Mir-145的锁定核酸抑制剂及其用图
【专利说明】MIR-145的锁定核酸抑制剂及其用途
[000。 交叉引用
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[0005] -般而言，本发明设及具有作为miR-145抑制剂的化学基序的寡核巧酸。在对受 试者施用时，本发明的寡核巧酸可W具有效力、投递效率、祀物特异性、稳定性、和/或毒性 的优点。寡核巧酸可W用于通过在抑制有此需要的受试者的细胞中的miR-145的表达或活 性来治疗和预防状况。提供的方法包括通过对受试者施用miR-145表达或活性抑制剂在有 此需要的受试者中治疗或预防肺动脉高血压、高血压、新血管内膜形成或再狭窄。
[000引发明背景
[0007] 微小RNA(miRNA)是一类小的，内源的且非编码的RNA，其能够通过祀向特定的信 使RNA(mRNA)并诱导其降解或翻译阻止来负调苄基因表达（Ambros，2004 ;Bartel，2009)。 新近的研究已经将mRNA降解定义为miRNA:mRNA祀物的主要机械论效应（Guo等，2010)。 几项新近的研究已经评估miRNA在血管炎症中及在血管病理学形成中的直接作用化artha andSubramanian, 2010;Urbich等，2008)。
[0008] 显示了miR-145在血管壁中丰富表达（化eng等，2009)。在人染色体S^io 等，2010)上及在小鼠染色体18上W编码miR-143和miR-145两者的长pri-miRNA转录 miR-145,运受保守的SRF结合位点调节狂in等，2009)。miR-145对血管壁的定位证明了 与外膜成纤维细胞和内皮细胞相比平滑肌层中的较高表达（化eng等，2009)。出于此原因， 认为miR-145是一种平滑肌细胞表型标志物和调控物，能够经由其祀基因KLF-5及其下游 信号传导分子屯、肌素（myocardin)调节平滑肌细胞（SMC)成熟和增殖及血管新生内膜损伤 形成（Cheng等，2009;Elia等，2009)。
[0009] 已经显示了TGF- 0超家族内的激动剂经由Smad依赖性途径激活miR-143/145簇 值aviS-DusenbeiT等，2011;Long等，2011)。此外，对miR-145、miR-143 和miR-143/145 敲 除化〇，-/-)小鼠的分析显示了大动脉和其它周围动脉的薄得显著的平滑肌层，其是由于 通过破坏肌动蛋白细丝诱导的缩小的SMC大小所致（Elia等，2009)。运导致miR-145-/-小 鼠中的中度系统性低血压和响应损伤的新血管内膜形成的缺乏狂in等，2009)。此外，从 单一和双重ko动物分离的血管平滑肌细胞（VSMC)显示了超增殖活性和较高的向血小板 衍生的生长因子（PDGF)(-种用于VSMC的已知化学引诱物）迁移的能力巧Iia等，2009 ; Xin等，2009)。此外，对miR-143 (145)ko小鼠的血管系统的药理学分析掲示了对血管压 力刺激物的减弱响应（Elia等，2009 ;Xin等，2009)。总之，运些发现显示了miR-145ko和 miR-143/145双重ko小鼠中的VSMC的去分化表型。
[0010] 还在从与对照相比在BMPR2基因中具有突变的肺动脉高血压（PAH)患者获得的肺 组织和分离的肺动脉平滑肌细胞（PASMC)中评估了miR-145的前体和成熟形式。所有PAH 形式共同的主要组织病理学特征之一是表达平滑肌特异性a-肌动蛋白（SMA)的细胞在周 围肺动脉中的积累。运包括新内膜中出现SM阳性细胞和SM阳性细胞对通常缺乏平滑肌 的毛细血管前肺细动脉的延伸（Mandegar等，2004)。造成PA的此远端部分的肌化的细胞 过程是不清楚的，但是运些观察提示了PASMC在形成PAH中的中屯、作用。
[0011] 因而，miR-145 (在血管重塑中具有作用）代表一种治疗祀物，即开发与异常平滑 肌细胞增殖（诸如在新血管内膜形成、再狭窄（restensosis)、高血压、系统性高血压和PAH 中）有关的状况的有效治疗。然而，祀向miR-145的基于反义的治疗剂的投递可W提出几 种挑战。对miR-145的结合亲和力和特异性、细胞摄取的效率、和核酸酶抗性是基于寡核巧 酸的治疗剂的投递和活性中的所有因素。例如，在将寡核巧酸导入完整细胞中时，它们通常 受到核酸酶攻击和降解，导致活性的丧失。如此，有用的反义治疗剂应当对胞外和胞内核酸 酶具有良好的抗性，W及能够穿过细胞膜。
[0012] 如此，需要用于稳定且有效的基于寡核巧酸的miR-145抑制剂的改善的化学修 饰。本发明满足此需要，并且还提供相关优点。
[001引发明概述
[0014] 本发明部分基于如下的发现：具有特定化学样式（pattern)或基序（motif)的革己 向miR-145的寡核巧酸（诸如miR-145的反义物）在对受试者施用时具有增加的效力、投 递效率、祀物特异性、稳定性、和/或改善的毒性概况（profile)。本文中提供了具有改善针 对miR-145的反义物，或miR-145的antimiR(即antimiR-145)的投递、稳定性、效力、特异 性和/或毒性概况的潜力的特定化学样式或基序。针对miR-145的反义物的化学样式或基 序可W改善antimiR-145的投递、稳定性、效力、特异性和/或毒性概况，如此在治疗背景中 有效祀向miR-145功能。如此，本发明提供了用于治疗多种与miR-145表达或活性有关的 疾病（诸如与平滑肌组织有关的疾病或状况）的新治疗剂。
[0015] 因而，本发明提供了包含与miR-145的种子区互补的序列的寡核巧酸，其中序列 包含至少3个锁定核酸（LNA)，并且寡核巧酸包含至少一个非锁定核巧酸。在一些实施方案 中，寡核巧酸的序列包含至少4、5或6个LNA。
[0016] 寡核巧酸与第二寡核巧酸相比可W具有升高的体内效力，所述第二寡核巧酸包含 相同的序列和LNA组成而不同的LNA基序。在一些实施方案中，寡核巧酸与第二寡核巧酸 相比具有升高的肺效力。
[0017] 在一些实施方案中，寡核巧酸相对于盐水对照提高细胞中的miR-145祀基因的表 达，并且表达的升高具有的P-值<0. 05。在一些实施方案中，相对于盐水对照，寡核巧酸提 高组织中的miR-145祀基因表达，并且表达升高具有的P-值<0. 05。在其它实施方案中， 相对于盐水对照，用寡核巧酸处理的细胞具有miR-145祀基因表达的大于1. 0倍数变化， 并且倍数变化具有的P-值<0. 05。在一些实施方案中，相对于盐水对照，用寡核巧酸处理 的组织具有miR-145祀基因表达的大于1. 0倍数变化，并且倍数变化具有的P-值<0. 05。 表达的倍数变化可W是至少约1. 1、约1. 2、约1. 3、约1. 4、或约1. 5倍。miR-145祀基因可 [^是Klf4、Klf5、LrrcTI、Nedd41、Igflr、Secl412、Me奸6、Fmod、Ankrdl2、Golgal、Gpbpl、 Hist3h2a、Rapgef2、或Snedl。
[0018] 寡核巧酸可W包含在5'端、3'端、或5'和3'端两者的LNA。在一些实施方案中， 寡核巧酸包含不超过3个连续的LNA。
[0019] 在一些实施方案中，寡核巧酸包含16聚体，其中16聚体由16个核巧酸组成。16 聚体可W包含与miR-145的种子区互补的序列。在一些实施方案中，16聚体包含至少9个 LNA。在一些实施方案中，16聚体从5'端至3'端具有16聚体的1、5、6、9、10、11、13、15、 和16位；1、2、6、8、10、11、13、15、和16位；1、5、6、8、10、11、13、14、和16位；1、3、4、5、6、8、 10、13、和 16 位；1、3、4、7、8、10、12、14、和16位；1、2、6、7、10、11、12、14、和16位；1、3、5、7、 9、11、13、15、和16位；1、4、5、7、9、10、12、14、和16位；或1、5、6、8、10、11、13、15、和16位处 的LNA。16聚体可W与miR-145的核巧酸序列基本上互补。在一些实施方案中，16聚体与 miR-145完全互补。
[0020] 寡核巧酸可W包含至少一个非锁定核巧酸，其是2'脱氧基、2' 0-烷基或2'面素。 在一些实施方案中，所有非锁定核巧酸是2 '脱氧基。寡核巧酸还可W包含至少一个具有2' 至4'亚甲基桥的LNA。在一些实施方案中，寡核巧酸具有5'帽结构、3'帽结构、或5'和3' 帽结构。
[0021] 寡核巧酸还可W包含一个或多个硫代憐酸醋连接。在一个实施方案中，寡核巧酸 是完全硫代憐酸醋连接的。在又一些实施方案中，寡核巧酸具有1至3个憐酸醋连接。在 一些实施方案中，寡核巧酸包含悬垂的亲脂基团。寡核巧酸的长度可W是约15至50个核 巧酸。
[0022] 本发明的另一个方面是药物组合物，其包含有效量的本文中描述的寡核巧酸或其 药学可接受盐，W及药学可接受载体或稀释剂。药学可接受载体可W包含胶体分散系统、大 分子复合物、纳米胶囊、纳米颗粒、微球、珠、水包油乳剂、胶束、混合胶束或脂质体。在一些 实施方案中，药学可接受载体或稀释剂基本上由盐水组成。
[0023] 在另一个方面，本发明提供了用于使用本文中公开的寡核巧酸的方法。在一个实 施方案中，提供了用于降低或抑制细胞中的miR-145的活性的方法，其包括使细胞与本文 中公开的寡核巧酸接触。在一些实施方案中，细胞是平滑肌细胞。在又一个实施方案中，细 胞是肺或屯、脏细胞。还提供了用于抑制平滑肌细胞增殖的方法，其包括使平滑肌细胞与本 文中公开的寡核巧酸接触。细胞可W是哺乳动物细胞。细胞可W是体内或离体的。
[0024] 本发明还提供了用于预防或治疗受试者中的肺动脉高血压（PAH)的方法，其包括 对受试者施用包含本文中公开的寡核巧酸的药物组合物。PAH可W是特发性肺动脉高血压 (PAH)、遗传性或家族性PAH、或继发性肺高血压。继发性肺高血压可W来自肺栓子、肺气肿、 肺纤维化、或先天性屯、脏病。受试者可W具有编码骨形态发生蛋白2型受体的基因中的突 变。在一些实施方案中，受试者诊断有或有风险形成肺高血压或肺动脉高血压（PAH)。受试 者可W是哺乳动物，诸如人。
[00巧]本发明还提供了用于抑制或治疗受试者中的再狭窄或新血管内膜形成的方法，其 包括对受试者施用包含本文中公开的寡核巧酸的药物组合物。本文中还提供了用于治疗或 预防受试者中的高血压的方法，其包括对所述受试者施用包含本文中公开的寡核巧酸的药 物组合物。在一些实施方案中，高血压是系统性高血压。受试者可W是哺乳动物，诸如人。
[0026] 可W经由各种路径（包括皮下、静脉内、动脉内、鼻、口服或经由肺路径（例如经由 通过鼻或口的吸入））对受试者施用药物组合物。在一些实施方案中，通过胃肠外施用或者 通过对屯、脏组织直接注射施用药物组合物，诸如用于抑制、预防或治疗新血管内膜形成或 再狭窄。在其它实施方案中，通过胃肠外施用或者通过对肺组织直接注射施用药物组合物， 诸如用于治疗或预防PAH。在一个实施方案中，通过经由肺投递装置的吸入路径施用药物组 合物。在此类实施方案中，药物组合物配制为干粉末或液体气溶胶。在一些实施方案中，通 过胃肠外施用来施用药物组合物W治疗或预防高血压。
[0027] 本发明的另一个方面是试剂盒，其包含如本文中描述的寡核巧酸和施用装置。在 一个实施方案中，试剂盒用于治疗或预防肺动脉高血压。施用装置可W设计用于肺投递，诸 如吸入器、喷雾器、吹入器、点滴器、和气雾器。在其它实施方案中，施用装置可W设计用于 静脉内或动脉内投递，诸如导管。任选地，可W配制药物组合物W在施用装置中胆存。试剂 盒可W进一步包含用于对受试者（例如人）施用药物组合物，诸如W治疗或预防PAH，抑制 或治疗再狭窄或新血管内膜形成，或治疗或预防高血压的用法说明。
[0028] 附图简述
[0029] 图1:给49至52天龄的Sprague-Dawley大鼠注射25mg/kg皮下剂量的来自表1 的antimiR-145化合物。在注射后48小时收集组织。通过总的肺RNA中的实时PCR测量 (A)Klf4、度)Kl巧、（C)Lrrc71、值)Nedd41、巧）1奸Ir、（巧Secl412、（G)Megf6、化)Fmod、（I) Ankrdl2、（J)Golgal、（K)Gpbpl、(X)His1:3h2a、（M)Rapgef2、和（N)Snedl的指定mRNA水平。 结果W相对于经盐水处理的动物的倍数变化值显示。
[0030] 图2 :雷达图（Radarplot)，代表9种miR-145基因祀物及其相对于盐水的去阻抑 (der巧ression)倍数变化。M-11318显示了显示的所有9种基因的最大面积，该面积代表 积累倍数变化值。M-11319是第二大的面积。W黑线显示的对照寡核巧酸M-10591与活性 化合物相比具有更小的祀物去阻抑活性。
[0031] 图3 :用微阵列序型分析（profiling)对经M-11318处理的肺总RNA和经盐水处 理的肺总RNA进行全基因组序型分析。在比较经M-11318处理的肺总RNA与经盐水处理的 总RNA时，含有miR-145种子的基因在上调基因标签（genesignature)中富集（对于差异 表达，P-值<0.01)。使用超几何分布函数计算富集的P-值。此结果指示M-11318引发对 miR-145特异性的基因祀物去阻抑。
[00扣]图4:给49至52天龄的Sprague-Dawley大鼠注射5、10、或25mg/kg皮下剂量的M-11318。在注射后48小时收集组织。通过在总肺RNA中的实时PCR测量指定的mRNA。结 果W相对于经盐水处理的动物的倍数变化值显示。实时PCR结果提示了KLF5祀物去阻抑 对M-11318处理是剂量响应的。
[003引图5 :给49至52天龄的Sprague-Dawley大鼠注射5、10、或25mg/kg皮下剂量的M-11318或M-11319。在注射后48小时收集组织。通过在