总肺RNA中的实时PCR测量指定 的mRNA。结果W相对于经盐水处理的动物的倍数变化值显示。实时PCR结果提示了化CkMl 祀物去阻抑对M-11318和M-11319处理是剂量响应的。
[0034] 图6 : (A)将16周龄时的自发性高血压（SHR)大鼠经受每周四次25mg/kg皮下剂 量的antimiR。在18周时，在饮用水中施用L-NG-硝基精氨酸甲醋化-NAME) (50mg/L)，任 意给予2周W在脉搏波速度（PWV)测量中创建治疗窗（therapeuticwindow)。在研究结 束时，此时大鼠为20周龄，测量末端脉搏波速度、beta指数、和血压。研究中包括培噪普利 (Perindopril)( 一种ACE抑制剂）作为一种用于高血压的护理标准的基准化enchmark)。antimiR-145(M-10934)显示了脉搏波速度度）、beta指数（C)、和均值系统压力值）的统计 学显著降低。重要地，两种其它对照antimiR(对照1和对照2)用此剂量和方案没有显示相 似的益处，由此显示此治疗效果的microRNA特异性。度-D)。运些结果共同证明了miR-145 抑制在高血压的大鼠SHR/L-NAME中具有治疗益处。antimiR-145降低系统性血压和动脉硬 化的指数。
[00对发明详述
[0036] 本发明部分基于如下的发现：祀向miR-145的寡核巧酸的特定化学样式或基序在 对受试者施用时可W改善寡核巧酸的效力、投递效率、祀物特异性、稳定性、和/或毒性。在 一些实施方案中，寡核巧酸能够W特异性方式抑制miR-145的表达或丰度。具有特定化学 样式或基序的寡核巧酸包含与miR-145互补（诸如与miR-145的种子区互补）的序列。寡 核巧酸可W是miR-145抑制剂，或antimiR-145。
[0037]miR-145在鼠染色体18和人染色体5上的基因间区中与miR-143 -起定位成簇。 miR-145和miR-143 (它们彼此没有同源性）W单一转录物共转录。miR-145的pre-miRNA 序列被加工成成熟序列和星号（star)(即次要）序列。星号序列是从茎环结构的另一条臂 加工的。下文给出了小鼠和人miR-145的pre-miRNA(例如茎-环结构）、成熟、和星号序 列：
[0038]人成熟miR-145 (沈QIDNO: 1)
[0039] 5' -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3,
[0040]人miR-145*(SEQIDNO:2)
[00川 5' -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU-3,
[0042]人pre-miR-145(沈QIDN0:3)
[004引 5 '-CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAA UACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU-3,小鼠成熟miR-145(沈QIDN0:4)
[0044] 5, -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3,
[0045]小鼠miR-145*(SEQIDNO:5)
[004引 5' -AUUCCUGGAAAUACUGUUCUUG-3,
[0047]小鼠pre-miR-145(沈QIDN0:6)
[004引 5'-CUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUGGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU UGAG-3,
[0049] 上述序列可W是核糖核酸序列或脱氧核糖序列或两种的组合（即包含核糖核巧 酸和脱氧核糖核巧酸两者的核酸）。应当理解，包含本文中描述的任何一种序列的核酸会 具有替换尿巧碱基的胸巧碱基（对于DNA序列）和替换胸巧碱基的尿巧碱基（对于RNA序 列）。
[0050] 包含与miR-145互补的序列且具有特定化学修饰或基线的寡核巧酸与具有相同 核巧酸序列但不同化学样式或基序的寡核巧酸相比可W具有升高的体内效力。例如，第一 和第二寡核巧酸各具有祀向miR-145的相同核巧酸序列，包括与miR-145的种子区互补的 序列。第一寡核巧酸具有与第二寡核巧酸不同的化学基序或样式。第一和第二寡核巧酸两 者能够降低miR-145的表达或丰度。然而，具有第一化学基序的第一寡核巧酸与具有不同 化学基序的第二寡核巧酸具有更高的体内效力，如通过miR-145祀物的去阻抑量测量的。miR-145 祀物可W是Klf4、Klf5、Lrrc71、Nedd41、Igflr、Secl412、Me奸6、Fmod、Ankrdl2、 Golgal、Gpbpl、Hist；3h2a、Rapgef2、或Snedl。
[0051] 在一些实施方案中，相对于盐水对照，寡核巧酸提高细胞或组织中的miR-145祀 基因的表达，并且表达升高具有的P-值<0. 05。在一些实施方案中，表达升高具有的P-值 <0. 01。在其它实施方案中，相对于盐水对照，用寡核巧酸处理的细胞或组织具有miR-145 祀基因的表达的大于1. 0倍变化，并且倍数变化具有的P-值<0. 05。在一些实施方案中，倍 数变化具有的P-值<0. 01。表达的倍数变化可W是至少约1. 1、约1. 2、约1. 3、约1. 4、或约 1. 5 倍。miR-145 祀基因可W是Klf4、Kl巧、1^祥。71、化(1(141、1邑'山、56。1412、]\16奸6、尸111〇(1、 Ankrdl2、Golgal、Gpbpl、Hist：3h2a、Rapgef2、或Snedl。
[0052] 可W在体外和/或体内测定寡核巧酸在降低miR-145的表达或丰度中的活性。例 如，在体外测定对miR-145活性的抑制时，可W使用双重蛋光素酶测定法测定活性。双重 蛋光素酶测定法（如W商品化产品PsiCHECK?(Promega)例示）牵设可检测蛋白质（例如 花虫蛋光素酶）的基因的3'UTR中放置miR识别位点。与miR-145共表达构建体，使得可 W通过信号变化测定抑制剂活性。可W在同一质粒上包含编码可检测蛋白质（例如蛋火虫 蛋光素酶）的第二种基因，并且测定信号比率作为候选寡核巧酸的antimiR-145活性的指 示。寡核巧酸在约50nM或更小，或在其它实施方案中，约40nM或更小、约20nM或更小、或 约IOnM或更小的浓度时显著抑制此类活性，如在双重蛋光素酶测定法中测定的。例如，寡 核巧酸可W具有约50nM或更小、约40nM或更小、约30nM或更小、或约20nM或更小的抑制 miR-145活性的IC50,如在双重蛋光素酶测定法中测定的。
[005引或者/另外，可W在合适的小鼠或大鼠模型中测定寡核巧酸在降低miR-145的表 达或丰度中的活性，其中isobserved在寡核巧酸剂量，诸如约SOmg/kg或更小，约25mg/ kg或更小，约lOmg/kg或更小或约5mg/kg或更小的剂量时观察到对miR-145表达的抑制 (例如达至少约50% )。在一些实施方案中，在动物模型中测定寡核巧酸的活性，诸如记载 于WO2008/016924,其描述在此通过提及收录。例如，寡核巧酸可W展现出对miR-145的至 少50 %抑制，诸如在约SOmg/kg或更小，约25mg/kg或更小，约lOmg/kg或更小或约5mg/kg 或更小的剂量。在此类实施方案中，可W对小鼠静脉内或皮下给药寡核巧酸，并且可W在盐 水中配制寡核巧酸。
[0054] 也可W在合适的小鼠或大鼠模型中测定寡核巧酸的体内效力。寡核巧酸可W展现 出至少约50%miR-145祀物去阻抑，诸如在50mg/kg或更小，25mg/kg或更小，lOmg/kg或 更小或5mg/kg或更小的剂量。在一些实施方案中，也可W在合适的小鼠或大鼠模型中测定 相对于盐水对照的细胞或组织中miR-145祀基因的升高的表达或倍数变化。寡核巧酸可 W展现出miR-145祀物表达的至少约1. 1、约1. 2、约1. 3、约1. 4、或约1. 5倍增加，诸如在 SOmg/kg或更小，25mg/kg或更小，lOmg/kg或更小或5mg/kg或更小的剂量。细胞或组织中 的miR-145祀物的表达增加或倍数变化的P-值可W是<0. 05或<0. 01。miR-145祀物可 W是Klf4、Klf5、Lrrc71、Nedd41、Igflr、Secl412、Me奸6、Fmod、Ankrdl2、GolgaUGpbpU Hist3h2a、Rapgef2、或Snedl。
[0055] 在此类实施方案中，可W对小鼠静脉内或皮下给药寡核巧酸，并且可W在盐水中 配制寡核巧酸。具有特定LNA/DNA样式的寡核巧酸与具有相同核巧酸序列但不同LNA/DNA 样式的寡核巧酸相比在特定组织（诸如肺）中可W具有升高的体内效力。在一些实施方案 中，相对于盐水对照，具有特定LNA/DNA样式的寡核巧酸提高细胞或组织中的miR-145祀基 因的表达。在又一些实施方案中，相对于用盐水对照处理的细胞，用具有特定LNA/DNA样式 的寡核巧酸处理的细胞具有miR-145祀基因表达的大于1.O倍变化。
[0056] 在运些或其它实施方案中，本发明的寡核巧酸在施用后可W是稳定的，在施用后 在循环和/或祀器官中可检出至少3周、至少4周、至少5周、或至少6周或更多。如此，本 发明的寡核巧酸可W提供不太频繁的施用、较低的剂量、和/或治疗效果的较长持续时间。
[0057] -般地，寡核巧酸的长度及锁定核巧酸的数目和位置使得寡核巧酸降低miR-145 表达或丰度。在一些实施方案中，寡核巧酸的长度及锁定核巧酸的数目和位置使得寡核巧 酸在体外蛋光素酶测定法中在约50nM或更小的寡核巧酸浓度，或者在合适的小鼠或大鼠 模型（各如描述）中在约50mg/kg或更小，或约25mg/kg或更小的剂量降低miR-145表达 或丰度。在一些实施方案中，寡核巧酸的长度及锁定核巧酸的数目和位置使得寡核巧酸在 合适的小鼠或大鼠模型（诸如本文中描述）中在约50mg/kg或更小，或约25mg/kg或更小 的剂量时降低miR-145活性，如通过祀物去阻抑测定的。
[0058] 本发明的寡核巧酸含有一个或多个锁定核酸（LNA)残基，或"锁定核巧酸"。例 如LNA记载于美国专利No. 6, 268, 490、6, 316, 198、6, 403, 566、6, 770, 748、6, 998, 484、 6, 670, 461、和7, 034, 133,在此通过提及将它们全部完整收录。LNA是经修饰的核巧酸或核 糖核巧酸，其在核糖糖模块的2'和4'碳之间含有的额外桥，从而产生"锁定"构象，和/或 双环结构。在一个实施方案中，寡核巧酸含有一个或多个具有W下述结构A显示的结构的 LNA。或者或另外，寡核巧酸可化含有一个或多个具有W下述结构B显示的结构的LNA。或 者或另外，寡核巧酸含有一个或多个具有W下述结构C显示的结构的LNA。
[0060] 可W在本发明寡核巧酸中渗入的其它合适的锁定核巧酸包括那些记载于美国专 利No. 6, 403, 566和6, 833, 361 (在此通过提及将它们两者完整收录）的。
[0061] 在例示性的实施方案中，例如锁定核巧酸具有2'至4'的亚甲基桥，如结构A中所 示。在其它实施方式中，桥包含亚甲基或乙締基基团，其可W是取代的，并且其可W或不可W具有位于2'位的酸连接。
[0062] 寡核巧酸可W包含、组成基本上为（consistessentiallyof)、或组成为：针对 miR-145的反义序列。在一个实施方案中，寡核巧酸包含针对miR-145的反义序列。例如， 寡核巧酸可W包含与成熟miR-145序列至少部分互补，例如与人成熟miR-145序列至少约 75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、或约99%互补的序列。 在一个实施方案中，反义寡核巧酸包含与成熟miR-145序列100 %互补的序列。
[0063] 在某些实施方案中，寡核巧酸包含与miR-145的核巧酸序列完全互补的核巧酸序 列。在具体的实施方案中，寡核巧酸包含，组成基本上为，或组成为与miR-145互补的核巧 酸序列。在此背景中，"组成基本上为"包括在5'和3'端的任一或两者上的核巧酸（例如 一个或两个）的任选添加，只要额外的核巧酸在双重蛋光素酶测定法或小鼠模型中基本上 不影响（如通过不超过约20 %的IC50增加限定）寡核巧酸对祀miRNA活性的抑制。
[0064] 寡核巧酸可W包含，组成基本上为，或组成为包含与miR-145种子区互补的序列 的针对miR-145的反义序列。种子区是跨越碱基2-8的miRNA的5'部分，即对于人成熟 miR-145 为 5'-UCCAGUUU-3'（沈QIDN0:7)。与miR-145 种子区互补的序列可W与miR-145 种子区基本上或完全互补，其中基本上互补的序列可W具有1至4个错配（例如1或2个 错配）。
[0065] 寡核巧酸一般具有设计为祀向成熟miR-145的核巧酸序列。在运些或其它实施方 案中，寡核巧酸还或备选可W设计为祀向miR-145的pre-miRNA或pri-miRNA形式。在某 些实施方案中，寡核巧酸可W设计为具有相对于完全互补的（成熟的）miR-145序列含有1 至5个（例如1、2、3、或4个）错配的序列。在某些实施方案中，例如，此类反义序列可朗# 入含有茎和环部分的ShRNA或其它RNA结构中。
[0066] 寡核巧酸的长度可W是约8至约20个核巧酸，长度约15至约50个核巧酸，长度 约18至约50个核巧酸，长度约10至约18个核巧酸，或长度约11至约16个核巧酸。在一 些实施方案中的寡核巧酸的长度是约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、 约17、或约18个核巧酸。在一些实施方案中，寡核巧酸的长度是至少约16个核巧酸。
[0067] 一般地，LNA的数目和位置使得寡核巧酸降低miR-145活性。在一个实施方案中， LNA的位置和数目使得寡核巧酸与具有不同LNA数目和/或位置的寡核巧酸相比具有升高 的体内效力。在一些实施方案中，LNA的数目和位置使得寡核巧酸相对于盐水对照提高细 胞或组织中的miR-145祀基因的表达。在又一些实施方案中，LNA的数目和位置使得用寡 核巧酸处理的细胞相对于用盐水对照处理的细胞具有miR-145祀基因表达的大于1. 0倍变 化。
[006引在某些实施方案中，寡核巧酸不含具有超过4个、或超过3个连续LNA的核巧酸区 段。例如，寡核巧酸包含不超过3个连续的LN