专利名称：从粉防己中分离纯化防己诺林碱和粉防己碱的方法
技术领域：
本发明属于化工领域，具体是涉及一种从中药粉防己中分离纯化防己诺林碱和粉防己碱的方法。
背景技术：
粉防己为防己科千金藤属植物粉防己的块根，是我国常用中草药之一，具祛风除湿、利尿消肿、行气止痛的作用。粉防己的主要活性成分是生物碱，例如粉防己碱、防己诺林碱等。粉防己生物碱，具有抗高血压、抗心肌缺血及再灌注损伤、抗心律失常、抗炎及免疫抑制、抗肿瘤广泛的生理活性作用。现已有文献报道从粉防己中提取纯化生物碱成分的方法。李行诺等[粉防己生物碱化学成分的分离与鉴定，沈阳药科大学学报，2009年06期]采用反复硅胶柱色谱法、 Sephadex LH-20柱色谱法等进行分离纯化，并通过光谱分析鉴定其化学结构。结果分离得粉防己碱、防己诺林碱、2' -N-chloromethyltetrandrine、氧化防己碱、粉防己碱D盐酸盐、荷苞牡丹碱。崔文峰等[一种提取粉防己碱的新方法，天然产物研究与开发，2008年 04期]将粉防己根粉用0. 6%稀硫酸渗滤，提取液通过D72树脂柱，然后用氨水乙醇溶液洗脱，丙酮、甲苯结晶纯化得到粉防己碱纯品。近年来也出现了一些有关制备粉防己生物碱单体成分的专利文献。《粉防己生物碱的制备工艺》(中国专利，申请号200710048865. 5)将粉防己粗粉用稀酸水溶液渗滤，渗滤液通过大孔树脂柱吸附，水洗后用含氨/胺的醇溶液洗脱，浓缩得到总生物碱， 通过结晶得高纯度的粉防己生物碱。《一种粉防己碱的提取方法》(中国专利，申请号 201010182776. 1)采用高浓度乙醇加碱提取，酸溶，D72大孔阳离子交换树脂分离，甲苯萃取，丙酮乙醇交替结晶得到粉防己碱产品。上述各种方法或仅能得到单一成分产品，或得到的产品纯度较低，或使用的体系比较复杂，有的生产成本较高，生产规模较小，不能满足市场需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、分离量大，综合成本低，生产周期短的快速从粉防己中分离纯化高纯度防己诺林碱和粉防己碱的方法。本发明从粉防己中分离纯化防己诺林碱和粉防己碱的方法，是以粉防己为原料， 经过下述步骤(1)粗提取物浸膏的制备；(2 )酸溶碱沉预分离；(3 )高速逆流色谱纯化，得纯度在98 %以上的防己诺林碱和粉防己碱。所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加2-20倍量(质量)的 50-95% (质量浓度)乙醇，回流20-120分钟(优选的，加2. 5-18倍量(质量)的52-85% (质量浓度)乙醇，回流40-120分钟)，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加2-10 倍量(质量)的50-95% (质量浓度)乙醇回流2次，每次回流提取20-60分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以10-100倍量(质量) 的0.5-10% (质量浓度)的盐酸溶解，静置2-4 后过滤除去沉淀(优选的，将粉防己粗提取物浸膏以12-90倍量(质量)的0.8-8% (质量浓度)的盐酸溶解，静置10-40h后过滤除去沉淀)，得到溶液；②将上述溶液用氨水调PH至8-10，静置12-4 后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。所述步骤(3)高速逆流色谱纯化以乙醚-磷酸盐缓冲液为溶剂系统，将步骤(2) 得到的粉防己生物碱粗提物用高速逆流色谱法进行纯化，分别收集不同馏分，即得防己诺林碱和粉防己碱。较为优选的方案是所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加 5-15倍量(质量)的55-85% (质量浓度)乙醇，回流60-120分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加5-10倍的55-85%乙醇回流2次，每次回流提取40-60分钟， 离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇， 得粉防己粗提取物浸膏。更优选的方案是所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加8倍量的80%乙醇，回流60分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加6倍的80%乙醇回流2次，每次回流提取40分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。较为优选的方案是所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以 15-75倍量(质量)的1-5% (质量浓度)的盐酸溶解，静置12-3 !后过滤除去沉淀，得到溶液；②将上述溶液用氨水调PH至8-10，静置12-3 后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。更加优选的方案是所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以50倍量(质量)的m (质量浓度)的盐酸溶解，静置24h后过滤除去沉淀，得到溶液； ②将上述溶液用氨水调PH至9，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。前面所述的方法，优选的方案在于所述乙醚-磷酸盐缓冲液为溶剂系统，固定相为乙醚，流动相为PH在6. 0-7. 0之间的磷酸盐缓冲溶液(优选的，所述流动相为pH在 6. 4-6. 7之间的磷酸盐缓冲溶液)，采用单一 pH值缓冲溶液洗脱或采用不同pH缓冲溶液梯度洗脱。本发明的方法与现有粉防己生物碱成分的方法相比，具有如下优势
(1)本发明以乙醇提取粉防己药材中的生物碱，以大酸溶碱沉预分离，以高速逆流色谱进行纯化，工艺过程绿色环保，对环境无严重危害。(2)本发明操作简单，分离纯化的工艺周期短，节省试剂，洗脱剂可回收重复利用， 降低了生产成本，所制备的防己诺林碱和粉防己碱纯度高，经HPLC分析达98%以上，可作为对照品使用。(3)本发明酸溶碱沉预分离的方法除去了大量非生物碱杂质，大大提高了后续的分离效率。(4)防己诺林碱和粉防己碱具有不同的碱性和极性，本发明通过改变溶液的pH值来改变它们的存在形态，从而调整防己诺林碱和粉防己碱在有机溶剂中的分配，实现二者的分离。利用PH梯度洗脱，可以保证有更好的分离效果，同时还可以缩短分离时间。
4
(5)本发明采用单一有机溶剂与无机盐缓冲溶液组成高速逆流色谱的溶剂系统进行防己诺林碱和粉防己碱的分离纯化，有机溶剂易于回收，成本低，对环境无不利影响。
图1是实施例6经酸溶碱沉预分离后得到的粉防己提取物的高效液相色谱图。图2是实施例6采用乙醚为固定相，用pH=6. 7的磷酸盐缓冲液和pH=6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱时的高速逆流色谱分离纯化粉防己提取物的高速逆流色谱图。图3是实施例6分离纯化得到的防己诺林碱的高效液相色谱图。图4是实施例6分离纯化得到的粉防己碱的高效液相色谱图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用乙醚购自天津试剂四厂，磷酸盐缓冲液采用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(购自天津试剂四厂)配制。本发明从粉防己中分离纯化防己诺林碱和粉防己碱的方法，是以粉防己为原料， 经过下述步骤(1)粗提取物浸膏的制备；(2 )酸溶碱沉预分离；(3 )高速逆流色谱纯化，得纯度在98 %以上的防己诺林碱和粉防己碱。实施例1
取粉碎好的粉防己药材100g，加人0. 5L 50%的乙醇，加热回流100分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加0. 5L 50%乙醇回流2次，每次回流60分钟，分离残渣和提取液；合并上述 3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. 2L的0. 5%的盐酸溶解，静置3 后过滤除去沉淀，得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至8，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 5的磷酸盐缓冲液。根据色谱图收集相应峰组分，调pH 为9.0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为98. 1%，粉防己碱纯度为99. 3%。实施例2
取粉碎好的粉防己药材100g，加人2L 55%的乙醇，加热回流90分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加IL 55%乙醇回流2次，每次回流50分钟，分离残渣和提取液；合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己碱粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. 16L的1. 0%的盐酸溶解，静置3 后过滤除去沉淀， 得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至10，静置3 后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 6的磷酸盐缓冲液。根据色谱图收集相应峰组分，调pH 为9.0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为98. 2%，粉防己碱纯度为98. 11实施例3:
取粉碎好的粉防己药材100g，加人0. 5L 60%的乙醇，加热回流80分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加0. 5L 60%乙醇回流2次，每次回流50分钟，分离残渣和提取液；合并上述 3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己碱粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. 08L的4. 0%的盐酸溶解，静置1 后过滤除去沉淀， 得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至8，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 7的磷酸盐缓冲液。根据色谱图收集相应峰组分，调pH 为9. 0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为98. 1%，粉防己碱纯度为98. 9%。实施例4
取粉碎好的粉防己药材100g，加人IL 75%的乙醇，加热回流70分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加0. 6L 75%乙醇回流2次，每次回流45分钟，分离残渣和提取液；合并上述3 次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己碱粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. 06L的5. 0%的盐酸溶解，静置1 后过滤除去沉淀， 得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至10，静置3 后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 8的磷酸盐缓冲液。根据色谱图收集相应峰组分，调pH 为9. 0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为99. 1%，粉防己碱纯度为98. 4%。实施例5
取粉碎好的粉防己药材100g，加人1. 5L 95%的乙醇，加热回流45分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加1. 5L乙醇回流2次，每次回流30分钟，分离残渣和提取液；合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. 05L的6%的盐酸溶解，静置3 后过滤除去沉淀，得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至8，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 7的磷酸盐缓冲液和pH=6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，由100% pH=6. 7的磷酸盐缓冲液在IOOmin内变为100%的pH=6. 4的磷酸盐缓冲液。根据色谱图收集相应峰组分，调PH为9. 0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为99. 0%，粉防己碱纯度为98. 9%。
实施例6
取粉碎好的粉防己药材100g，加人0.8L 80%的乙醇，加热回流60分钟，分离残渣和提取液；将残渣再加0. 6L 80%乙醇回流2次，每次回流40分钟，分离残渣和提取液；合并上述 3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。将粉防己粗提取物浸膏以0. IL的2. 0%的盐酸溶解，静置24h后过滤除去沉淀，得到溶液；将上述溶液用氨水调PH至9，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。图1是经酸溶碱沉预分离后得到的粉防己提取物浸膏的高效液相色谱图。由图1可以看出粉防己提取物经过酸溶碱沉预分离纯化后，提取物主要成分为防己诺林碱和粉防己碱。采用乙醚-磷酸盐缓冲液为高速逆流色谱两相溶剂系统分离纯化粉防己提取物， 固定相为乙醚，流动相为含PH=6. 7的磷酸盐缓冲液和pH=6. 4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，开始用PH=6. 7的磷酸盐缓冲液为流动相洗脱，SOmin后改为pH=6. 4的磷酸盐缓冲液为流动相洗脱。图2是进行梯度洗脱时的高速逆流色谱分离纯化粉防己提取物的高速逆流色谱图。由图2可以看出在高速逆流色谱分离纯化过程中，提取物中的各个组分能在250分钟内实现峰底完全分离，分离效果良好。收集相应峰组分，调pH为9.0，用乙醚萃取，回收乙醚，即可得到相应高纯度化合物。经1H-NMR和13C-NMR鉴定，所得单体化合物分别为防己诺林碱和粉防己碱。图3是分离纯化得到的防己诺林碱的高效液相色谱图。图4是分离纯化得到的粉防己碱的高效液相色谱图。由图3和图4可以看出所得到的各个组分的纯度很高。经色谱面积归一化法计算，防己诺林碱的纯度为98.6%，粉防己碱纯度为 99.洲。经现代波谱数据证实所提取纯化得到的防己诺林碱和粉防己碱结构式如下
权利要求
1.从粉防己中分离纯化防己诺林碱和粉防己碱的方法，其特征是，以粉防己为原料，经过下述步骤(1)粗提取物浸膏的制备；(2 )酸溶碱沉预分离；(3 )高速逆流色谱纯化，得纯度在98 %以上的防己诺林碱和粉防己碱；所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加2-20倍量的50-95%乙醇，回流20-120分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加2-10倍量的 50-95%乙醇回流2次，每次回流提取20-60分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏；所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以10-100倍量的0. 5-10%的盐酸溶解，静置2-4 后过滤除去沉淀，得到溶液；②将上述溶液用氨水调pH至8-10，静置 12-48h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物；所述步骤(3 )高速逆流色谱纯化以乙醚-磷酸盐缓冲液为溶剂系统，将步骤(2 )得到的粉防己生物碱粗提物用高速逆流色谱法进行纯化，分别收集不同馏分，即得防己诺林碱和粉防己碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加5-15倍量的55-85%乙醇，回流60-120分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加5-10倍量的55-85%乙醇回流2次，每次回流提取40-60分钟， 离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇， 得粉防己粗提取物浸膏。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(1)粗提取物浸膏的制备①将粉碎好的粉防己，加8倍量的80%乙醇，回流60分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；②将上述残渣再加6倍量的80%乙醇回流2次，每次回流提取40分钟，离心或过滤分离，得残渣和提取液；③合并上述3次回流所得提取液，减压蒸馏回收乙醇，得粉防己粗提取物浸膏。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以15-75倍量的1-5%的盐酸溶解，静置12-3 后过滤除去沉淀，得到溶液； ②将上述溶液用氨水调PH至8-10，静置12-3 后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述步骤(2)酸溶碱沉预分离①将粉防己粗提取物浸膏以50倍量的m的盐酸溶解，静置24h后过滤除去沉淀，得到溶液；②将上述溶液用氨水调PH至9，静置24h后过滤得沉淀，将沉淀晾干，即得粉防己生物碱粗提物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述乙醚-磷酸盐缓冲液溶剂系统是固定相为乙醚，流动相为PH在6. 0-7. 0之间的磷酸盐缓冲溶液，采用单一 pH值缓冲溶液洗脱或采用不同PH缓冲溶液梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是所述流动相为pH在6.4-6. 7之间的磷酸盐缓冲溶液。
全文摘要
本发明涉及从粉防己中提取防己诺林碱和粉防己碱的方法，是以粉防己为原料，经过下述步骤(1)粗提取物浸膏的制备；(2)酸溶碱沉预分离；(3)高速逆流色谱纯化，得纯度在98℅以上的防己诺林碱和粉防己碱。本发明以乙醇提取粉防己药材中的生物碱，以酸溶碱沉预分离，以高速逆流色谱进行纯化，工艺过程绿色环保，对环境无严重危害。
文档编号C07D491/18GK102285994SQ20111025092
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者孙爱玲, 李霞, 柳仁民 申请人:聊城大学