Jaz5A用于提高植物耐旱性的用途

Jaz5A用于提高植物耐旱性的用途
【专利摘要】本发明提供了植物基因JAZ5a用于提高植物耐旱性的用途。进一步提供了用于提高植物耐旱性的方法，其包括增强所述植物中Jaz5A的表达或活性。
【专利说明】Jaz5A用于提高植物耐旱性的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术与植物学领域。本发明涉及一种提高植物耐旱性的新方法。本发明涉及在所述植物中使用蛋白以提高其耐旱性。本发明涉及增强所述蛋白的表达或活性，由此相对于未被修饰以增强该蛋白的表达的植物而言，为植物提供了提高的耐旱性。
【背景技术】
[0002]白菜类蔬菜主要包括结球类大白菜(Brassica campestris L.ssp.Pekinensis,简称大白菜)和不结球类小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis,简称小白菜)。小白菜也称作青菜，并在中国北方被称为小油菜(baby Brassica campestris L.ssp.chinensis)。小白菜适应性强，生长快，产量高，营养好。其消费量居各类蔬菜之首，是中国长江流域各省普遍栽培的蔬菜。小白菜种类和品种繁多。白菜类蔬菜生长期短，适应性广，且产量高。它们容易种植，可常年持续供应。
[0003]小白菜产品鲜嫩、营养丰富，为广大消费者所喜爱。小白菜年产量占国内蔬菜总产量的约30-40%，也对补充蔬菜淡季、实现全年均衡供应贡献很大。大白菜与小白菜特性都喜凉性，一年四季均可种植。最适生长温度为15-20°C。近年来，为了适应市场需要，白菜类蔬菜主要通过集约栽培技术种植。为确保一年四季的均衡生产和供应，通常不同季节需采用不同方式种植小白菜。以往主要在春冬季种植小白菜。现在人们开始在炎热的夏季和秋季采取各种栽培方式种植小白菜。这无疑使其生长期内，尤其在春末、夏季和早秋，经受干旱的胁迫。
[0004]高温季节栽培的小白菜可在栽培20天后成批上市。然而，高温往往会使小白菜植株节间拉长、生长缓慢、味苦、不期望的纤维含量的增加等。这将导致产量低、品质差。结果，价格上涨，供不应求。无法满足消费者的需求。大白菜的耐旱性差。它在莲座期和结球期(heading stage)对干旱非常敏感。若平均温度过高，心叶就不能抱合(amplexate)以形成紧实的球茎(bulb)，或者完全不能结球。即使勉强结球，结球(heading)也比较松散。夏季田间自然条件下，耐旱性植物的生产依赖于其形成正常叶球(leafy head)的能力。田间自然高温条件下的结球能力成为大白菜耐旱性的指标。
[0005]大白菜和小白菜原产于中国。在国外，对白菜类蔬菜的育种的研究较少。源自日本、韩国和台湾的品种耐旱性差，不适于在中国种植。国内的品种主要为秋季种植的抗病品种。白菜类蔬菜耐旱的基因库窄。由于耐旱白菜品种的选育限于在白菜材料之间筛选，因此仅选出一些耐旱性差、抗逆性低的品种。
[0006]为解决这些问题，国内育种专家采用传统的育种方法，广泛筛选与栽培耐旱白菜类蔬菜品种，引入耐旱基因，并扩大探索的来源，其一定程度上改善了白菜类蔬菜的耐旱能力并在实际生产中产生了效果。然而，现有的方法限于在当地气候下的耐旱性评价以及高温胁迫下的形态学变化。这些方法并不适于温带地区，其无法提供具有适宜的选择胁迫(stress)的田间条件。即使选出耐旱性单株，要将耐旱性保持到第二年春采集的种子中，需要一系列复杂的方法和手段。筛选需要长的周期，并且受到地域性限制，无法使耐旱品种具有普遍适应性。因此，在白菜类蔬菜耐旱育种中，迫切需要深入研究白菜类蔬菜苗期干旱损害的发生与发展，并开发易于操作、稳定性好、高效并且适应性广的苗期耐旱性筛选方法和技术。与白菜类蔬菜耐旱性密切相关的特征为数量性状，这使得基因型分型非常困难。尤其对于分子育种来说，这些困难不仅表现在有利于辅助选择的DNA标记的数量有限，而且数量性状位点(QTL)的数量和意义不一致。因此，由于白菜类蔬菜基因组测序尚未完成，并且功能基因组的研究正获得越来越多的关注，因此需要有助于白菜类蔬菜耐旱育种研究的快速、敏感、高效的定性分析技术和定量分析技术，其中对于植物的各种性状和DNA基因图进行定性分析，并且对于植物表型和基因表达变化进行定量分析。
[0007]现有技术需要鉴定植物耐旱性基因的方法。
[0008]发明概述
[0009]本发明的目的在于为植物提供耐旱性。例如，与不具有(提高的)耐旱性的植物相比，具有耐旱性的植物或具有提高的耐旱性的植物能够在植物经受一段或多段旱期时，获得更高的作物产量和/或植物产品。已发现，当增强JAZ5a基因在植物中的表达时，该植物可具有(提高的)耐旱性。因此本发明提供了 JAZ5a基因在提供(提高的)耐旱性中的应用。基于本文公开的内容，本发明的其他方面对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1示出了从MDOD起的凋萎症状，根据植株表现出的凋萎症状，每日给予0-4之间的分数(Y轴)。凋萎症状表示为:0，无症状；1，非常轻微地丧失膨胀；2，丧失膨胀；3，严重丧失膨胀；4，推定死亡。红色星号代表突变植株和野生型植株之间的凋萎分数的统计学差异(T检验，α〈0.05)。 图例中的黑色星号代表株系的杂合度。每幅图表代表单个托盘(individual tray)。
[0011]图2示出了将野生型植株与35:BcpJAZ5a植株相比，在19D0D或20D0D补充水分一周后典型的补水效果。很明显，35:BcpJAZ5a植株比野生型植株表现更好。
[0012]定义
[0013]在以下的描述和实施例中使用了一些术语。为了对包括这些术语的范围的说明书、权利要求书更清楚和一致地理解，给出以下定义。除非本文另有限定，使用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的全部公开内容均并入本文作为参考。
[0014]实施本发明的方法中所使用的常规技术的方法对技术人员来说是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域中的常规技术的操作对于本领域技术人员是公知的，它们讨论于以下参考文献中，例如:分子克隆(Sambrook et al., Molecular Cloning.A LaboratoryManual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，1989);现代分子生物学实验指南(Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley&Sons, New York，1987);和酶学方法系列(the series Methods inEnzymologyj Academic Press,San Diego)。
[0015]本申请文件和权利要求书中，动词“包括”与其词形变化是以其非限制性含义来使用的，这意味着该词语后的项是包含在内的，但也不排除未提及的条目。本文使用的术语“包括”、“具有”或“包含”包括“包括”、“基本上由……构成”、“主要由……构成”和“由……构成”。“基本上由……构成”、“主要由……构成”和“由……构成”是上位术语“包括”、“具有”和“包含”的下位概念。
[0016]除非内容里清楚地指明，本文使用的单数形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“该(the) ”包括复数的指代。例如，如上面所用，一种分离“一个” DNA分子的方法包括分离多个分子(例如10个，100个、1000个、10000个、十万个、百万个或更多的分子)。
[0017]术语“多核苷酸”、“核酸分子”或“核酸序列”是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，具体是指编码本发明的蛋白质的DNA。“分离的核酸序列”是指不再位于从其中分离的自然环境中的核酸序列，如在细菌宿主细胞中或在植物的核基因组或质体基因组中的核酸序列。例如活体细胞中的处于自然状态下的多核苷酸和多肽是未分离的或未纯化的。然而，将同样的多核苷酸或多肽从与其共存于所述自然状态下的其他物质中分离出来时，其被称作“分离的”和/或“纯化的”。
[0018]比对(aligning)和比对(alignment):术语“比对(aligning)”和“比对(alignment) ”是指在相同或相似核苷酸的短或长区段(stretches)的存在下，比较两个或多个核苷酸序列。本领域中已知几种核苷酸序列的比对方法，在下文中进一步详述。[0019]“基因表达”所指的过程是可操作地连接于合适的调控区、具体是启动子的DNA区被转录成有生物活性的RNA，例如其能够翻译成生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。某些实施方案中的活性蛋白是指组成型活性蛋白。编码序列优选地为正义方向并且编码所需的生物活性蛋白或肽或活性肽片段。
[0020]与蛋白(或者变体如直系同源物或突变体，以及片段)相关的“功能性(functional) ”是指基因和/或编码蛋白影响植物的定量和/或定性特征的能力。通过改变基因的表达水平(例如通过增强表达或降低表达)可影响植物的定量和/或定性特征。例如当蛋白具有耐旱功能时，增强基因的表达可导致耐旱性。测试对于非生物胁迫如干旱的功能性，对本领域技术人员来说是没有困难的。
[0021]术语“基因”意为包含在细胞中被转录成RNA分子(例如mRNA)的区域(转录区)的DNA序列，其可操作地连接合适的调控区(例如启动子)。因此，基因可包含几个可操作连接的序列，例如启动子、包含如参与翻译起始的序列的5’前导序列、(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。“嵌合基因”(或重组基因)是指在自然界物种中正常不会存在的任何基因，具体是其中存在有核酸序列的一个或多个部分的基因，该核酸序列的一个或多个部分在自然界中彼此相互没有关联。例如，自然界中启动子与部分或全部的转录区或者另一调控区没有关联。术语“嵌合基因”应理解为包括表达构建体，其中启动子或转录调控序列可操作地连接至一个或多个编码序列或反义序列(正义链的反向互补序列)或反向重复序列(正义和反义，由此RNA转录物通过转录形成双链RNA)。
[0022]“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的测量。通常，将序列进行比对，从而获得最高阶的匹配(the highest order match)。“同一性”本身具有本领域公认的含义，并可以使用已公开的技术来计算。参见例如:计算分子生物学(COMPUTATIONALMOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.Μ., ed., Oxford University Press, New York, 1988);生物计算:信息学与基因组项目(B10C0MPUTING:1NFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.ff., ed., Academic Press, New York, 1993);序列数据的计算分析(COMPUTER ANALYSISOF SEQUENCE DATA, PART I1Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, NewJersey, 1994);分子生物学中的序列分析(SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULARBIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987);以及序列分析入门(SEQUENCE ANALYSISPRIMER; Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) ? 尽管存在多种方法来测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，术语“同一性”是本领域技术人员公知的(CariI1, H., and Lipton, D., SIAM J.Applied Math (1988) 48:1073)。通常用于测定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于，巨型计算机指南(GUIDE TOHUGE COMPUTERS, Martin J.Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994)和应用数学(Cari I Ιο, Η., and Lipton, D., SIAM J.Applied Math (1988) 48:1073)中所公开的那些。确定同一性和相似性的方法可编成计算机程序。用于确定两个序列之间的同一性或相似性的优选的计算机程序包括但不限于，GCS程序包(Devereux, J.，et al., Nucleic Acids Research (1984) 12 (I): 387)，BLASTP，BLASTN, FASTA (Atschul, S.F.et al., J.Molec.Biol.(1990)215:403)。
[0023]作为示例，与某些序列的编码多肽的参照核苷酸序列具有至少例如95% “同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，其意思是对于参照多肽序列的每100个核苷酸，除了多核苷酸序列可包括高达五个点突变以外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可将参照序列中至多5%的核苷酸删除和/或由另一核苷酸替代，和/或可将参照序列中总核苷酸的至多5%的大量核苷酸引入参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置，或者这些末端位置之间的任何位置，既可以单独地穿插在参照序列中的核苷酸之间，又可以以一个或多个连续的组穿插在参照序列内。
[0024]类似地，与SEQ ID NO:1的参照氨基酸序列具有至少例如95% “同一性”的氨基酸序列的多肽，其意思是，对于SEQ ID NO:1的参照氨基酸序列的每100个氨基酸，除了多肽序列可包括至多五个氨基酸的替换以外，多肽的氨基酸序列与参照序列相同。换言之，为了获得具有与参照氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽，可将参照序列中至多5%的氨基酸残基删除或由另一氨基酸替代，或可将参照序列中总氨基酸残基的至多5%的大量氨基酸引入参照序列中。参照序列的这些替换可以发生在参照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置或者这些末端位置之间的任何位置，既可以单独地穿插在参照序列中的残基之间，又可以以一个或多个连续的组穿插在参照序列内。
[0025]根据本发明的核酸可包括嘧啶碱基与嘌呤碱基(分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿P密唳、腺嘌呤和鸟嘌呤)的任何聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger, Principlesof Biochemistry,生物化学原理，793-800 (Worth Pub.1982)其全部内容通过引用并入本文)。本发明预期到任意脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分以及其化学变体，例如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。组合物中的聚合物或寡聚物可以是异源或同源的，可以从天然存在的来源中分离，或者人工或合成产生。另外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，可永久或过渡地以单链或双链形式存在，包括同源双链、异源双链和杂交状态。
[0026]本文所用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸要素在功能关系方面的连接。当核酸被设置成与另一核酸序列有功能关系时，它被“可操作地连接”。例如，启动子，或更确切为转录调控序列，如果它影响编码序列的转录，它就与编码序列“可操作地连接”。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是连续的，并且，当需要连接两个蛋白编码区时，被连接的DNA序列在阅读框内且是连续的，以便产生“嵌合蛋白”。“嵌合蛋白”或“杂合蛋白”是由各种蛋白“结构域”(或基序)组成的蛋白，其无法像这样存在于自然界中，但可以结合从而形成功能蛋白，这显示了结合结构域的功能性。嵌合蛋白也可以是天然存在的两种或多种蛋白的融合蛋白。本文所用的术语“结构域”是指蛋白的具有特定结构或功能的任何(多个)部分或(多个)结构域，其可转移到另一种蛋白，以提供至少具有结构域功能特性的新杂合蛋白。
[0027]“植物”是指整个植物或植物的部分，例如可从植物中获得的细胞、组织或器官(例如花粉、种子、配子、根、叶、花、花芽、花药、果实等)，以及它们中任一种的衍生物和通过自交或杂交来源于该植物的子代。“植物细胞”包括原生质体、配子、悬浮培养物、小孢子、花粉粒等，其既可以是分离的形式，也可以是在组织、器官或生物体内。
[0028]本文所用的术语“启动子”是指功能是控制一个或多个基因转录的核酸片段，位于基因的转录起始位点的转录方向的上游，结构上通过以下位点的存在来鉴定:DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点，阻抑和激活蛋白结合位点，以及本领域技术人员所知的可直接或间接地调节从该启动子转录的量的任何其他核苷酸序列。任选地，本文的术语“启动子”也包括5’UTR区(5’非翻译区)(例如本文的启动子可包括在基因翻译起始密码子的上游(5’ )的一个或多个部分，因为该区域可具有调节转录和/或翻译的作用)。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受生理(例如通过外部施用某些化合物)或者受发育调控的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中有活性。“在植物或植物细胞中有活性的启动子”是指启动子驱动在植物或植物细胞中转录的一般性能力。它并不涉及启动子的时间-空间的活性。
`[0029]术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链构成的分子，与特定的作用模式、大小、三维结构或来源无关。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍然可称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”指不再处于其天然环境中的蛋白质，例如在体外或者重组细菌或植物宿主细胞中。
[0030]“遗传修饰的植物”在本文中是指通过例如引入外源基因或外源基因的额外的拷贝或多个拷贝被转化的植物或植物细胞，所述外源基因或额外的外源基因可以整合到基因组中。由(分离的)多核苷酸序列转化而成的转基因植物细胞以及从其再生的植物细胞和植物都应理解为包括所述(分离的)多核苷酸序列。转基因植物细胞可以指分离的或者组织培养中的植物细胞，或者植物中或者分化的器官或组织中含有的植物细胞，两种可能性都具体包含于本文中。因此，在说明书或权利要求中提到植物细胞时，不仅指培养中分离的细胞或者原生质体，也指任何植物细胞，无论它位于何处，或者存在于何种类型的植物组织或器官中。现有技术已知获得转基因植物细胞和植物的方法，其包括但不限于植物外植体的农杆菌介导转化法、植物外植体的粒子轰击、利用触须技术(whiskers technology)的植物外植体的转化、利用病毒载体的转化、植物原生质体的电穿孔、使用聚乙二醇使DNA被原生质体直接吸收、植物外植体和/或原生质体的微注射。农杆菌介导转化法是将本发明的核酸分子引入植物外植体的优选方法。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)携带有被称为Ti质粒的天然载体，其被工程化以适用于将外源核酸分子引入植物基因组中。为了进行遗传转化，将植物源外植体与农杆菌细胞的悬浮液一起孵育，然后在含仅促进转化细胞生长和再生的筛选剂的介质上进行外植体的栽培。
[0031]本文使用的“分离的植物耐旱蛋白(多肽)”、“提高植物耐旱能力的分离的多肽”、“分离的BccJAZ5a蛋白”或“分离的BccJAZ5a多肽”是指基本上不含可能与所述蛋白天然相关的其它蛋白、脂类、糖类和其它物质的BccJAZ5a蛋白。本领域的技术人员能使用标准的蛋白质纯化技术来纯化BccJAZ5a蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
[0032]发明详述
[0033]本发明的发明人首次从芸薹属植物中分离到一种新的植物耐旱基因，其用于提供植物中提高的耐旱性或抗旱能力。被分离的基因命名为“BccJAZ5a”，基于该基因，可生产耐旱能力提闻的转基因植物。
[0034]本发明涉及通过修饰所述植物中的基因表达来提高植物的耐旱性。上述提高是相对于未引入或不存在这类修饰的植物。这类植物优选来自同样的物种和/或品种。换言之，根据本发明的被修饰的植物相比未修饰的植物，能够在少水、缺水或干旱的条件下更好地生长与存活。
[0035]干旱胁迫，即如上所述的合适用水的供应受到限制的时期，也可以表现为植物自身凋萎的状态，即处于一种状态，其与为植物充分供应水时的状态相比，该状态下植物或其部分具有减小的膨胀。就这点而言，JAZ5a蛋白的表达增强(例如具有增强、阻抑或插入基因)和/或活性增强的被修饰植物，其凋萎程度会小于在同样条件下经受相同时间干旱胁迫的相应未修饰植物。
[0036]限制用水或干旱应理解为一种状况，其中水是或可成为这种条件下生长的非转化或自然生长的植物的生物质累积或作物产量的限制因素。对于根据本发明的方法获得和在所述条件下生长的植物，水可能不是限制因素，或在较小程度上是限制因素。
[0037]本发明的发明人相信通过增强JAZ5a的表达(例如通过增强、阻抑或插入基因)可带来功能JAZ5a蛋白的存在(或提高的存在)，无论是作为高效表达的结果，还是作为提高JAZ5a蛋白的活性/功能性的结果，或二者皆是，并且功能JAZ5a蛋白的存在(或提高的存在)会降低所述植物的对水的需求和/或提高其耐旱能力。
[0038]在一个实施方案中，提供了用于使植物具备耐旱性的蛋白的应用，其中所述蛋白是:
[0039](a)具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的蛋白；或
[0040](b)通过取代、缺失或添加氨基酸序列SEQ ID N0:4的一个或多个残基由(a)的蛋白衍生而来的蛋白，并且其中所述蛋白与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列功能上等同；或
[0041](c)与氨基酸序列SEQ ID NO: 4具有至少60%同一性，且与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。
[0042]在一个实施方案中，所述植物耐旱蛋白与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性。
[0043]在一个实施方案中，植物耐旱蛋白在氨基酸序列SEQ ID No:4中具有1_20个、优选1-10个、更优选1-5个、最优选1-3个残基的取代、缺失或添加。
[0044]在一个实施方案中，所述植物是十字花科植物。在一个实施方案中，所述十字花科植物选自芸薹属(Brassica spp.)植物和鼠耳芥属(Abrabidopsis spp.)植物。在一个实施方案中，所述芸薹属植物是大白菜。
[0045]在一个实施方案中，所述鼠耳芥属植物是拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh)。在一个实施方案中，所述植物耐旱蛋白来源于芸薹属植物，优选来源于小白菜。
[0046]在一个实施方案中，提供了用于使植物具备耐旱性的多核苷酸的应用，其选自由以下构成的组:
[0047]⑴编码所述蛋白的多核苷酸；或
[0048](ii)与(i)的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0049]在一个实施方案中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2所示。在实施方案中，提供了含这种多核苷酸的嵌合基因。在一个实施方案中，提供了包含所述多核苷酸的载体。所述载体可根据所使用的宿主细胞或寄主植物来选择。本领域技术人员能够选择用于特定宿主细胞的合适的载体。
[0050]本领域技术人员清楚基于可获得的核苷酸序列信息，例如所附的序列表，可利用本领域公知的方法来克隆包括本发明的多核苷酸的基因。这些方法包括例如设计代表这些基因的侧翼序列的DNA引物，其中一个在正义方向产生并起始正义链的合成，另一个以反向互补的方式产生，并生成反义链。如聚合酶链反应中使用的那些热稳定DNA聚合酶常用于进行这样的实验 。或者，可化学合成代表基因的DNA序列，随后转入DNA载体分子，其可通过例如相容的细菌如大肠杆菌来进行倍增。
[0051]在一个实施方案中，提供一种遗传工程化的宿主细胞，其含有所述的载体或包含基因组中整合的所述多核苷酸。在一个实施方案中，提供一种植物，其包含任意的前述多核苷酸。
[0052]在一个实施方案中，提供制备前述蛋白的方法，包括:
[0053](a)在适于表达的条件下，培养所述宿主细胞；
[0054](b)从培养物中分离所述蛋白。
[0055]在一个实施方案中，提供前述蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸在用于提供具备(提高的)耐旱性的植物中的用途。在一个实施方案中，该用途是用于提供在抽苔期具备(提高的)耐旱性的植物。
[0056]在一个实施方案中，提供了一种提高植物耐旱能力的方法，其包括增强所述植物中的前述蛋白的表达或活性。在一个实施方案中，所述方法包括将编码前述蛋白的多核苷酸转入到植物基因组中。在一个实施方案中，所述方法包括:
[0057](1)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体含编码本发明的蛋白的多核苷酸；
[0058](2)提供植物细胞、器官或组织；
[0059](3)将步骤⑵的植物细胞、器官或组织与步骤⑴的农杆菌接触，从而使编码本发明的蛋白的多核苷酸转入植物细胞；
[0060](3)任选地，选择出转入编码本发明的蛋白的多核苷酸的植物细胞、器官或组织；
[0061](4)将步骤(3)中的植物细胞、器官或组织再生成植株。[0062]在一个实施方案中，将编码本发明的蛋白的多核苷酸整合到植物细胞的染色体中。
[0063]在一个实施方案中，提供一种遗传修饰的植物，其含有编码本发明的植物耐旱蛋白的多核苷酸。
[0064]在本发明的一个实施方案中，提供一种鉴定植物耐旱性的分子标记，其中所述分子标记含有序列SEQ 10^0:1或2的至少30、35、40、45、50或更多个(连续的)核苷酸。在一个实施方案中，提供一种用于鉴定这种分子标记的方法，所述方法包括对植物细胞的DNA进行测序的步骤。在一个实施方案中，提供一种用于鉴定这种分子标记的方法，包括扩增SEQ ID No:l或2的所述序列和检测扩增子的步骤。在一个实施方案中，提供能够扩增SEQ ID No: 1或2的所述序列的引物对，在进一步的实施方案中，所提供的引物对如SEQ IDNo:5和6所示。
[0065]对可用于本发明的植物没有具体限制，只要该植物可以例如使用基因、嵌合基因或载体进行转化。所述植物包括各种农作物、花卉植物或林业植物等。具体地，所述植物包括但不限于双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述植物包括但不限于:小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、产蓖麻油的植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、梓檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笑、洋白菜(cabbage)、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆(murphy)、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶 、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
[0066]术语“植物”包括但不限于:十字花科、禾本科、蔷薇科植物。例如，所述“植物”包括但不限于:十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物；禾本科的水稻；以及烟草、瓜果、蔬菜、油菜等。更优选地，所述“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。
[0067]本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然来源的纯化产物、化学合成的产物，或者由原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)重组产生的产物。根据重组生产中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽可进一步包括或不包括起始的天然甲硫氨酸残基。
[0068]本发明进一步包括BccJAZ5a蛋白的片段、衍生物和类似物。本文所用的术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指与本发明的BccJAZ5a蛋白的生物功能和/或活性基本相同的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是⑴多肽，其中一个或多个保守型(优选)或非保守型氨基酸残基被基因编码或未经基因编码的一个或多个氨基酸残基取代，或(?)具有一个或多个携带取代基的氨基酸残基的多肽，或(iii)成熟多肽与另一化合物(如用于延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)的融合多肽，或(iv)由额外的氨基酸序列(如前导序列或分泌序列、或促进纯化的序列、或蛋白原序列、或融合蛋白)融合到此多肽序列而形成的多肽。根据本文提供的定义，本领域技术人员应理解这些片段、衍生物和类似物。
[0069]本文所用的术语“BccJAZ5a蛋白”是指基于序列SEQID N0:4为植物提供提高的耐旱性或耐旱能力的多肽。该术语还包括使植物具有(提高的)耐旱性的序列SEQ ID N0:4的变体。突变包括但并不限于:一个或更多个(通常为1-50个，优选为1-30个，更优选为1-20个，最优选为1-10个，进一步优选为1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C-末端和/或N-末端添加或缺失一个或更多个(通常为20个以内，优选为10个以内，更优选为5个以内)氨基酸。例如，应理解用性质相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会影响蛋白质的功能。又比如，在C-末端和/或N-末端添加或缺失一个或更多氨基酸通常不会影响蛋白质的功能。该术语还包括BccJAZ5a蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0070]多肽的变体包括它的同源序列、保守型突变体、等位突变体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格条件下能与BccJAZ5a蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BccJAZ5a蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了更多的相关多肽，如包含BccJAZ5a蛋白或其片段的融合蛋白。除了全长或几乎全长的多肽外，本发明还包括BccJAZ5a蛋白的可溶性片段。通常，该片段包含BccJAZ5a蛋白的至少约20个、通常至少约30个、优选至少约50个、更优选至少约80个、最优选至少约100个连续氨基酸。
[0071]本发明还提供BccJAZ5a蛋白或多肽的类似物。这些类似物在一级序列上与天然BccJAZ5a蛋白不同，或者在沿相同一级序列的修饰形式上不同，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的基因突变体。诱导突变体可通过各种技术获得，例如通过辐射或暴露于诱变剂以产生随机的突变。它们还可通过定点诱变法或一些其他已知的生物学技术获得。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸(如D-氨基酸)的残基的类似物，以及具有非天然的或合成的(多个)氨基酸如氨基酸和氨基酸的类似物。应理解的是，本发明的多肽并不限于以上的代表性实例。
[0072]修饰形式(其不会改变一级结构)包括体内或体外的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还可以是糖基化。修饰还可以是序列中氨基酸残基的磷酸化(如磷酸化的酪氨酸，磷酸化的丝氨酸和磷酸化的苏氨酸)。还包括被修饰成具有提高的抗蛋白水解性或优化了溶解性的多肽。
[0073] 在本发明中，“BccJAZ5a蛋白的保守型突变体”是指在氨基酸序列SEQ ID NO:4中有至多20个，优选为至多10个，更优选为至多5个，最优选为至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。优选地，根据表1示出的以下氨基酸替换来产生这些突变体多肽。
[0074]表1
[0075]
【权利要求】
1.植物来源的分离的耐旱蛋白，其是: (a)具有氨基酸序列SEQID NO:4的蛋白；或 (b)通过取代、缺失或添加氨基酸序列SEQID NO:4的一个或多个氨基酸残基而由(a)的所述蛋白衍生的蛋白，其具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的功能；或 (c)由(a)的所述蛋白衍生的蛋白，其与SEQID NO:4氨基酸序列具有至少60%同一性，且具有与SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列相同的功能。
2.分离的多核苷酸，其选自: (i)编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸；或 (ii)与(i)中的所述多核苷酸互补的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如SEQID ΝΟ:1或2所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的多核苷酸的载体。
5.遗传工程化的宿主细胞，其含有权利要求4所述的载体或含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的遗传工程化的宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到其基因组中。
7.制备权利要求1所述的蛋白的方法，其包括: (a)培养权利要求5或6所述的宿主细胞； (b)表达权利要求1所述的蛋白； (b)分离出权利要求1所述的蛋白。
8.权利要求1所述的蛋白或编码所述蛋白的多核苷酸用于为植物提供提高的耐旱能力的用途。
9.为植物提供提高的耐旱能力的方法，包括提供或增强所述植物中权利要求1所述的蛋白的表达或活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法包括用编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸转化所述植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述多核苷酸并入所述植物的基因组中。
12.根据权利要求10-11所述的方法，包括: (1)提供包含表达载体的农杆菌菌株，所述表达载体含有编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸； (2)提供植物细胞、器官或组织； (3)将步骤(2)所述的植物细胞、器官或组织与步骤(1)的所述农杆菌菌株接触，从而使编码所述蛋白的多核苷酸转入所述植物细胞、器官或组织； (4)任选地，筛选植物细胞； (5)使所述植物细胞、器官或组织生长成植株。
13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述多核苷酸转入所述植物细胞、器官或组织后，所述多核苷酸整合入所述植物细胞、器官或组织的基因组中。
14.遗传修饰的植物，其含有权利要求2或3所述的多核苷酸或权利要求4所述的载体。
15.根据权利要求14的遗传修饰的植物，其中所述植物选自由下列构成的组:双子叶植物、单子叶植物和裸子植物，更具体地，选自由下列构成的组:小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、楼桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物。
16.根据权利要求14所述的遗传修饰的植物，其中所述植物选自十字花科植物、禾本科植物和蔷薇科植物。
17.来自权利要求14-16中的任一项所述的遗传修饰的植物的种子。
18.用于鉴定植物耐旱性的分子标记，其中所述分子标记包括SEQID.Nol或2的序列的至少30个核苷酸。
19.鉴定权利要求18所述的分子标记的方法，所述方法包括下列步骤:对植物细胞的DNA测序，并鉴定SEQ ID.Nol或2的序列的所述至少30个核苷酸。
20.鉴定权利要求18所 述的分子标记的方法，所述方法包括下列步骤:扩增SEQID.N0.1或2的所述至少30个核苷酸，并检测由此获得的扩增子。
21.鉴定权利要求20所述的分子标记的方法，其中使用引物对来扩增SEQN0.1或2的所述至少30个核苷酸。
22.鉴定权利要求21所述的分子标记的方法，其中所述引物对如SEQID NO:5和6的核苷酸序列所示。
【文档编号】C07K14/415GK103732615SQ201280033798
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月7日
【发明者】阿德里亚努斯·约翰尼斯·凡·杜能 申请人:科因公司