专利名称：半滑舌鳎hepcidin抗菌肽的制作方法
技术领域：
本发明属于抗菌肽筛选技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎hepcidin抗菌肽。
背景技术：
半滑舌鳎(英文名 half-smooth tongue sole,拉丁名 Cynoglossus semilaevis), 是我国近海底层型名贵经济鱼类之一，因其生长速度快，肉味鲜美，深受广大消费者的喜爱。近年来，半滑舌鳎的养殖迅速兴起，其育苗和养殖技术已逐渐成熟且进入了产业化阶段。但随着养殖规模的不断扩大，其病害种类、发病频率及其危害性亦逐年增加，给整个舌鳎养殖业造成了巨大的经济损失。同时海水养殖业中抗生素的大量应用，不但造成水产品中含有过量违禁的抗生素药品，使产品质量下降；而且引起致病菌的抗药性，严重影响到水产业的健康发展。海水养殖品种生活于富含各种微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能，而其中抗菌肽(antimicrobial peptides)作为鱼、虾、贝类等动物非特异性免疫防御系统的重要成分之一，在防御海洋性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。抗菌肽是一类具有很强的广谱抗菌的天然小肽类物质，自1975年Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又陆续在细菌、真菌、植物、无脊椎动物以及脊椎动物中发现了至少900余种抗菌肽。！fepCidin(HEPC，HAMP)是近年来发现的一类由肝脏合成的、富含半胱氨酸的抗菌肽(Verga F，et al, Gene. 205,364 :37_44)，具有广谱杀菌抑菌作用，在体内参与宿主的天然防御。鱼类h印cidin的研究始于2002年，目前已从多种鱼类中分离克隆了该基因，但对于半滑舌鳎抗菌肽的研究仍属于空白阶段。与抗生素不用的是，抗菌肽的靶位点主要是病原体细胞膜，不易产生抗性，对真核细胞几乎没有作用。由于抗菌谱广、杀菌活力高、作用迅速、不产生耐药性等优点，抗菌肽在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物。通过研究海水养殖品种的抗菌肽基因的结构和功能，进而通过基因功能技术在体外进行重组表达，生产具有高效杀菌效果的抗菌肽，并应用于水产养殖业以及各种禽畜动物的饲养中，同时利用基因工程改良出新型抗病性品种，已成为我国水产养殖业和畜牧业的必然选择。鱼类抗菌肽必将在未来新型饲料添加剂、甚至新型抗菌类药物的研发中起到重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半滑舌鳎h印cidin抗菌肽，并可将半滑舌鳎抗菌肽应用于制备抗病菌类产品，以弥补现有技术的不足。本发明从半滑舌鳎cDNA文库中筛选出一条编码半滑舌鳎抗菌肽h印cidin家族成员的EST序列，并结合该EST序列设计特异性引物来扩增半滑舌鳎hepcidin抗菌肽的核苷酸序列，并将h印cidin抗菌肽进行原核表达来验证功能。本发明的一个目的是提供一种半滑舌鳎h印cidin抗菌肽的前体，其序列为SEQ ID NO :2。
本发明的另一个目的是提供一种半滑舌鳎h印cidin抗菌肽，该抗菌肽是a、序列为SEQ ID NO 3的多肽；b、与a中的多肽具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与a中的多肽功能相同或相似。对于b中所述的多肽，可以是与a中的任一条多肽具有75 %同源性(4个氨基酸的不同)、80%以上同源性(3个氨基酸的不同)和90%以上同源性(1个氨基酸的不同)的多肽，该多肽的功能与a中的多肽功能相同或相似。本发明的另一个目的是提供一种多肽片段，包括有序列为SEQ ID NO 3的多肽或其同源性的多肽，该多肽片段与序列为SEQ ID NO :3的抗菌肽功能相同或相似。本发明的另一个目的是提供序列为SEQ ID NO 3的抗菌肽的活性衍生物。本发明还提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸是a、编码序列为SEQ ID NO 3抗菌肽的核苷酸b、编码与a中的多肽具有70%或以上同源性的多肽的核苷酸，所编码的多肽的功能与a中的抗菌肽功能相同或相似；C、与a或b中的多核苷酸互补的多核苷酸。所述的多核苷酸的序列为SEQ ID NO :1。本发明的半滑舌鳎h印cidin抗菌肽的前体肽和成熟肽均可以是通过化学合成、 基因重组表达获得的产物。本发明获得的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin经原核表达后得到的重组蛋白具有明显的抑制金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌生长的作用，相对于其他抗菌肽，本发明的抗菌肽对海洋病原菌的抑制作用更为明显，可应用于水产养殖业。因此，本发明的半滑舌鳎抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、 兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
图1 本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的抑菌作用图。
具体实施例方式下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。一、半滑舌鳎h印cidin抗菌肽序列的确定本发明首先构建半滑舌鳎cDNA文库，从半滑舌鳎混合组织中克隆得到抗菌肽 h印cidin，具体步骤为1、半滑舌鳎cDNA文库的构建及序列分析总RNA的提取和cDNA合成分离半滑舌鳎成鱼各组织，参照invitrogen公司 Trizol抽提试剂说明书进行RNA提取。文库构建采用Clontech公司SmartcDNA Library Construction Kit试剂盒进行逆转录合成第一链，得到10 μ 1 cDNA第一链产物。半滑舌鳎cDNA文库的构建和鉴定取cDNA 1 μ 1用于连接反应，体系10 μ 1，转化其中0.5 μ 1。取200 μ 1转化液涂板，培养过夜。计算单菌落数为每板1012个，重组率约为97%，可获得的cDNA文库克隆数为1. 01 X IO6个。随机挑取24个克隆测序，结果23条有效序列中imigene比例为23/23X 100%= 100%，同时对序列进行全长分析，其中13条全长，完整性比率为13/17X100%= 76. 5%0对半滑舌鳎cDNA文库的克隆进行测序分析，得到1条EST序列编码半滑舌鳎抗菌肽hepcidin前导肽。根据cDNA文库的筛选得到的半滑舌鳎抗菌肽h印cidin序列，设计特异性引物P1， P2(P1 5' -GTTCAGTTGGAGAAAGGTGGA-3‘ ；P2 5' -GTCGTCGCCGCTCAGTATT-3‘)，以半滑舌鳎肾脏总RNA为模板进行扩增，PCR条件为94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s，72°C共30个循环；72°C 7min。扩增得到包括半滑舌鳎抗菌肽h印cidin开放阅读框的片段约470bp，连接转化后以M13(47)和M13(48)为引物进行阳性克隆的鉴定，扩增片段600bp左右，测序确定片段的序列。生物信息学分析显示半滑舌鳎抗菌肽h印cidin cDNA开放阅读框长291bp，预测其编码一个含96个氨基酸残基的前体肽，核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO :1所述，96个氨基酸残基的前体肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所述。进一步分析显示，该前体肽的第1-24位氨基酸残基为其信号肽区域，第80-96位氨基酸残基为其成熟肽，即序列表中 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列。由于半滑舌鳎抗菌肽h印cidin前体肽中信号肽区域和成熟肽区与已经报道的抗菌肽h印cidin家族有明显的相似性，故半滑舌鳎抗菌肽h印cidin 为新的h印cidin家族成员。2、半滑舌鳎抗菌肽h印cidin重组蛋白的抑菌活性检测以原核表达系统诱导表达半滑舌鳎抗菌肽hepcidin成熟肽重组蛋白，具体步骤如下重组质粒的构建与鉴定根据半滑舌鳎抗菌肽h印cidin的成熟肽cDNA序列，利用一对特异引物在其两端分别引入限制性内切酶位点EcoRI和NotI位点，扩增半滑舌鳎抗菌肽的成熟肽，亚克隆进原核表达质粒pET28a，测序确定。将重组表达载体转化进宿主菌BL21(DE3)pLysS，在LB固体培养基平板中培养，筛选工程菌株。挑取工程菌株活化后，以1 50接种于15mL的2XYT培养液中(含30ug/mL的卡那霉素与34ug/mL氯霉素)37°C震荡培养，当0D600约为0. 6时加诱导剂异丙基-β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度ImM，25°C诱导表达20h，菌液经12，OOOrmp离心IOmin收集细胞。称取湿重，按照Ig 10 50mL的比例加入裂解液(Tris-Hcl 50mM,EDTA 20mM,Nacl IOOmM, Triton-100 0.5%)重悬细胞，并超声波破碎细胞，12，OOOrmp，离心IOmin收集裂解上清液。用琼脂孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌悬浮液(0D600 = 0. 2 0. 3)200μ L与55°C的LB固体培养基(或海水培养基2216E)25mL混勻后铺板，待其凝固后，用牛沣杯(直径8mm)打孔，孔中滴加约1. 5uM超声离心后的上清液，37°C培养8-12h，以同体积的PBS做为阴性对照，第2天观察。结果发现抑菌圈出现，说明半滑舌鳎抗菌肽h印cidin重组蛋白对金黄色葡萄球菌、 鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的生长具有抑制作用(图1)。二、半滑舌鳎抗菌肽h印cidin的同源性多肽及活性衍生物本发明还保护与序列为SEQ ID NO 3的半滑舌鳎抗菌肽h印cidin具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与抗菌肽hepcidin功能相同或相似。对于所述的同源性的多肽，可以是与抗菌肽h印cidin具有75%同源性(4个氨基酸的不同)、80%以上同源性(3个氨基酸的不同)和90%以上同源性(1个氨基酸的不同) 的多肽，该多肽的功能与本发明的多肽功能相同或相似。所述的同源性多肽可以用Applied biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪等多肽合成仪器按固相化学技术合成。也可以通过插入目的核苷酸片段的表达载体表达出所需要的多肽。本发明还涉及到包含有半滑舌鳎抗菌肽h印cidin的多肽片段，所述的多肽片段可以是在本发明抗菌肽的N端或C末端连接上的保护性残基所形成的片段，例如在N端连接上的Ser-Gly-Ser(SGS)形成的序列，用琼脂孔穴扩散法检测对金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用，效果同抗菌肽相似。另外，本发明的半滑舌鳎抗菌肽h印cidin，其氨基酸残基上可以进行类似于糖基化的修饰，从而增强抗菌性。
权利要求
1.一种半滑舌鳎h印Cidin抗菌肽的前体多肽，其序列为SEQ ID NO :2。
2.一种半滑舌鳎h印cidin抗菌肽，该抗菌肽是a、序列为SEQID NO 3的多肽b、与a中的序列具有70%或以上同源性的多肽，该多肽的功能与a中的多肽功能相同或相似。
3.如权利要求2所述的抗菌肽，其特征在于上述b的多肽与上述a的多肽具有90%的同源性。
4.一种多肽片段，包括有序列为SEQ ID NO :3的多肽或其同源性的多肽，上述的多肽片段与序列为SEQ ID NO 3的抗菌肽功能相同或相似。
5.一种多肽衍生物，所述的多肽的序列为SEQ ID NO :3。
6.一种多核苷酸，所述的多核苷酸是a、编码序列为SEQID NO 3抗菌肽的核苷酸b、编码与a中的抗菌肽具有70%或以上同源性多肽的核苷酸，所编码的多肽的功能与 a中的抗菌肽功能相同或相似；C、与a或b中的多核苷酸互补的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于所述的多核苷酸的序列为SEQID NO=I0
全文摘要
本发明涉及一种半滑舌鳎hepcidin抗菌肽，该抗菌肽的序列为SEQ IDNO3。本发明的半滑舌鳎hepcidin抗菌肽的前体肽和成熟肽均可以是通过化学合成、基因重组表达获得的产物。本发明获得的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin经原核表达后得到的重组蛋白具有明显的抑制金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌生长的作用，相对于其他抗菌肽，本发明的抗菌肽对海洋病原菌的抑制作用更为明显，可应用于水产养殖业。因此，本发明的半滑舌鳎抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
文档编号C07K14/46GK102219845SQ20111010073
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者于海洋, 刘旭东, 张全启, 王亚楠, 王兴莲, 王志刚, 王旭波, 齐洁 申请人:中国海洋大学