

3.3.zn-mmt涂层腐蚀后电镜形貌及eds分析

图5(a)(b)为zn-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中浸泡1d后的微观形貌，观察到涂层表面结构稍有松散，无明显的腐蚀现象。图5(e)(f)az31基体浸泡1d形貌，可以看到明显的裂纹腐蚀，不规则，表面可见腐蚀产物。图5(c)(d)zn-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中浸泡3d后的微观形貌，涂层表面出现明显裂纹，但裂纹深度未到达基体表面。图5(e)(f)az31基体浸泡3d可以看到裂纹腐蚀较深，腐蚀产物增多。比较az31及zn-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液中腐蚀1d和3d天后的形貌，可以看出zn-mmt涂层的制备对基体起到了较好的保护作用。

zn-mmt涂层的腐蚀从涂层表面开始向内部发展，出现裂纹，从裂纹多少及分布来看，短时间内涂层不会脱落。由此可见，zn-mmt涂层增加了az31镁合金的耐蚀性。

本发明通过水热法成功地在az31镁合金表面制备了zn-mmt涂层，

(1)zn-mmt涂层电镜下可观察到纳米锌的颗粒，结构致密；与基体结合紧密；涂层约40μm厚。

(2)az31镁合金表面的zn-mmt涂层腐蚀电流密度比az31基体提高了2个数量级，eis图中半圆直径远大于基体，腐蚀速度明显下降。

(3)az31镁合金表面zn-mmt涂层，通过电化学实验、析氢实验、浸泡实验及电镜观察，结果表明，zn-mmt涂层可以有效的减缓样品在模拟体液中的腐蚀，提高了镁合金的抗腐蚀能力

4、zn-mmt涂层的体外血液相容性

当今时代，现代医学和材料学的发展十分迅猛，生物医用材料己逐渐在骨外科、口腔科、心血管科等临床治疗中发挥着重要的作用。在各国生物医用材料分析中，生物学评价是最基本的环节，也是对人体安全性的重要保证。生物相容性是指生物医用材料应用于生物体内，所产生的宿主反应是可接受的，并能起到有效治疗作用，它反映了材料与活体组织或系统相互作用的生物学行为^[194]，包括血液相容性、组织相容性。生物医用材料与血液接触时，两者相互作用，血液中的各种成分及功能不可避免会受到影响。但是，具有良好血液相容性的生物医用材料对血液成分及功能影响较小，不会造成凝血、溶血等损害。本发明在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层，提高了耐蚀性，比较适合骨科固定材料。下面对两种涂层进行体外溶血实验、血细胞计数实验、动态凝血时间实验、凝血酶原时间、血小板黏附实验，以考察zn-mmt涂层的az31镁合金的血液相容性；同时，通过测定浸提液中镁离子浓度、ph、镁合金及涂层的接触角等，探讨涂层提高az31镁合金血液相容性的机理，为其在医学领域的应用提供理论依据。

4.1体外血液相容性

4.1.1溶血实验

溶血，即红细胞破裂，血红蛋白外逸，亦称为红细胞溶解。在临床上，引起溶血的因素很多，可分为内源性因素与外源性因素。其中，内源性因素包括溶血性细菌侵入抗原-抗体反应、各种机械损伤、红细胞内在(膜、酶)缺陷、药物作用等；外源性因素主要有低渗溶液、机械强力振荡、突然低温冷冻、过酸或过碱等。溶血率实验是一项常用的检验植入材料血液相容性的方法，由于其能敏感的反应材料对红细胞的影响，所以被公认为是评价长期植入骨、软组织及血液环境中的生物材料的安全性的指标之一。iso标准规定，如果材料与血液接触后的溶血率小于5％，则符合溶血率要求；如果材料与血液接触后溶血率大于5％，则预示着材料有溶血作用。本发明试验采用体外非直接接触法-利用和材料充分接触的浸提液来与新鲜血液接触，考察由材料释放出的离子对红细胞有无溶血作用。

az31镁合金、zn-mmt涂层的血红蛋白吸光值及溶血率实验的结果表明；az31的溶血率为41.62％，大于5％，发生了明显溶血现象；zn-mmt涂层的溶血率为3.99％，均小于5％，无明显溶血现象，溶血率达到了生物材料要求的标准。其中，zn-mmt涂层的溶血率明显低于az31镁合金基体，两两比较有极显著性意义(p<0.01)；显然，在az31镁合金表面制备了zn-mmt涂层后明显提高了az31镁合金的血液相容性。

4.1.2血细胞计数实验

血液是由血浆和血细胞组成的流体组织，在心血管系统内循环流动,起着运输物质的作用，血细胞可分为红细胞、白细胞和血小板三类，各自执行着相应的功能。生物材料的血液相容性包括对血液成分及功能无明显影响，即：不会造成红细胞、白细胞及血小板的明显减少。本发明对az31镁合金和zn-mmt涂层进行体外血细胞计数实验。结果为三种样品在血液中浸泡30min后，血小板减少分别为(1.26±0.56×10¹⁰/l、1.45±0.52×10¹⁰/l)，红细胞减少分别为(1.15±0.80×10¹¹/l、1.42±0.61×10¹¹/l)及白细胞减少分别为(0.17±0.02×10⁹/l、0.14±0.06×10⁹/l)，三种血细胞的数量稍有所下降，但均在正常范围内。经spss16.0软件进行方差分析，posthoctests结果为；az31镁合金、zn-mmt涂层在血液中浸泡30min后，三种血细胞减少均无统计学意义(p>0.05)。

综合来看，az31镁合金比zn-mmt涂层造成的血细胞的减少明显，但数据经过方差分析两两比较均无显著性意义(p>0.05)。说明三种样品对血液中红细胞、白细胞、血小板影响不大，即zn-mmt涂层后的az31合金对血细胞无明显影响。分析三种血细胞稍有下降的原因，白细胞下降了可能是材料表面吸附所致，在材料接触血液时，白细胞表面cr3受体的表达增强，能够识别附在材料表面的c3的分解产物，促使白细胞在材料表面吸附，导致白细胞数量减少；红细胞的减少与材料接触血液后，发生少量溶血有关；血小板减少也是由于材料吸附所致。

4.1.3动态凝血时间实验

体外动态凝血时间实验常用来检测内源性凝血因子被激活的程度，以观察材料对人体血液凝血时间的影响。体外动态凝血时间曲线反映血液在材料表面的凝固趋势和凝血时间的长短，可以比较各种材料对凝血因子的激活程度,凝血程度越小，材料的血液相容性越好。为了方便比较对不同材料的抗凝血性能，人为地把纵坐标吸光度值为0.100时的时间定义为材料的凝血时间。

从az31镁合金、zn-mmt涂层的动态凝血时间曲线发现，2条曲线随着与血液接触时间的增长，材料的od值逐渐减小，最终趋于平缓。在达到0.10吸光值时，az31所用时间最短，其次是na-mmt涂层，时间最长的是zn-mmt涂层。zn-mmt涂层的曲线经历时间长，呈缓慢向下倾斜形状，抗凝血性能均优于az31。综合而言，涂层提高了az31镁合金的抗凝血性能。

4.1.4血小板黏附实验

血小板是由红骨髓中巨核细胞破碎后形成的一种无色、体积小、形态不规则的小体，生物材料与血液接触后，表面吸附一定量的纤维蛋白原，同时结构发生变化，血小板会黏附在纤维蛋白原周围，聚集、释放大量的凝血活性因子，使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶会激活新的凝血因子，如此循环发生凝血反应，形成血栓。因此，生物材料表面血小板黏附的数量和激活状态是血液相容性中抗凝血性能最基本的评价指标之一。血小板黏附愈少，变形越少，则血液相容性愈好。

从eds点扫箭头所指部位，显示出有s、c、o等元素成分，结合形貌确定为血小板；从sem图中可以看到三种样品表面均黏附有很少的血小板，血小板形状不规则，但都没有伪足，表明血小板没有被激活，表现出了良好的抗血小板黏附性能。

4.2血液相容性机理

4.2.1浸提液mg²⁺浓度及ph的影响

本实验对溶血实验中材料浸提液中的mg²⁺浓度及ph进行检测，结果见表4.1。由表4.1可以明显看出，az31镁合金在生理盐水中浸提30min后，mg²⁺浓度为38.23±2.96，是正常人血清mg²⁺浓度的35倍多，而zn-mmt涂层浸提液中mg²⁺浓度略高于人血清正常值；az31镁合金出现溶血，溶血率41.6％，而zn-mmt涂层未发生溶血，溶血率分别为3.99％，均小于5％。另外，由表4.1可知，az31镁合金浸提液ph为8.25±0.77，明显碱化，高于机体可以代偿的水平，而zn-mmt涂层浸提液中ph无明显改变，仍在正常人体体液的ph范围内。

表4.1各组浸提液mg²⁺浓度及ph值

4.2.2接触角测定

4.2.2.1材料与去离子的接触角测定

材料的亲水性与人体对这种材料的相容性呈正相关，亲水性越高，材料的生物相容性越高。由于血液及组织液中主要组成是水，因此材料的接触角测定采用材料与水的接触界面进行测定。材料的接触角测定一定程度上反映了材料亲水性，比较az31镁合金、zn-mmt涂层后材料的接触角，去离子水滴滴到az31镁合金基体表面，球形水滴较快变成半球形，平均接触角为60.43±3.38；滴到zn-mmt涂层时，球形水滴迅速浸润，zn-mmt涂层后接触角比az31镁合金基体减小；三组接触角数据见表4.2，zn-mmt涂层后接触角与az31镁合金进行比较p<0.05，有显著性意义；但两种涂层进行比较p＝0.53，p>0.05，无显著性意义。由此说明，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层后，提高了材料的亲水性能，两种涂层之间亲水性相似，无明显差别。由此可知，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层后，材料的接触角减小，亲水性提高，故血液相容性提高。

表4.2材料的接触角测定

4.2.3表面张力及界面张力的计算

根据公式：

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

γs＝γs^d+γs^p

可计算得az31、zn-mmt涂层的表面张力与界面张力,计算结果见表4.3：

表4.3不同样品表面张力、各分项值和界面张力

由表4.3可知，az31镁合金及zn-mmt涂层的色散力分量γ^ds相差不明显，而两种涂层的极性分量γ^ps均明显大于az31镁合金，即zn-mmt表面张力高于az31镁合金。γ^ps是影响材料血液相容性的重要因素，γ^ps的增加提高了材料的润湿性，另一方面使材料优先吸附白蛋白，改善材料的血液相容性。zn-mmt涂层的界面张力值小于az31基体。即材料的界面能较小，因而zn-mmt涂层样品比az31镁合金基体具有更优的血液相容性。

如前面所述表面张力是分子色散力和极性力的共同作用的结果。提高样品表面色散力，能够提高表面吸附蛋白质层的稳定性，进而提高材料表面的血液相容性。

极性力分量γ^ps/γs是一项生物材料血液相容性的决定性因素，提高极性分量(γ^ps/γs)能够促进血浆白蛋白在表面的吸附，而色散力分量(γ^ds/γs)越高则会优先吸附纤维蛋白^[43]。白蛋白减少与血小板形成复合体，能够减少凝血现象的发生，而纤维蛋白原在材料表面蛋白吸附和血栓形成方面起着非常重要的作用，它与血小板形成复合体，加速凝血作用，纤维蛋白原转化为纤维蛋白包裹住血液中的某些成分，导致血栓形成。因此极性力分量越高，材料表面的血液相容性越优。材料与血液之间的界面能较小的时候，材料表面不易于吸附纤维蛋白，且吸附的蛋白层只会产生很少的构象变性，这样的材料有效抑制血小板的激活、团聚及变形，具有良好的血液相容性。

本发明分析了az31镁合金及在其表面制备的zn-mmt涂层对血液中红细胞、白细胞、血小板等的影响，通过溶血率、血细胞计数、体外动态凝血试验、血小板黏附试验评估了两种涂层的血液相容性，并通过测定材料浸提液中mg²⁺浓度、ph值及材料的接触角分析溶血及血小板黏附试验的机理，得出以下结论：

(1)az31镁合金表面制备了zn-mmt涂层后溶血率明显下降，均低于5％，达到医用生物材料对血液溶血率的要求。

(2)az31镁合金、zn-mmt涂层体外接触血液后，对血液成分无明显影响，虽然血液中的白细胞、红细胞及血小板数量均有一定程度减少，但均在正常范围。

(3)动态凝血时间试验表明，在达到0.10吸光值时，az31所用时间较短，时间较长的是zn-mmt涂层。zn-mmt抗凝血性能均优于az31镁合金基体。

(4)血小板粘附试验显示，az31镁合金和zn-mmt涂层的样品表面均黏附有很少的血小板，血小板形状不规则，但都没有伪足，表明血小板没有被激活，表现出了良好的抗血小板黏附性能。

(5)通过材料浸提液中mg²⁺浓度、ph值测定分析az31镁合金溶血率高的机理是：一是az31镁合金迅腐蚀后mg²⁺溶出，高浓度的镁离子使红细胞内外产生较大的渗透压差，红细胞膜破坏发生溶血；二是mg²⁺溶出，生成mg(oh)2，使浸提液ph升高，ph值较高时，血红蛋白和膜的结合效应较强，影响红细胞的溶血速率；另外，ph值较高时，血红细胞会与溶液中的ca²⁺发生融合反应，导致细胞破裂，造成溶血。而zn-mmt涂层的az31镁合金样品由于受到涂层的保护，避免了腐蚀反应的发生，使浸泡样品的溶液的mg²⁺无明显溶出、ph值保持恒定值(7.40左右)，因而溶血率下降。

(6)通过接触角测定表明在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层后材料的接触角明显减小，亲水性增加，是材料血液相容性好的机理。

5、zn-mmt涂层的抗菌实验

5.1抑菌圈实验

az31镁合金na-mmt涂层、zn-mmt涂层对e.coli和s.aureus的抑菌圈结果见图6。图6(a)(b)(c)az31、na-mmt涂层、zn-mmt涂层对e.coli抑菌圈，图6(d)(e)(f)是s.aureus平板上的抑菌圈，az31镁合金(图6(a)(d))，na-mmt涂层(图6(b)(e))对e.coli及s.aureus均未产生抑菌圈，说明az31镁合金，na-mmt涂层对两种菌无抑菌作用；az31镁合金zn-mmt涂层对e.coli及s.aureus均出现明显抑菌圈，直径分别为：25mm，23mm，说明在az31镁合金表面通过水热法制备的zn-mmt涂层对e.coli和s.aureus均有较好的抗菌效果。

5.2细菌生长曲线实验

5.2.1zn-mmt涂层对e.coli生长曲线的影响

az31镁合金zn-mmt涂层对e.coli生长曲线的影响见图7(a)。e.coli生长曲线呈s型，典型的细菌生长曲线；添加na-mmt涂层az31镁合金的e.coli生长曲线经历短暂的延迟期，迅速进入对数生长期、稳定期；az31镁合金组延迟期大约10h，然后进入正常生长。分析原因可能是：az31镁合金在菌液中发生降解，产生mg(oh)2，培养基轻度碱化，使细菌生长延迟，但是，由于e.coli是肠道菌群，对碱性环境适应性强，故很快进入对数生长期；zn-mmt涂层细菌菌液吸光值无明显变化，说明e.coli生长明显受到抑制。

5.2.2zn-mmt涂层对s.aureus生长曲线的影响

az31镁合金zn-mmt涂层对s.aureus生长曲线的影响见图7(b)，对照组及na-mmt涂层组s.aureus生长曲线呈s型，典型的细菌生长曲线，说明na-mmt涂层对s.aureus无抑制作用；az31镁合金组和zn-mmt涂层组细菌菌液吸光值无明显变化，表明s.aureus生长明显受到抑制。由此说明，表面有zn-mmt涂层的az31镁合金抑制了s.aureus生长；而az31镁合金组s.aureus受到抑制的原因可能是s.aureus对镁合金降解导致碱性环境不能耐受，生长受到抑制。

5.3zn-mmt涂层中zn²⁺体外累积释放

图8为涂层在磷酸缓冲液中的累积释放曲线，可以看出曲线分成两部分，第一部分前96h，zn²⁺以基本以恒速释放，96h后释放速度减慢，释放量明显减少；zn-mtt中的zn²⁺释放并没有出现以往研究人员做mmt缓释药物中先快，然后稳定，再减慢释放的结果，分析原因，可能前期制备zn-mmt中，对mmt表面物理吸附的zn²⁺进行彻底清洗，所以不会出现释放初期的快速释放阶段，而是化学吸附和插层中的zn²⁺缓慢释放的过程，持续约96h，以后zn²⁺释放出现明显减少，但仍有少量zn²⁺溶出，由此说明，az31镁合金表面的zn-mmt涂层中zn²⁺缓慢释放，持续达144h，对外科植入手术初期可以起到一定的抗菌效果。

6、结论

本发明以na-mmt为载体，硝酸锌为锌源，采用离子交换法，制备zn-mmt抗菌中间体；然后，利用水热法，在az31镁合金表面制备zn-mmt涂层；分析了涂层的结构、组成、形成机理及在dmem+10％fbs溶液中的降解行为和耐腐蚀机理；采用测定溶血率、动态凝血时间，血小板粘附实验、接触角计算等研究两种涂层的血液相容性；通过抑菌圈实验及细菌生长曲线的测定，分析zn-mmt涂层的抗菌性能及机理，得出以下结论：

(1)以zn²⁺含量为指标，对zn-mmt抗菌中间体制备过程中的各个影响因素进行分析，结果表明，在硝酸锌为4mmol、反应温度80℃、反应时间4h时分别得到最高载锌量。然后，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化工艺条件。最终的优化工艺为：硝酸锌为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，蒙脱石载锌量达到94.65mg/g。由此工艺获得的zn-mmt抗菌中间体电镜下呈不规则状，很少聚集，eds及xrd中均显示zn²⁺成功插入到蒙脱石片层中，蒙脱石片层的晶面间距由1.48nm增加到1.57nm。

(2)利用水热法，以az31为基体，温度160℃，ph10.5，时间36h，将将前期制备的抗菌中间体zn-mmt负载到az31镁合金表面，制备了zn-mmt涂层。涂层与基体结合紧密；高倍电镜可观察到除了mmt典型的片层状结构，还出现纳米锌的颗粒；eds及xrd均显示出锌的存在；电化学实验、析氢实验、浸泡过程中ph及镁离子测定，均显示出zn-mmt涂层提高了az31镁合金的抗腐蚀能力，起到较好地延缓降解的效果。

(3)对az31镁合金表面的zn-mmt涂层进行血液相容性分析。结果发现涂层溶血率均低于5％，基体的溶血率为41.62％，大于5％；zn-mmt涂层均对红细胞、白细胞、血小板数量无明显影响；对机体凝血无明显影响。总之，体外实验证明，az31镁合金表面的zn-mmt涂层提高了az31镁合金的血液相容性；分析其机理可能与两种涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

(4)对负载到az31镁合金后zn-mmt涂层的抗菌性能先后进行了分析。抑菌圈及细菌生长曲线实验证明对s.aureus和e.coli均有明显抗菌效果。对其抗菌机理机理可能为：na-mmt层间阳离子与具有杀菌作用的zn²⁺交换、吸附至层间，从而导致na-mmt电价失衡，使其本身带正电荷，通过静电作用吸引带负电荷的细菌，使细菌大量吸附在zn-mmt表面，然后zn²⁺发挥直接的杀菌作用，它的杀菌作用是静电吸附和zn²⁺杀菌能力共同作用的综合结果，发挥抗菌的作用的位点在细菌的细胞壁，即：zn²⁺作用于细菌的细胞壁，破坏细菌细胞壁的完整性，通透性增高，胞内物质外漏，菌体最终死亡。

(5)分析了az31镁合金表面zn-mmt涂层中zn²⁺的缓慢释放，结果表明，zn-mmt涂层中zn²⁺可以缓慢释放达144h，能够对医用植入材料植入初期起到抗菌作用，减少植入感染的机会。

综上所述，利用na-mmt制备抗菌中间体zn-mmt，将zn-mmt成功负载到az31镁合金表面，涂层延缓了镁合金基体的降解，提高了镁合金的血液相容性，zn-mmt涂层同时具备抗菌性能，zn²⁺缓慢释放达144h，能够对医用植入材料植入初期起到抗菌作用，减少植入感染的机会。由此推断，具有zn-mmt涂层的az31镁合金有望成为较好的功能性医用植入材料。

本发明利用水热法，在az31镁合金表面制备了zn-mmt涂层，系统地分析了涂层的形成机理、结构形貌、在模拟提液中的降解及耐蚀性机理，认为zn-mmt涂层有效地控制了镁合金的降解，此方面研究尚未见报道。

本发明利用水热法，在az31镁合金表面制备了zn-mmt涂层，在耐蚀性实验的基础上，首次对az31镁合金表面zn-mmt涂层进行系统的抗菌性能及缓释性能分析，认为制备的zn-mmt涂层具有较好的抗菌性能及缓释效果。

本发明首次系统地分析zn-mmt涂层的体外血液相容性及zn-mmt涂层降低az31镁合金溶血率的机理，为mmt应用到镁合金表面后制备医用植入材料，评价其生物安全性提供依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。