专利名称：一种用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法
技术领域：
一种用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法，属于磷脂分离纯化技术领域。
背景技术：
大豆磷脂是多种磷脂的混合物，其主要成分有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)等物质。其中磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)，俗称卵磷脂，是一种在动植物中分布很广的天然两性表面活性剂，其化学结构式如下所示，它无毒、无刺激、易生物降解，具有特殊的生理功效。大豆磷脂中存在的不同磷脂具有结构类似性，PC比其他磷脂的极性强，在pH＝7的时候PC分子胆碱的N带一个正电荷，磷酸上的O带一个负电荷，整个分子呈电中性不带电荷。
PC的结构式磷脂酰胆碱具有重要的药物价值，从磷脂中分离磷脂酰胆碱也一直是国内外磷脂研究的重要课题，目前国内外学者研究的分离方法主要包括低碳醇法、超滤法、沉淀法、色谱法和超临界流体法等，其中，色谱法根据填料的不同可分为以下几种三氧化二铝柱层析法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法，上述方法主要是针对PC与PE这两种磷脂的分离，制得的PC产品纯度在90％左右，三氧化二铝柱对其他磷脂的吸附能力较强只能将极性较强的PC从柱上洗脱下来，洗脱的周期较短但过程中会产生溶血磷脂；硅胶柱可以实现PC、PE、PI等几种磷脂的分离，但是洗脱周期较长；离子交换树脂分离磷脂的研究较少，仅对树脂分离磷脂的可行性进行了研究，具体工艺参数方面的研究不够系统。根据分离物结构特点，提出了离子交换树脂分离磷脂酰胆碱的方法，而且离子交换树脂可再生重复使用，成本低、较适合大规模工业化制备等特点，目前未见国内外关于此方面的报道文章。
发明内容
本发明的目的是提供一种用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法，对用离子交换树脂分离纯化磷脂酰胆碱的吸附和洗脱的工艺进行了研究，实现磷脂酰胆碱的分离纯化，并确定了相应的工艺参数。
本发明的技术方案用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法，是以醇溶磷脂为原料，配成浓度3-5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113-IIIFC树脂层析柱(2.8×50cm)中，再用95％乙醇以0.5-1mL/min的速度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，真空干燥得到淡黄色塑状体磷脂酰胆碱产品。
所用D113-IIIFC树脂使用前须经预处理，D113-IIIFC阳离子交换树脂预处理方法取处理树脂体积两倍的饱和食盐水，将树脂置于饱和食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色，再用树脂体积2倍的4％NaOH溶液，在其中浸泡2-4小时，放尽碱液后冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用树脂体积2倍的5％HCl溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂至中性待用。
所用树脂进行筛选时均需进行预处理，阳离子交换树脂的预处理方法同D113-IIIFC树脂使用前的预处理。
阴离子交换树脂的预处理方法为饱和食盐水，取约等于处理树脂体积的两倍，将树脂置于食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色，其次再用5％HCl溶液，用量为树脂体积的2倍，在其中浸泡4-8小时，放尽酸液后冲洗树脂直至排出水接近中性为止。最后用4％NaOH溶液，用量为树脂体积的2倍，浸泡2-4小时，放尽碱液，用清水漂至中性待用。
树脂再生用95％乙醇洗脱树脂柱直至流出液为无色，经多次使用后树脂吸附的杂质较多，颜色变深，可从柱上端依次加入2％NaOH和5％HCl水溶液洗脱，最后用水洗至流出液为中性即可再用。
树脂筛选静态吸附吸附量和吸附率的测定分别准确称取经预处理的树脂2g放入150mL的锥形瓶中，再加入一定浓度的醇溶磷脂溶液30mL，静态吸附24h后，测定溶液中磷脂酰胆碱的浓度。按下式计算各种树脂的吸附量和吸附率。
Q=(C0-Ce)×VW]]>E%=C0-CeC0×100%]]>其中
Q-吸附量(mg/g) E％-吸附率C0-吸附原液中磷脂酰胆碱浓度(mg/mL) V-吸附液的体积(mL)Ce-吸附平衡后溶液中磷脂酰胆碱浓度(mg/mL)W-树脂的重量(g)静态解吸率的测定树脂在分离天然物质中有效成分时是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于树脂极性不同，对磷脂酰胆碱吸附强弱不同，解吸难易程度不同。因此，工业上希望树脂不仅吸附量大，还要求解吸率高，以保证有效成份最大限度的回收。解吸率测定是树脂试验的重要环节。
取吸附饱和的6种不同型号树脂，依次用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇30mL在恒温震荡器中震荡24h，过滤，取滤液定容，测定磷脂酰胆碱含量，按下式计算解吸率B%=C1×V1(C0-Ce)××100%]]>其中B％-解吸率 C1-解吸液中PC的浓度(mg/mL)V1-解吸后体积(mL) C0-吸附原液中PC的浓度(mg/mL)V-吸附液体积(mL)Ce-吸附平衡后溶液中PC的浓度(mg/mL)本发明的有益效果用本发明方法处理磷脂得到的产品，产品中磷脂酰胆碱(PC)含量为94.02％(wt％)，产品得率为80.74％。
图1醇溶磷脂进样液浓度对吸附率的影响。
图2进样液pH对吸附率的影响。
图3不同浓度乙醇对PC的洗脱效果。
图495％乙醇的洗脱曲线。
图5洗脱流速对洗脱效果的影响。
图6重复洗脱的次数。
具体实施例方式
实施例1树脂的筛选单位质量的树脂对磷脂酰胆碱的吸附量是设备设计的重要参数。树脂的吸附性能与被吸附分子的极性、大小以及吸附剂的极性、比表面积、孔径大小等因素有非常密切的关系。选择10种离子交换树脂，它们对磷脂酰胆碱的静态吸附情况见表1。
由表1可知，201×7、201×4、D296具有较高的吸附率，其次是D113-IIIFC、001×7、SQD-88，而D001、SQD-61、D301-III、D318的吸附率较小。根据工业应用要求，选择吸附率较高的201×7、201×4、D296、D113-IIIFC、001×7、SQD-88六种树脂作静态解吸实验。用100％乙醇进行解吸，其解吸实验结果见表2。由表2可知，D113-IIIFC的解吸率较高，而吸附率很高的阴性离子交换树脂的解吸率极低。
表1 10种离子交换树脂对磷脂酰胆碱的吸附量和吸附率
表2 6种树脂对磷脂酰胆碱的解吸率和解吸量
用不同浓度的乙醇对吸附饱和的D113-IIIFC进行静态解吸实验，结果见表3。由表3可见，60％、80％的乙醇对PC的解吸作用相对较大；浓度较低的乙醇对PC的解吸作用很小，这可能是因为低浓度的乙醇对PC的溶解性较小的原因。
表3 不同浓度乙醇对D113-IIIFC的解吸率
吸附量、解吸率和选择性是大孔型离子交换树脂在分离天然产物时需要考虑的重要参数，它不仅要求吸附树脂具备较高的吸附量，同时还应该具有较高的解吸率和选择性。因此，从吸附量和解吸率综合考虑，在分离磷脂酰胆碱的过程中，D113-IIIFC是一种较为理想的吸附型离子交换树脂，因此选择D113-IIIFC树脂进行后续实验。
实施例2进样液浓度对吸附效果的影响将不同浓度的醇溶磷脂溶液进行动态吸附实验，结果如图1所示。由图1可以看出，当醇溶磷脂浓度为3～5mg/mL时，树脂对PC的吸附率均比较理想。当醇溶磷脂浓度为3mg/mL时，树脂对PC的吸附率最大，达42.97％，故最佳上样浓度选择3mg/ml。
实施例3进样液pH对吸附效果的影响在不同pH值下进行吸附试验，结果如图2所示。结果表明，在弱碱性条件下PC和PE的吸附效果均比较理想，进样液的pH值为7.5左右时即没有改变原溶液pH的情况下，D113-IIIFC树脂对PC的吸附率最大，继续增加pH则吸附率明显下降。这是由于树脂本身是弱酸性的阳离子交换树脂，在弱碱性条件下更有利于PC和PE与之发生离子交换，但是当pH过大时，由于大量的钠离子与PC(或PE)发生竞争吸附，同时碱性过大对树脂本身不利，从而导致吸附率下降。综合考虑吸附效果与工艺的简易性采用不调节pH直接进行吸附分离。
实施例4吸附流速对吸附效果的影响吸附流速主要是影响溶质向树脂表面的扩散，从而决定了吸附效果。如果流速太快，溶质分子来不及扩散到树脂内表面，就会发生泄露，造成样品的流失。将醇溶磷脂溶液分别以0.5、1、1.5、2、2.5ml/min吸附流速上柱。按下式计算泄露率。
试验结果显示，吸附流速变化时对树脂吸附PC(泄漏率36％左右)的效果影响不大，反而在1ml/min的流速时PE的泄漏率最大，88.6％。PE吸附的越少在后续分离实验中对PC的富集影响越小，因此选择1ml/min的吸附流速。
实施例5洗脱液的选择和洗脱曲线的绘制D113-IIIFC树脂是一种大孔型丙烯酸系弱酸阳离子交换树脂，根据相似相溶原理，依次用不同浓度的乙醇-水溶液作为洗脱剂。将一定浓度的醇溶磷脂溶液上柱，达到吸附饱和后，在流速1mL/min下，分别用30％、45％、60％、80％、95％乙醇洗脱，洗脱结果见图3。由图3可以看出，95％乙醇洗脱效果最好，其洗脱峰集中，对称性较好，无明显的拖尾现象；30％乙醇几乎不能洗脱磷脂酰胆碱；45％乙醇洗脱效果较60％乙醇和85％乙醇洗脱效果好，但45％、60％、85％乙醇对PC的洗脱能力相对95％乙醇而言比较弱，而且谱带较宽。
由图4可以看出，用4倍柱床体积的95％乙醇基本上可以将PC洗脱下来，且洗脱峰较集中。因此，最佳洗脱剂用量是4倍的柱床体积。从结果可见，虽然树脂吸附的PE量交PC少，但PE没有被洗脱下来。实现PE的回收，并实现树脂的循环使用。
实施例6洗脱流速对洗脱效果的影响洗脱流速决定着生产周期，为了保证较高的纯度和处理量，必须选择合适的洗脱流速。将一定浓度的醇溶磷脂溶液吸附在树脂柱上，然后用95％乙醇洗脱，控制0.5、1、1.5、2、2.5、3mL/min不同的流速，收集相同柱床体积的洗脱液，实验结果见图5。
由图5可以看出，洗脱流速对洗脱效果有一定的影响。当洗脱流速在0.5～1mL/min时，PC的浓度几乎不变；当洗脱流速大于1.5mL/min时，PC的解吸率大幅度下降。实验结果表明，洗脱流速越慢洗脱效果越好，但太慢又会使工作周期延长。综合考虑，洗脱流速为1mL/min为最佳。
实施例7树脂使用次数对吸附的影响树脂使用次数对吸附效果的影响如图6所示。化合物经树脂柱吸附之后，在树脂表面或内部还残存着许多非极性成分，或吸附性成分，这些杂质会堵塞树脂孔道，或使某些官能团失去吸附性能，即毒化树脂，因此必须在下一次使用时再生树脂。通常再生树脂的方法是根据吸附物质的性质和树脂本身的性质决定的。
由图6得出，树脂在连续使用6次后对PC的吸附率下降不是很明显，而对PE的吸附率则在连续使用4次后就发生了明显的下降，因此D113-IIIFC树脂在制备PC的时候至少可以连续使用6次后再进行再生。
实施例8最佳工艺条件下验证实验将醇溶磷脂样品配成浓度3mg/mL左右的醇溶磷脂的乙醇溶液，1mL/min流速下，加入到D113-IIIFC树脂层析柱(2.8×50cm)中。再用95％乙醇以1mL/min的速度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，真空干燥得到淡黄色塑状体PC产品。测定得，产品中磷脂酰胆碱(PC)含量为94.02％(wt％)，产品得率为80.74％。
权利要求
1.一种用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法，其特征是以醇溶磷脂为原料，配成浓度3-5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113-IIIFC树脂层析柱中，再用95％乙醇以0.5-1mL/min的速度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，真空干燥得到淡黄色塑状体磷脂酰胆碱产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用D113-IIIFC树脂使用前须经预处理，D113-IIIFC阳离子交换树脂预处理方法取处理树脂体积两倍的饱和食盐水，将树脂置于饱和食盐溶液中浸泡18-20小时，然后放尽食盐水，用清水漂洗净，使排出水不带黄色，再用树脂体积2倍的4％NaOH溶液，在其中浸泡2-4小时，放尽碱液后冲洗树脂直至排出水接近中性为止，最后用树脂体积2倍的5％HCl溶液浸泡4-8小时，放尽酸液，用清水漂至中性待用。
全文摘要
一种用树脂层析法从磷脂中分离纯化磷脂酰胆碱的方法，属于磷脂分离纯化技术领域。本发明以醇溶磷脂为原料，配成浓度3－5mg/mL的醇溶磷脂的乙醇溶液，以1mL/min流速加入到D113－IIIFC树脂层析柱中，再用95％乙醇以0.5－1mL/min的速度洗脱，收集洗脱液，蒸发浓缩除去溶剂，真空干燥得到淡黄色塑状体磷脂酰胆碱产品。本发明提出了离子交换树脂分离磷脂酰胆碱的方法，而且离子交换树脂可再生重复使用，成本低、较适合大规模工业化制备等特点。用本发明方法处理磷脂得到的产品，产品中磷脂酰胆碱(PC)含量为94.02％(wt％)，产品得率为80.74％。
文档编号C07F9/00GK101033236SQ20071002121
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者刘元法, 王兴国, 金青哲, 汪燕 申请人:江南大学