一种有序介孔TiO2及其在核酸分子检测上的应用的制作方法

本发明属于生物传感技术领域，特别是涉及一种有序介孔tio2及其在核酸分子检测上的应用。

背景技术：

癌症是威胁人类生命健康的重大疾病。国家癌症中心最新统计显示，每分钟大约有7人被确诊为癌症患者。早期诊断早期治疗，癌症是很容易治愈的。但往往由于检测技术的制约，癌症一经确诊，大多已处于中晚期，给癌症的治疗带来极大困难。因此，癌症早期诊断治疗是癌症防治的关键。

mirna是一类非编码、内源性的小分子rna(17～25个碱基)，广泛存在于动物和植物体内，在癌或肿瘤的发生、发展过程中起着关键作用。目前，mirna被公认最具潜力的肿瘤标志物。以mirna作为肿瘤标志物，比检测蛋白肿瘤标志物特异性更高、更直接、更具优势。但由于mirna片段短、在人体中含量低、序列同源性高(多数只相差一个碱基)，致使mirna的超灵敏的特异性检测仍面临诸多挑战。

传统的mirna分析方法包括northern印迹杂交法、微阵列分析法和实时定量聚合酶链式反应(qrt—pcr)等。northern印迹杂交法耗时费力，样品需求量大，要求微克级样品，这种方法灵敏度低、很难实现低丰度mirna及mirna高通量的检测。微阵列分析方法能够实现mirna高通量的检测，但其灵敏度低、特异性差、重复性差，容易出现假阳性问题，而且检测结果需要page/northernblotting、real-timepcr等技术确认，增加了操作复杂性和检测的成本。实时定量pcr(real-timepcr)虽然能够灵敏地定量检测低丰度表达的mirna，进行高通量筛选，是目前检测mirna表达最常用的技术，但是mirna序列短，逆转录困难，且引物设计复杂，控温严格。另外，pcr过程中非特异性扩增也容易导致假阳性。

近些年，一些新的mirna检测方法不断涌现，涉及生物发光、酶分析、分子信标、深度测序、锁核酸和桥连链式反应等等技术，但是这些方法仍然存在很多无法克服的缺陷，比如特异性和灵敏度相对较低，并且检测体系引入荧光指示剂及酶等外来分子标识，不但提高操作复杂性和检测成本，而且引入了外来误差，故无法满足mirna的检测的实际应用需求。

电化学技术具有选择性好、灵敏度高、快速经济，连续实时监测等突出优点，广泛应用于生命科学、生物医药等领域。电化学传感器性能的优劣，取决于电极传感材料的优劣，如何提高电化学传感性能，其中提高电极传感材料的电催化性能是重中之重。多孔材料由于其特殊的多孔性结构，使其具有高比表面积、高孔隙率、高透过性、可组装性等诸多物理化学性能，有利于物质的扩散、吸附和电解质的渗移，非常适于作为高效氧电极电催化材料及其载体材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种有序介孔tio2及其在核酸分子检测上的应用。本发明的有序介孔tio2材料以酵母生物体的特殊纳米结构为模板，利用生物矿化的原理仿生合成，其可用于电极传感活性材料制备生物传感电极，进一步用于核酸分子的检测，具有选择性高，灵敏度高，重复性好，操作简单经济等优点。

为了达到上述的目的，本发明提供如下技术方案：

一种有序介孔tio2，其通过如下方法制备而成：

(1)在室温条件下，利用葡萄糖水溶液培养酵母细胞，搅拌一定时间得到生物乳液；

(2)将ticl4的盐酸溶液缓慢滴加到步骤(1)的生物乳液中，滴加完成后在搅拌条件下继续矿化24h；

(3)在步骤(2)的溶液中加入氨水，反应得到水解产物；

(4)对上述水解产物进行水洗、醇洗、干燥，然后在300-600℃温度下进行热处理，得到有序介孔tio2。

进一步地，所述生物乳液中酵母菌的浓度为5g/l。

进一步地，所述ticl4的盐酸溶液的ticl4：盐酸体积比为1:1。

进一步地，所述ticl4的盐酸溶液与生物乳液的体积比为1:1。

进一步地，所述氨水的质量浓度为25～28％。

本发明还提供一种生物传感电极，包括将上述有序介孔tio2用导电胶组装到基底电极表面，制备得到有序介孔tio2修饰的生物传感电极。

进一步地，所述基底电极包括炭电极、金属电极中的一种。所述炭电极优选为玻碳电极、石墨电极或碳糊电极；所述金属电极优选为au电极、pt电极、cu电极或zn电极。

本发明还提供上述生物传感电极作为工作电极在电化学生物传感器上的应用。

进一步地，所述电化学生物传感器的对电极为pt电极，参比电极为ag/agcl/kcl饱和电极。

本发明还提供上述电化学生物传感器在核酸分子检测上的应用。

进一步地，包括利用上述电化学生物传感器对待检测溶液进行循环伏安扫描。

进一步地，将目标疾病的mirna的正配探针加入待检测溶液里，对待检测溶液进行循环伏安扫描，出现氧化峰，说明待检测溶液里含有目标疾病的mirna，循环伏安扫描不出现氧化峰，说明待检测溶液里不含有目标疾病的mirna。本发明中目标疾病mirna的正配探针是根据碱基配对原则设计的。

进一步地，所述探针为dna或rna，所述目标核酸基因片段是dna，cdna或rna。优选的，所述目标核酸基因片段为mirna。更优选的，所述mirna是人工合成的疾病特征mirna或其cdna，疾病细胞中提取的mirna，血清中提取的mirna，或病原体mirna。

本发明以生物酵母作为模板制备得到有序介孔tio2材料，并利用有序介孔tio2制备得到生物传感电极，将其应用于电化学生物传感器中，可以对核酸分子进行检测，例如直接快速检测出带有疾病特征的mirna核酸。

本发明在核酸分子检测上的应用具有以下优点：

(1)高选择性，能够检出核酸分子单碱基错配；

(2)可重复性，检测结果完全能够重复实现；

(3)操作过程经济简单，不存在链反应，无需扩增，无需荧光指示剂。

附图说明

图1不同煅烧温度下生物模板介孔tio2样品的氮气吸脱附等温曲线：300℃(■)，400℃(●)，500℃(▲)，600℃(◆)。

图2电催化传感活性比较与肿瘤选择性检测：不同煅烧温度制备的酵母介孔tio2组装的传感电极对对胰腺癌mirna探针正配(a-d)和错配(e-k)的电化学传感检测。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。

一、有序介孔tio2的制备

(1)在葡萄糖水溶液中，在室温下培养定量酵母细胞，搅拌30分钟后，形成均匀的生物乳液，生物乳液中酵母菌的浓度为5g/l(临界胶束浓度)。

(2)在通风橱中，将ticl4(99％)溶于hcl溶液，形成ticl4溶液，体积比为1:1的ticl4的盐酸溶液；然后在磁力搅拌器搅拌下，将ticl4溶液缓慢滴加到步骤(1)的生物乳液中，所述ticl4的盐酸溶液与生物乳液的体积比为1:1，滴加完成后在搅拌条件下继续矿化24h。

(3)在步骤(2)的溶液中中加入质量浓度为25～28％氨水做水解促进剂，反应得到水解产物。

(4)水解产物进行水洗3次和醇洗3次，并在80℃干燥，然后将干燥样品在不同温度(300～600℃)下热处理3h，得到有序介孔tio2。不同煅烧温度(300℃，400℃，500℃，600℃)下生物模板介孔tio2样品的氮气吸脱附等温曲线如图1所示。

二、核酸分子检测

实施例1：胰腺癌mir-1290电化学检测

将胰腺癌mir-1290人工合成的片段(5'-uggauuuuuggaucaggga-3')与其完美配对的探针(5'-tccctgatccaaaaatcca-3')和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在玻碳基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述胰腺癌核酸待测溶液进行电化学伏安扫描，结果在0.2v处出现电化学氧化峰，而对胰腺癌mir-1290错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰(参见图2)。

实施例2：前列腺癌mir-141电化学检测

将前列腺癌mir-141人工合成的cdna片段(5'-taacactgtctggtaaagatgg-3')与其完美配对的探针(5'-ccatctttaccagacagtgtta-3')和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在石墨基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述前列腺癌核酸待测溶液进行电化学伏安扫描，结果在0.15v处出现电化学氧化峰，而对前列腺癌mir-141错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

实施例3：乳腺癌mir-29c电化学检测

将乳腺癌mir-29c人工合成的cdna片段(5'-cgatttctcctggtgttca-3')与其完美配对的探针(5'-tgaacaccaggagaaatcg-3')和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在碳糊基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述乳腺癌核酸待测溶液进行电化学伏安扫描，结果在0.24v处出现电化学氧化峰，而对乳腺癌mir-29c错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

实施例4：肺癌患者血清中提取的mirna电化学检测

将肺癌患者血清中提取的mirna片段(5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')与其完美配对的探针(5'-tcaacatcagtctgataagcta-3')和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在金基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述肺癌核酸待测溶液进行电化学伏安扫描，结果在0.22v处出现电化学氧化峰，而对肺癌患者血清中提取的mirna错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

实施例5：肝癌细胞中提取的mirna电化学检测

将肝癌细胞中提取的mirna片段的cdna片段(5'-tggagtgtgacaatggtgtttg-3')与其完美配对的探针(5'-caaacaccattgtcacactcca-3')和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在铂基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述肝癌核酸待测溶液进行电化学伏安扫描，结果在1.2v处出现电化学氧化峰，而对肝癌细胞中提取的mirna错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

实施例6：炭疽病毒cdna的电化学检测

将炭疽病毒rna片段(5’-aucuuuagaagcauuaucugaagauaagaaaaaaa-3’)与其完美配对的探针(5’-d(gattttttt)-2’-o-me-rna(cuuaucuucagauaa)-d(tgcttctaaagat)-nh2-3’)和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在锌基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述炭疽病毒rna杂交溶液进行电化学伏安扫描，结果在1.5v处出现电化学氧化峰，而对炭疽病毒cdna错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

实施例7：大肠杆菌e.colirnas的电化学检测的电化学检测

将大肠杆菌e.colirnas片段(nt5’-auguggauuggcgauaaaaaacaa-3’)与其完美配对的探针(5’-d(gttgtttttt)-2’-o-me-rna(aucgccaauccacau)-d(ctgtgaaaga)-nh2-3’)和任意错配探针分别在ph＝7.4的磷酸缓冲液(pbs)中杂化，制备核酸待测溶液。酵母模板法合成的有序介孔tio2，用导电胶组装在铜基底电极上，制成有序介孔tio2修饰传感电极，以此电极作为工作电极，pt电极作为对电极，ag/agcl/kcl饱和电极作参比电极，对上述大肠杆菌e.colirnas杂交溶液进行电化学伏安扫描，结果在1.75v处出现电化学氧化峰，而对大肠杆菌e.colirnas错配的核酸溶液进行电化学伏安扫描，则没有电化学氧化峰。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。