肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤的制作方法

专利名称：肽、pna或寡核苷酸的耐溶剂渗滤的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备化合物、特别是选自肽、寡核苷酸和肽核酸的化合物的方法。
背景技术：
肽、寡核苷酸和肽核酸是生物学上的重要分子，包括由不同重复单元组成的聚合物。就肽而言，重复单元是氨基酸或其衍生物，而就寡核苷酸而言，重复单元是核苷酸或其衍生物。寡核苷酸可进一步分成RNA寡核苷酸和DNA寡核苷酸，正如为本领域技术人员所熟知的，参见例如 P. S. Millar,Bioconjugate Chemistry，1990，第 1 卷，第 187-191 页。就肽核酸(PNA)而言，骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。各种各样的嘌呤碱基和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。肽中氨基酸的序列、RNA中 RNA核苷酸的序列或DNA中DNA核苷酸的序列、或PNA中嘌呤碱基和嘧啶碱基的序列，决定生物系统中所述化合物的功能与作用。所述化合物通过将其重复单元偶联在一起而合成，以得到特定序列。可使用保护基在一个或更多个反应位点上保护重复单元，以将偶联反应导向被保护重复单元上的特定位点。在偶联反应之后可能需要脱保护反应，以除去保护基并为随后的偶联反应准备化合物。合成按周期顺序发生，每个周期包括偶联反应和紧接着的脱保护反应。在反应之间，将过量试剂和反应副产物的痕迹去除至非常低的水平对于预防重复单元序列中形成的错误序列是必要的。当偶联反应或脱保护反应在液相中进行时，该纯化通常是冗长的，而且通过耗时的沉淀、结晶或色谱操作来实现。可获得的用于肽、寡核苷酸和肽核酸偶联和脱保护的化学和方法已经有大量的文献记载。肽合成于1963年由于固相合成的出现(Merrifield RB J Am Chem Soc 8.5， (1963)2149)而得到变革。在这种方法中，序列中第一个氨基酸结合到树脂珠上。随后的氨基酸被偶联到结合于树脂的肽上，最后，当所需肽已经生长时，将其从树脂上切下。重要的是，在每个偶联反应或脱保护反应结束时，残留的未反应的受保护氨基酸、过量试剂和其他副产物可通过洗涤除去，包括在过滤器上洗涤树脂，或用溶剂冲洗树脂的填充床。固相肽合成现在是实验室和商业合成的技术标准。寡核苷酸的合成遵循与肽相似的技术发展，如 Sanghvi，YS，Org Proc Res & Dev 4(2000) 168-169所描述的，并且依赖于固相合成，其中第一个寡核苷酸被连接到固相上。其他寡核苷酸通过偶联反应和脱保护反应的循环而连接， 在反应之间通过洗涤，包括在过滤器上洗涤树脂，或用溶剂冲洗树脂的填充床来进行纯化。膜法在分离科学领域内众所周知，可适用于液相和气相中一系列不同分子量样品的分离(参见例如"Membrane Technology “于 Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第4版1993，第16卷，第135-193页)。纳米过滤是使用膜的膜法，膜孔在0. 5 至5纳米的范围内，且具有200-3，000道尔顿的MW截止值。纳米过滤已经广泛应用于水性流体的过滤，但由于缺少适当的溶剂稳定性膜而尚未广泛应用于有机溶剂中溶质的分离。 超滤膜通常具有的MW截止值在1，000至500，000道尔顿的范围内。最近已发展了新种类的膜，其甚至在最困难的溶剂中稳定，如P. Vandezande, L. Ε. M. Gevers和I. F. J. Vankelecom Chem. Soc. Rev.，(2008)，第37卷，第365-405页中所报道。这些膜可以是高分子膜或陶瓷膜、或混合基质无机/有机膜。渗滤是液体过滤法，在该方法中，包含至少两种溶质的料液与膜接触，并经加压以使液体的某些组分通过膜，其中至少一种溶质比至少一种其他溶质对膜具有更高的排斥。 将额外的液体送入膜的加压侧以补偿透过膜的液体。渗透物和保留物中更高度保留的溶质的浓度与保留较少的溶质的浓度之间的比例发生动态变化，在保留物中提高而在渗透物中下降。膜分离对肽合成的应用已被报道用于经生物合成产生肽的再浓缩，如suru T， Nakao S, Kimura S, Shutou T,Sep. Sci. and Technol.，第四卷，(1994)，第 971-984 页中所描述，或从水溶液中回收氨基酸，如Li S，Li C，Lui Y，等人，J.Mem. Sci.，第222卷0003)， 第 191-201 页或 Wang X，Ying A, Wang W, J. Mem. Sci.，第 196 卷(2002)第 59-67 页中报道。在US 3，772，264中报道了在肽合成过程中应用膜从过量试剂和反应副产物中分离生长的肽。肽在液相中合成，以聚(乙二醇)(PEG)作为分子锚定基，用水相超滤实现从杂质中分离出生长的肽链。所述分离需要在每个偶联步骤之后蒸发有机溶剂、中和、然后在每次脱保护之后进行蒸发，然后为了偶联或脱保护，在超滤之前从水溶液中吸收水。然后，在将 PEG锚定肽再溶解到有机溶剂中以进行下一偶联或脱保护步骤之前，通过蒸发和/或共沸蒸馏除去水。从商业角度看，该方法的复杂性使其不合乎需要。发明概述根据本发明，提供用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法；该方法包括(i)合成所述第一化合物；和(ii)分离步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物，该第二个化合物是第一个化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，其中第一和第二化合物溶解于有机溶剂中并通过使用膜的渗滤法分离，其中该膜在有机溶剂中稳定，且对第一化合物提供的排斥大于对第二化合物的排斥。本发明进一步提供用于在有机溶剂中分离第一化合物与第二化合物的方法，其中(i)将第一化合物和第二化合物都溶解于所述有机溶剂中；(ii)第一化合物选自肽、寡核苷酸和肽核酸；且(iii)第二化合物是形成第一化合物反应的副产物和/或用于所述反应的试剂；其中所述分离通过使用膜的渗滤法进行，该膜在有机溶剂中稳定，且对第一化合物提供的排斥大于对第二化合物的排斥。附图简述

图1显示了从Ap A2和A3的重复单元合成肽(ρ印tide)、寡核苷酸 (oligonucleotide)或肽核酸(peptide nucleic acid)(在图中统称为"tide")的通用方法。图2显示了膜增强的肽合成的示意图。图3显示了实施例2和3中描述的用于膜增强的肽合成的设备，和实施例4中描述的用于寡核苷酸合成的设备。图4显示实施例1中产生的五肽的HPLC色谱数据。
图5显示实施例1中产生的五肽的MALDI-T0F质谱。图6显示实施例2中产生的五肽的HPLC色谱数据。图7显示实施例2中产生的五肽的MALDI-T0F质谱。图8显示实施例3中产生的五肽的HPLC数据。图9显示实施例3中产生的五肽的MALDI-T0F质谱。图10显示实施例4中产生的二聚寡核苷酸的NMR数据。图11显示实施例4中产生的二聚寡核苷酸的NMR数据。各种实施方案的描述本文所使用的术语“肽”另外包括肽衍生物。肽衍生物的实例为包含一个或更多个合成的或化学修饰的氨基酸、一个或更多个保护基或位于肽链一端或两端的端基的肽。在本发明的实施方案中，肽包含小于200个氨基酸残基。在本发明的具体实施方案中，肽包含小于100个氨基酸残基。在本发明的另一实施方案中，肽包含小于50个氨基酸残基。本文所使用的术语“寡核苷酸”另外包括寡核苷酸衍生物，例如包含一个或更多个合成的或化学修饰的寡核苷酸、一个或更多个保护基，或一个或更多个位于寡核苷酸链末端的端基的寡核苷酸。本文所使用的术语“肽核酸”或“PNA”另外包括肽核酸衍生物，例如包含一个或更多个化学修饰的嘌呤碱基或嘧啶碱基、一个或更多个保护基、或一个或更多个位于肽核酸链末端的端基的肽核酸。依照本发明，第一化合物通过渗滤与第二化合物分离。渗滤可以两种操作模式进行。第一种操作模式是恒定容量渗滤，其中新鲜溶剂被送入渗滤系统，其进料速率与渗透物从系统中排出的速率相同，从而维持系统中的恒定容量。第二种操作模式是可变容量渗滤， 其中过滤容量通过从系统中排出渗透物而减少，且在额外渗透物被排出之前定期向系统加入新鲜溶剂以增加系统容量。适当的是，第一化合物具有大于200道尔顿的分子量。在本发明的具体实施方案中，第一化合物具有大于300道尔顿的分子量。在本发明的优选实施方案中，第一化合物具有大于500道尔顿的分子量。第二化合物是形成第一化合物的合成反应的副产物，或是用于所述反应的试剂。 可使用本领域内已知的合成第一化合物的任何适宜的方法。该合成反应可以是偶联反应或脱保护反应。适宜的是，合成在液相中进行。具体而言，合成可在有机溶剂存在下进行，该有机溶剂可以与用于渗滤的有机溶剂相同或不同。在一种实施方案中，该方法包括在分离之后修饰第一化合物。例如，第一化合物可通过进行一个或更多个额外的偶联和/或脱保护步骤而被修饰。经修饰的化合物随后可被提纯，特别是使用本发明的渗滤法提纯。在一种实施方案中，本发明的方法包括多个连续的偶联、脱保护和分离步骤，从而促进各种各样的肽、寡核苷酸和肽核酸的合成。本发明中供使用的适宜的膜包括高分子膜和陶瓷膜，和混合的高分子膜/无机膜。膜排斥氏是本领域技术人员已知的普通术语且可如下定义
(C ΛRi = I--Tl X100%(1)
I CA. J
其中Cim =渗透物中样品i的浓度，该渗透物是已穿透膜的液体，而Cim =保留物中样品i的浓度，该保留物是尚未穿透膜的液体。若R(第一化合物)>R(第二化合物)， 则认为该膜适用于本发明。可由任何聚合物材料或陶瓷材料形成本发明的膜，其提供能够优先把所述tide 与至少一种反应副产物或试剂分离的分离层。优选膜由选自适用于制造微滤膜、超滤膜、纳米滤膜或反渗透膜的聚合物材料的材料形成或包含所述材料，所述材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚苯醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、 聚醚酰亚胺、醋酸纤维素、聚苯胺、聚吡咯及它们的混合物。所述膜可通过本领域已知的任何技术包括烧结、拉伸、径迹蚀刻、模板浙滤、界面聚合或相转化来制造。更优选，膜可经交联或处理以便提高其在反应溶剂中的稳定性。特别值得提及的是WO 2007/125367中描述的膜，该申请的内容在此引入作为参考。在一种实施方案中，所述膜是包含支持体和薄的选择性渗透层的复合材料，且其无孔选择性渗透层由以下材料形成或包含以下材料，该材料选自改性聚硅氧烷基弹性体包括聚二甲硅氧烷(PDMS)基弹性体、乙烯-丙烯二烯烃(EPDM)基弹性体、聚降冰片烯基弹性体、聚辛烯基弹性体、聚氨酯基弹性体、丁二烯和丁腈橡胶基弹性体、天然橡胶、丁基橡胶基弹性体、氯丁橡胶(Neoprene)基弹性体、环氧氯丙烷弹性体、聚丙烯酸酯弹性体、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)基弹性体、聚醚嵌段酰胺(PEBAX)、聚氨酯弹性体、交联聚醚、聚酰胺、聚苯胺、聚吡咯及它们的混合物。在另一实施方案中，所述膜由无机材料使用本领域技术人员已知的任何技术例如烧结、浙滤或溶胶-凝胶法来制备，所述无机材料例如(作为非限定性的实例)碳化硅、二氧化硅、氧化锆、钛氧化物或沸石。由hopor GmbH(德国)提供的无机膜在本发明中优选供使用。在另一实施方案中，所述膜包含其中分散有粉状固体形式的有机或无机基质的高分子膜，其中所述基质的量多达该高分子膜的20wt%。碳分子筛基质可如美国专利 6，585，802号中描述的经热分解任何适当材料来制备。美国专利6，755，900号中描述的沸石也可作为无机基质使用。可使用金属氧化物例如二氧化钛、氧化锌和二氧化硅，例如可从 Degussa AG(Germany)以其Aerosol和AdNano商标获得的材料。可使用混合的金属氧化物，例如氧化铈、氧化锆和氧化镁的混合物。优选的基质将是直径小于1. O微米的微粒，优选直径小于0. 1微米的微粒，优选直径小于0. 01微米的微粒。第一化合物可通过适当的化学作用被连接至支持体例如聚合物、树状大分子、树模石、超支化聚合物、或无机或有机纳米颗粒上，该支持体作为可溶性分子锚起作用以容许第一化合物在本发明的反应阶段和渗滤阶段期间于溶液中停留，并提供增大的分子体积以增强膜排斥。作为分子锚使用的适宜聚合物包括包含杂原子官能的缩聚基质或聚合基质。这些杂原子官能可包含氧、氮，或可包含超过一个杂原子，例如酰胺基。本发明中使用的聚合物实例包括聚亚烷基二醇，其包括聚乙二醇、聚己酸内酯、用柠檬酸酯化了的聚乙二醇、聚乙二醇和琥珀酸的共聚物、乙烯吡咯烷酮和丙烯酸或b-羟基-丙烯酸乙酯的共聚物； 或丙烯酰胺和醋酸乙烯酯的共聚物。供本发明使用的适宜树状大分子包括聚(酰胺胺) [poly (aminoamine)]，也被称为PAMAM树状大分子；含磷树状大分子；据聚赖氨酸树状大分子；和可具有表面官能团包括-0H、-NH2、-PEG和COOH的聚丙烯亚胺(PPI)树状大分子。纳米微粒可从商业来源获得或经原位合成以提供受控的尺寸，且适宜的纳米微粒可来自Si02、 TiO2或其他有机材料或无机材料。US 3，772，264报道了用于连接氨基酸和肽至分子锚上的适当化学法。Bonora 等人 Bioconjugate Chem.，(1997)第 8 卷 ￠)，第 793-797 页，描述了用于连接核苷酸和寡核苷酸至分子锚上的化学法。Christensen等人J Pept. Sci. (1995) May-Jun5I (3)第175-83页描述用于连接肽核酸至分子锚上的适宜技术。使用本领域技术人员所熟知的技术例如US 3，772，264中报道的那些技术，可以容易完成从支持体上脱除第一化合物。用于肽的偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见 Amino Acid and Peptide Synthesis,2nd Edn, J Jones, Oxford University Press 2002，或 khroder-Lubbke，The Peptides, New York 1967。用于寡核苷酸的偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见P. S. Millar, Bioconjugate Chemistry, (1990)，第 1 卷，第 187-191 页和 CB. Reese Org. Biomol. Chem. (2005)第 3 卷， 第3851-3868页。用于肽核酸偶联反应与脱保护反应的适宜化学法为本领域技术人员所熟知，例如参见 B. Hyrup 与 P. E. Nielsen Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996)，第 4 卷，第1期，第5-23页。术语“有机溶剂”将为一般技术读者所完全理解，包括例如分子量小于300道尔顿的有机液体。应当理解，术语溶剂还包括溶剂的混合物。作为非限定性实例，溶剂包括芳香族化合物、烷烃、酮、二醇、氯化的溶剂、酯、醚、 胺、腈、醛、酚、酰胺、羧酸、醇、呋喃和偶极非质子溶剂，及它们的混合物以及它们与水的混合物。作为非限定性实例，溶剂的具体实例包括甲苯、二甲苯、苯、苯乙烯、苯甲醚、氯苯、 二氯苯、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基醚酮(MEK)、甲基异丁基酮(MIBK)、丙酮、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、己烷、环己烷、二甲氧基乙烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、己二腈、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N，N-二甲基乙酰胺、二噁烷、硝基甲烷、硝基苯、吡啶、二硫化碳、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、乙腈、及它们的混合物以及它们与水的混合物。合成流程与仪器实施例1-3阐明五肽的合成。所使用的流程如图2所示。所采用的仪器如图3所示。该仪器不但用于进行排斥试验，还用于进行合成。偶联步骤与脱保护步骤两者都于大气压力下在反应容器(加料槽)内进行。循环泵使反应溶液通过膜滤芯再循环并自始至终确保良好的液体混合。在每个反应完成时，使用至约对系统加压。透过膜产生的溶剂流通过经HPLC泵从溶剂贮器向反应容器(加料槽)补给的恒定新鲜溶剂(DMF)流来达到平衡。在每一反应/洗涤周期应用相同的程序。让肽在可溶性聚合分子锚上装配以增加膜对其的保留。选择PEG作为高分子支持体。下列缩写在实施例中使用二氯曱烷DCM二异丙基碳化二亚胺DIC二异丙基乙胺DIPEA二曱基甲酰胺DMFΝ-α-Fmoc-L-丙氣酸Fmoc-AlaN-a-Fmoc-二-叔丁氧基羰基-L-精氨酸Fmoc-Arg(Boc)2N-a-Fmoc-L-天冬氨酸β-叔丁酯Fmoc-Asp(OtBu)N-a-Fmoc-N-t-Boc-L-赖氣酸Fmoc-Lys(Boc)N-a-Fmoc-O-叔丁基-L-酪氣酸Fmoc-Tyr(tBu)N-a-Fmoc-L-缴氣酸Fmoc-Val4-羟曱基笨氧基乙酸HMPAN-羟基笨并三唑HOBt
六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷合磷镣
PyBOP乙腈MeCN三乙胺TEA4-二曱基氣基嘧啶DMAP三氯曱烷CHCl3曱醇MeOHN-曱基咪唑NMI乙赕乙酯EtOAC二氯乙酸DCA三氟醋酸吡啶锚PyTFA叔丁基氢过氧化物TBHP实施例1具有Tyr-Ala-Tyr-Ala-Tyr序列的模型肽使用高分子膜经膜增强的肽合成 (MEPS)而制备。选择该序列是为了包含最大的常用受保护氨基酸之一 Fmoc-Tyr (tBu)与最小的受保护疏水性氨基酸之一 Fmoc-Ala。使用化学交联的聚酰亚胺膜(DuraMem ，MET Ltd, UK，其被认为可用描述于PCT/GB2007/050218中的技术制备)进行膜分离步骤。对 MeO-PEG-Inker-肽的排斥对于偶联步骤为 100%，对于脱保护步骤> 99. 7%。甲基化氨基聚乙二醇(MeO-PEG-NHJ的合成
用于制备MeO-PEG-NH2的程序在流程1中说明
权利要求
1.用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法，该方法包括(i)合成所述第一化合物；并(ii)分离步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，其中第一化合物和第二化合物溶解在有机溶剂中，并使用在有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。
2.按照权利要求1的方法，其中第一化合物通过液相合成来合成。
3.按照权利要求2的方法，其中液相是有机溶剂。
4.按照权利要求3的方法，其中所述有机溶剂与用于渗滤的有机溶剂相同。
5.按照权利要求1至4中任一项的方法，其中所述合成涉及一个或更多个偶联反应或脱保护反应。
6.按照任一前述权利要求的方法，其另外包括在分离之后修饰第一化合物。
7.按照权利要求6的方法，其包括在分离之后对第一化合物进行一个或更多个偶联反应和/或脱保护反应。
8.按照权利要求6或权利要求7的方法，其另外包括使用如权利要求1的步骤(ii)中所定义的渗滤法来纯化修饰的化合物。
9.按照任一前述权利要求的方法，其中所述膜是高分子膜。
10.按照权利要求1至8中任一项的方法，其中所述膜是陶瓷膜。
11.按照权利要求1至8中任一项的方法，其中所述膜是混合基质有机/无机膜。
12.按照任一前述权利要求的方法，其中第一化合物连接到支持体上。
13.按照权利要求12的方法，其中所述支持体是高分子支持体。
14.按照权利要求13的方法，其中所述支持体包括树状高分子或超支化聚合物。
15.按照权利要求12的方法，其中所述支持体是有机或无机纳米微粒。
16.按照权利要求1的方法，其中第一化合物的分子量大于500道尔顿。
17.滤过膜用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的用途；该方法包括(i)合成第一化合物；(ii)从有机溶剂和第二化合物中分离于步骤(i)中形成的第一化合物，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂，其中第一化合物和第二化合物溶解在有机溶剂中并使用在有机溶剂中稳定的膜通过渗滤法分离，且该膜提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。
18.基本上如本文任一实施例或图中所描述的方法。
全文摘要
按照本发明，提供用于制备选自肽、寡核苷酸和肽核酸的第一化合物的方法。该方法包括合成第一化合物，然后用渗滤法把在步骤(i)中形成的第一化合物与第二化合物分离，该第二化合物是第一化合物合成的反应副产物和/或用于合成第一化合物的过量试剂。用于渗滤法的膜在有机溶剂中稳定并且所提供的对第一化合物的排斥大于对第二化合物的排斥。
文档编号C07H21/00GK102216320SQ200980140616
公开日2011年10月12日 申请日期2009年8月7日 优先权日2008年8月8日
发明者A·G·莱文斯顿, E·W·塔特, L·G·皮瓦, P·R·J·加夫尼, R·J·利瑟巴罗, 瓦斯康切勒斯 R·坎波斯, S·W·J·苏 申请人:帝国创新有限公司