专利名称：一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法
技术领域：
本发明涉及磷脂类，尤其涉及一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法。
背景技术：
磷脂是一类含磷的脂类物质，主要来源于大豆和蛋黄。磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl Ethanolamine，简称PE)和磷脂酰胆碱(Phosphatidyl Choline，简称PC)是其中两种重要的磷脂，俗称脑磷脂和卵磷脂，被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。高纯度脑磷脂是良好的天然表面活性剂，具有独特的生物活性和生理功能，无毒、无污染、无刺激，易生物降解而受到国内外科技界和工业界的高度重视，其需求在逐年增加，但目前纯度大于90％的脑磷脂产品我国尚依赖进口，因此开发出适合我国国情的、低成本、高纯度脑磷脂制备方法，具有重要的经济和社会价值。
脑磷脂的精制方法主要有萃取法、柱层析法、沉淀法、膜分离法等。柱层析法由于具有操作简便、分离效果好、不需昂贵设备、处理量大等优点，因而倍受关注。在柱层析法研究中，目前主要集中在价廉的硅胶和氧化铝。对于氧化铝通常是PC先出峰，而对于硅胶通常是PE先出峰。为了得到高纯度的PE，本专利采用硅胶作为吸附剂，同时选用除PC和PE外其它磷脂较少的蛋黄作为原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法。
方法的步骤如下1)新鲜蛋黄先用丙酮脱脂，真空抽滤，滤饼用酒精提取，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂；2)经钝化的硅胶用二氯甲烷-甲醇混合溶剂湿法装柱，先用二氯甲烷-甲醇混合溶剂冲洗；3)粗磷脂用二氯甲烷-甲醇混合溶剂溶解后加入层析柱，并开始收集流出液；4)待卵磷脂开始穿透后用纯甲醇冲洗，收集流出液；5)流出液经薄层色谱TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后可得到纯度大于90％的脑磷脂；
6)最后用含氨水的甲醇溶液再生柱子，再用二氯甲烷-甲醇混合溶剂冲洗后可重新进样。
本发明的具有以下优点1)工艺简单，操作方便，较适合于大规模工业化制备；2)硅胶可循环使用，成本较低；3)硅胶柱层析过程可在室温下进行；4)产品纯度高，经本工艺精制后可得纯度大于90％的脑磷脂产品；5)为近年来鸡蛋丰产、供过于求、难以存放等问题的解决提供新方法，为鸡蛋的深加工开辟一条新路，促进禽蛋行业的发展。
具体实施例方式
溶剂提取法得到的粗磷脂，用二氯甲烷-甲醇混合溶剂溶解后在室温下过硅胶柱，待PC开始流出后改用纯甲醇冲洗，收集流出液，经TLC分析后合并脑磷脂的馏份，再经浓缩、冷冻干燥后可得脑磷脂产品。柱子经含氨水的甲醇溶液再生、二氯甲烷-甲醇混合溶剂冲洗后可循环使用。
实施例1新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC75.0％(wt％)、PE16.0％(wt％)。取含水量为10％的硅胶用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进60ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇10％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.55g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为91％。柱子用含氨2％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗150ml，再用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例2新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC75.0％(wt％)、PE16.0％(wt％)。取含水量为12％的硅胶用含甲醇20％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇20％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进55ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇20％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.50g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为92％。柱子用含氨1％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗200ml，再用含甲醇20％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例3新鲜蛋黄先用丙酮脱脂二次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC74.0％(wt％)、PE15.0％(wt％)。取含水量为14％的硅胶用含甲醇30％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇30％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进50ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇30％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.46g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为90％。柱子用含氨0.5％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗300ml，再用含甲醇20％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例4新鲜蛋黄先用丙酮脱脂二次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC74.0％(wt％)、PE15.0％(wt％)。取含水量为8％的硅胶用含甲醇40％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇40％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进50ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇40％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.43g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为90％。柱子用含氨3％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗150ml，再用含甲醇40％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例5新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取三次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC74.5％(wt％)、PE15.5％(wt％)。取含水量为10％的硅胶用含甲醇50％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇50％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进50ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇50％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.40g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为89％。柱子用含氨0.1％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗500ml，再用含甲醇50％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例6新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取三次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC74.5％(wt％)、PE15.5％(wt％)。取含水量为12％的硅胶用含纯二氯甲烷溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用纯二氯甲烷溶剂冲洗50ml。进70ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为纯二氯甲烷)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.65g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为91％。柱子用含氨0.5％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗200ml，再用纯二氯甲烷溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
实施例7新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用无水酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC76.0％(wt％)、PE16.5％(wt％)。取含水量为12％的硅胶用含甲醇5％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇5％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进65ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇30％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.62g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为92％。柱子用含氨1％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗200ml，再用含甲醇5％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。
权利要求
1.一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法，其特征在于，方法的步骤如下1)新鲜蛋黄先用丙酮脱脂，真空抽滤，滤饼用酒精提取，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂；2)经钝化的硅胶用二氯甲烷—甲醇混合溶剂湿法装柱，先用二氯甲烷—甲醇混合溶剂冲洗；3)粗磷脂用二氯甲烷—甲醇混合溶剂溶解后加入层析柱，并开始收集流出液；4)待卵磷脂开始穿透后用纯甲醇冲洗，收集流出液；5)流出液经薄层色谱TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后可得到纯度大于90％的脑磷脂；6)最后用含氨水的甲醇溶液再生柱子，再用二氯甲烷—甲醇混合溶剂冲洗后可重新进样。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法，其特征在于所说的二氯甲烷—甲醇混合溶剂中甲醇的含量为体积百分比0％～50％。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法，其特征在于所说的经钝化的硅胶是指通过加入少量水以减少硅胶的活性，经钝化后的硅胶含水量为重量百分比8％～14％。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法，其特征在于所说的含氨水的甲醇溶液中氨的含量为重量百分比0.1～3％。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度蛋黄脑磷脂的制备方法。方法的步骤如下1)新鲜蛋黄先用丙酮脱脂，真空抽滤，滤饼用酒精提取，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂；2)经钝化的硅胶用二氯甲烷－甲醇混合溶剂湿法装柱，先用二氯甲烷－甲醇混合溶剂冲洗；3)粗磷脂用二氯甲烷－甲醇混合溶剂溶解后加入层析柱，并开始收集流出液；4)待卵磷脂开始穿透后用纯甲醇冲洗，收集流出液；5)流出液经薄层色谱TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后可得到纯度大于90％的脑磷脂；6)最后用含氨水的甲醇溶液再生柱子，再用二氯甲烷－甲醇混合溶剂冲洗后可重新进样。本发明具有工艺简单、操作方便、产品纯度高、成本较低、较适合于大规模工业化制备等优点。
文档编号C07F9/00GK1733776SQ20051005067
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者吕秀阳 申请人:浙江大学