专利名称：从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法。
背景技术：
藻类中的藻蓝蛋白作为蛋白存储单位，具有明显的抗氧化、抗炎症、增强机体免疫能力作用，抗辐射等活性。藻蓝蛋白分离纯化后，成为高度荧光性的蛋白质，可作为荧光探针等生物医药制剂。现有的藻蓝蛋白的分离纯化工艺主要包括沉淀、离心、透析、层析等过程，这一系列的方法开展困难且昂贵，并且得到的纯度也不高，只适用于实验室制备藻蓝蛋白。Ganapathi Patil报道了一种纯化C-藻蓝蛋白简单有效的新方法,其中包括双 水相萃取和离子交换色谱两个步骤。使用高压均质法提取粗蛋白，经过高速离心后取上清液，在双水相萃取中，使用聚合体-无机盐体系，聚合度4000的聚乙二醇和磷酸钾溶液作为两相，体积比为0.8，在pH6.0的条件下使得纯度为I. 18的粗提液，经过一次萃取后纯度上升到了 3. 52，而经过3次萃取后纯度达到了 4. 05 (Ganapathi Patil，K. S. M. S.Raghavarao. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin [J]
.Biochemical Engineering Journal ,2007,34:156 - 164.)。Ruperto Bermejo等使用阴离子表面活性剂Aerosol 0T(丁二酸_2_乙基己基酯磺酸钠，简称A0T)通过荧光光谱研究C-藻蓝蛋白在水/AOT/异辛烷的溶解特性。结果显示，当WtlM(Fc)时C-藻蓝蛋白溶解于反胶团中。制得的溶解于非极性溶剂中的藻蓝蛋白可以替代合成燃料用于食品和化妆品中(Ruperto Bermejo, Eva M. Talavera, Carmen delValle,et al. C-phycocyanin incorporated into reverse micelles: a fluorescence study[J] . Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2000，18 :51 - 59.)。刘杨研究了 CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)/正戊醇-正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的性能。结果表明0. 04 mo I/L CTAB/正戊醇-正辛烷(体积比1:4)的反胶团体系用于萃取PH7.0，包含0. I mol/L KCl的螺旋藻细胞破碎液，藻蓝蛋白萃取率可达96. 3%;采用pH5. 0，包含2 mol/L KBr的反萃液反萃取藻蓝蛋白，反萃取率可达90. 6%(刘杨，王雪青，庞广昌.反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白[J].天津科技大学学报，2008，6 (2) :30-33.)。Pertti J. Viskari等人利用3% 3_[3_ (胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸(Chaps)和0. 3%氮成穴大豆蛋白提取藻胆蛋白，提取率达到85%以上，并且提取全过程在3小时内完成，其产物经过毛细管电泳激光诱导荧光检测，得到了很好的效果(Pertti J.Viskari,Christa L. Colyer. Rapid extraction of phycobiliproteins from culturedcyanobacteria samples [J] . Analytical Biochemistry, 2003, 319 :263 - 271.X张厚森通过实验室自制羟基磷灰石色谱柱对藻蓝蛋白进行吸附，并通过梯度洗脱和透析脱盐，得到了纯度为2. 83的藻蓝蛋白。而经过两次HA柱的藻蓝蛋白纯度达到4. 21，总回收率为38. 1% (张厚森.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取分离及稳定性研究[D].江苏江苏大学，2005.)。以上分离制备方法存在缺陷ー则可能产生较多的非食用的添加物质；ニ则分离纯化过程中样品的损失也较大，造成产量过低；另外大量的溶剂洗脱和多级柱分离，使分离成本大幅度提高，难以实现规模化生产。
发明内容
为了克服现有技术提取藻类藻蓝蛋白产量低、成本高的不足，本发明提供了ー种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法。本发明采取的技术方案如下 ー种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，所述方法的步骤包括在低温下采用超声波辅助提取技术处理藻类植物，以蛋白提取缓冲溶液提取藻类蛋白，得到粗提液；然后将粗提液PH调至酸性，静置、清液离心，取上清液调节pH至中性；或将粗提液pH调至酸性、静置后膜过滤，得滤液；经过羟基磷灰石柱层析，流动相为蛋白提取缓冲溶液，收集藻蓝蛋白洗脱峰，再喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。所述在低温下采用超声波辅助提取技术处理藻类植物的温度条件为0°C -40°c。所述超声波辅助提取技术的条件为超声功率为50W-200 W，提取时间为5_30min。所述超声宜工作时间4 s，间隔时间2 s。所述蛋白提取缓冲溶液为O. 05、. 15 mol/L、pH为6. 0-8. O的磷酸盐、醋酸盐或乳
酸盐缓冲溶液。所述将粗提液pH调至酸性，其中酸性pH为3. 5-6. 0，采用的酸度调节剂为药用级盐酸。所述清液离心采用低温离心，温度为4_6°C，离心カ为8000_12000Xg。所述膜过滤采用的膜的孔径大小为O. 20 μ m_0. 45 μ m。所述藻类植物为螺旋藻。本发明在传统的蛋白质分离基础上，通过添加食品添加剂级的缓冲液和酸度调节齐U，采用酸性PH缓冲液沉降杂蛋白和羟基磷灰石色谱柱柱层析法洗脱目的蛋白的技木，首次得到藻蓝蛋白纯度A62(i/A28(i > 2. 0，藻蓝蛋白回收率为25%以上的藻类色素蛋白复合物。这样不仅可以使产品达到药用级藻蓝蛋白的纯度，而且具有食用安全性，并且省略了复杂、繁琐的多级柱层析的分离步骤，节约了生产成本。本发明方法中的藻蓝蛋白提取方式得到的产品纯度高，大大简化了分离步骤，操作简单，降低成本，藻蓝蛋白的性质稳定。
具体实施例方式实施例I
选取磷酸氢ニ钠-柠檬酸钠、磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钠、磷酸氢ニ钠-柠檬酸、磷酸氢ニ钠-磷酸ニ氢钾等磷酸盐缓冲体系，制成PH7. O以及浓度为O. 15 mo I/L的缓冲液。称取新鲜螺旋藻10. O g，分别加入100 mL缓冲液，使用200 w功率超声破碎5 min，工作时间4s，间隔时间2 S。处理后的料液在5°C低温条件下高速离心10 min后吸取上清液，使用药用级HCl溶液调节提取液至pH3. 5—4. 5，静置I h后，再高速离心10 min吸取上清液。离心后的沉淀中加入1/4上清液体积的缓冲液中充分溶解，离心后收集上清液，和原上清液合并，得到的溶液进行喷雾干燥，干燥粉冷藏储存。将摩尔浓度为0. 5 mol/L的CaCl2溶液和Na2HPO4溶液用恒流泵以10 mL/min的相同流速混合进烧杯中，并低速搅拌，保证沉淀能够悬浮在溶液中，不宜过快，静置沉淀后倒出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤4次。将沉淀加入蒸馏水后，缓慢滴加25 mL浓度为40%的NaOH溶液，加热至沸腾并保持沸腾I h，静置沉淀后弃去上清液，反复4次。加入缓冲溶液1000 mL，加热煮沸后静置，取沉淀，蒸馏水洗涤4次后，取沉淀物冷却至室温，4 1下保存，制备羟基磷灰石层析柱，装填后在线性流速23 cm/h下，用缓冲液平衡过夜。并使用缓冲液作为流动相，测定不同时间的洗脱峰在A62tl下的吸光值，洗脱液使用部分收集器收集A62tl出峰的藻蓝蛋白，最后喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。干燥粉的藻蓝蛋白纯度A62tZA28tl >2.0，藻蓝蛋白回收率达到25%以上。实施例2
选取醋酸盐缓冲体系，配制成PH6.0以及浓度为0. 10 mol/L的缓冲液。称取新鲜螺 旋藻10. 0 g，分别加入10 mL缓冲液，使用50 w功率超声破碎30 min，工作时间4 s,间隔时间2 S。处理后的料液在4°C低温条件下高速离心10 min后吸取上清液，使用药用级HCl溶液调节提取液至PH5. 5-6. 0，静置I h后，采用膜孔径大小为0. 45 y m的滤膜过滤，得到的溶液进行喷雾干燥，干燥粉冷藏储存。将摩尔浓度为0. 5 mol/L的CaCl2溶液和Na2HPO4溶液用恒流泵以10 mL/min的相同流速混合进烧杯中，并低速搅拌，保证沉淀能够悬浮在溶液中，不宜过快，静置沉淀后倒出上清液，沉淀用蒸馏水洗涤4次。将沉淀加入蒸馏水后，缓慢滴加25 mL浓度为40%的NaOH溶液，加热至沸腾并保持沸腾I h，静置沉淀后弃去上清液，反复4次。加入缓冲溶液1000 mL，加热煮沸后静置，取沉淀，蒸馏水洗涤4次后，取沉淀物冷却至室温，4 1下保存，制备羟基磷灰石层析柱，装填后在线性流速23 cm/h下，用缓冲液平衡过夜。并使用缓冲液作为流动相，测定不同时间的洗脱峰在A62tl下的吸光值，洗脱液使用部分收集器收集A62tl出峰的藻蓝蛋白，最后喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。干燥粉的藻蓝蛋白纯度A62tZA28tl >2.0，藻蓝蛋白回收率达到25%以上。实施例3
选取乳酸盐缓冲体系，配制成pH8. 0以及浓度为0. 05 mol/L的缓冲液。称取新鲜螺旋藻10. 0 g，分别加入100 mL缓冲液，使用100 w功率超声破碎20 min，工作时间4 S，间隔时间2 S。处理后的料液在6°C低温条件下高速离心10 min后吸取上清液，使用药用级HCl溶液调节提取液至PH4. 5-5. 5，静置I h后，采用膜孔径大小为0. 20 的滤膜过滤，得到的溶液进行喷雾干燥，干燥粉冷藏储存。制备羟基磷灰石层析柱，装填后在线性流速23 cm/h下，用缓冲液平衡过夜。并使用缓冲液作为流动相，测定不同时间的洗脱峰在A62tl下的吸光值，洗脱液使用部分收集器收集怂2(|出峰的藻蓝蛋白，最后喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。干燥粉的藻蓝蛋白纯度A62tl/A280 > 2. 0，藻蓝蛋白回收率达到25%以上。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
1.一种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述方法的步骤包括在低温下采用超声波辅助提取技术处理藻类植物，以蛋白提取缓冲溶液提取藻类蛋白，得到粗提液；然后将粗提液PH调至酸性，静置、清液离心，取上清液调节pH至中性；或将粗提液PH调至酸性、静置后膜过滤，得滤液；经过羟基磷灰石柱层析，流动相为蛋白提取缓冲溶液，收集藻蓝蛋白洗脱峰，再喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。
2.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述在低温下采用超声波辅助提取技术处理藻类植物的温度条件为0°C _40°C。
3.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述超声波辅助提取技术的条件为超声功率为50W-200 W，提取时间为5-30 min。
4.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述蛋白提取缓冲溶液为0. 05 0. 15 mol/L、pH为6. 0-8. 0的磷酸盐、醋酸盐或乳酸盐缓冲溶液。
5.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述将粗提液PH调至酸性，其中酸性pH为3. 5-6. 0，采用的酸度调节剂为药用级盐酸。
6.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述清液离心采用低温离心，温度为4-6°C，离心力为8000-12000 X g。
7.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述膜过滤采用的膜的孔径大小为0. 20 V- m-0. 45 u m。
8.根据权利要求I所述的从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法，其特征在于所述藻类植物为螺旋藻。
全文摘要
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法。所述方法的步骤包括在低温下采用超声波辅助提取技术处理藻类植物，以蛋白提取缓冲溶液提取藻类蛋白，得到粗提液；然后将粗提液pH调至酸性，静置、清液离心，取上清液调节pH至中性；或将粗提液pH调至酸性、静置后膜过滤，得滤液；经过羟基磷灰石柱层析，流动相为蛋白提取缓冲溶液，收集藻蓝蛋白洗脱峰，再喷雾干燥，得到药用级藻蓝蛋白。本发明克服现有技术提取藻类藻蓝蛋白产量低、成本高的不足，首次得到藻蓝蛋白纯度A620/A280>2.0，藻蓝蛋白回收率为25%以上的藻类色素蛋白复合物，大大简化了分离步骤，操作简单，降低成本，藻蓝蛋白的性质稳定。
文档编号C07K1/34GK102731644SQ20121024690
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者傅红, 闫岩 申请人:福州大学